李艷梅 李 偉 王海芹

1.河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院腔鏡中心，河北唐山 063000；2.河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，河北唐山 063000

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球癌癥死亡的第四大原因，2020 年我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率分別為47.9 萬(wàn)、37.4 萬(wàn)[1-3]。非編碼RNA 是一類(lèi)不能反映為蛋白質(zhì)的RNA，可作為促癌基因或抑癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）尿路上皮癌相關(guān)基因1（urothelial cancer associated 1，UCA1）與微小RNA（micro RNA，miR）-590-3p 是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，研究報(bào)道lncRNA UCA1 在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)[5-6]，miR-590-3p在宮頸鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，均與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有關(guān)[7-9]。本研究分析胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)及與病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床評(píng)估患者病情進(jìn)展和預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2018 年7 月河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院收治的107 例胃癌患者，收集術(shù)中切除部分癌組織和距離＞5 cm 的癌旁組織，液氮冷凍至檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③可接受隨訪(fǎng)；④病理參數(shù)和隨訪(fǎng)資料完整；⑤患者及家屬均知情本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②年齡＜18 歲；③合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾??；④全身感染性疾病?；颊叱鲈汉笸ㄟ^(guò)門(mén)診或電話(huà)方式隨訪(fǎng)3 年，隨訪(fǎng)至2021 年7 月，統(tǒng)計(jì)術(shù)后3 年累積生存率，隨訪(fǎng)期間死亡或隨訪(fǎng)截止則研究結(jié)束。本研究經(jīng)河北省唐山市醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

取50 mg 組織液氮中研磨，TRIzol 試劑盒（廠(chǎng)家：上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號(hào)：15589226）提取組織中總RNA，Narodrop 驗(yàn)證cDNA 濃度及純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Takara 試劑盒（廠(chǎng)家：武漢科昊佳生物科技有限公司，批號(hào)：DRR420A）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒（廠(chǎng)家：北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：639505）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。lncRNA UCA1 正向引物序列5’-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3’，反向引物序列5’-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3’，長(zhǎng)度22 bp；miR-590-3p 正向引物序列5’-GCGCTAATTTTATGTATAA-3’，反向引物序列5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，長(zhǎng)度18 bp；lncRNA UCA1 內(nèi)參β-actin 正向引物序列5’-GACCTCTATGCCAACACAGT-3’，反向引物序列5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’；miR-590-3p 內(nèi)參U6 正向引物序列5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，反向引物序列5’-CA -TCTTCAAAGCACTTCCCT-3’。10.0 μl 反應(yīng)體系：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq；0.2 μl 上游引物；0.2 μl 下游引物；0.2 μl ROX 參考染料；1.0 μl cDNA 模板；3.4 μl 經(jīng)DEPC 處理水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s 循環(huán)1 次，再95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s 循環(huán)40 次，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中l(wèi)ncRNA UCA1 和miR-590-3p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；Pearson 相關(guān)性分析明確相關(guān)性；采用K-M 法繪制生存曲線(xiàn)，組間生存率采用log-rank 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)比較及相關(guān)性

胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1 表達(dá)高于癌旁組織，miR-590-3p 表達(dá)低于癌旁組織（P ＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。Pearson 相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1 與miR-590-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.720，P ＜0.001）。

表1 胃癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)比較（）

表1 胃癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)比較（）

注 lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；UCA1：尿路上皮癌相關(guān)基因1；miR：微小RNA

圖1 胃癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p 電泳圖

2.2 lncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)與胃癌患者病理參數(shù)的關(guān)系

不同臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者lncRNA UCA1 和miR-590-3p 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 lncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)與胃癌患者病理參數(shù)的關(guān)系（）

表2 lncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)與胃癌患者病理參數(shù)的關(guān)系（）

注 lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；UCA1：尿路上皮癌相關(guān)基因1；miR：微小RNA

2.3 lncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系

隨訪(fǎng)3 年，107 例胃癌患者累積生存率為63.55%（68/107），以胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-590-3p表達(dá)均值為基準(zhǔn)將患者分為高低表達(dá)組。高lncRNA UCA1 表達(dá)組（≥1.042，n=53）累積生存率為52.83%（28/53），低lncRNA UCA1 表達(dá)組（＜1.042，n=54）累積生存率為74.07%（40/54），高miR-590-3p 表達(dá)組（≥0.974，n=52）累積生存率為76.92%（40/52），低miR-590-3p 表達(dá)組（＜0.974，n=55）累積生存率為50.91%（28/55）。K-M 生存曲線(xiàn)顯示，高lncRNA UCA1 表達(dá)組累積生存率低于低lncRNA UCA1 表達(dá)組，高miR-590-3p 表達(dá)組累積生存率高于低miR-590-3p 表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank χ2=8.140、11.624，P=0.004、0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同lncRNA UCA1、miR-590-3p 表達(dá)胃癌患者K-M 生存曲線(xiàn)

3 討論

胃癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)生是從胃黏膜至慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生、癌變的連續(xù)過(guò)程，早期常無(wú)癥狀，大多患者確診時(shí)已達(dá)中晚期，由于惡性程度較高，轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[10-11]。lncRNA UCA1 定位于人染色體19p13.12，最初于膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究表明，lncRNA UCA1 參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[12-14]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1 表達(dá)上調(diào)，并與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA UCA1在胃癌中也可能作為一種促癌基因參與胃癌發(fā)生，其機(jī)制可能與lncRNA UCA1 促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮來(lái)源惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，鋅指E 盒結(jié)合同源框1（Zinc E-box-binding homobox 1，ZEB1）能通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。ZEB1 為miR-204 下游靶基因，miR-204可負(fù)向調(diào)控ZEB1 表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。鐘定福等[17]研究顯示，lncRNA UCA1 能通過(guò)抑制miR-204 上調(diào)ZEB1 表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高lncRNA UCA1 表達(dá)組術(shù)后3 年累積生存率明顯降低，提示lncRNA UCA1可能成為胃癌患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

miR-590-3p 定位于人染色體7q11.23，已有研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，如miR-590-3p 在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)[18-20]，但其在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)[21]。本研究顯示，胃癌組織中miR-590-3p 表達(dá)下調(diào)，并與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-590-3p 在胃癌中也可能作為一種抑癌基因參與胃癌發(fā)生，其低表達(dá)與胃癌惡性進(jìn)展有關(guān)，與劉明輝等[22]報(bào)道一致。其機(jī)制可能與miR-590-3p 能負(fù)向調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein 1，CREB1）有關(guān)。CREB1 是新近發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，能異常啟動(dòng)腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)調(diào)節(jié)具有細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期、抗凋亡、血管新生等功能的靶基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，參與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進(jìn)展[23]。Gu 等[24]研究顯示，miR-590-3p 能靶向抑制CREB1 表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、集落形成能力和侵襲。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高miR-590-3p 表達(dá)組術(shù)后3 年累積生存率明顯升高，提示miR-590-3p 亦可成為胃癌患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。lncRNA 對(duì)miRNA 具有海綿吸附作用，可吸附特定miRNA，干擾miRNA 對(duì)下游靶基因的調(diào)控[25]。本研究顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1 與miR-590-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同影響患者預(yù)后，考慮與miR-590-3p 為lncRNA UCA1 調(diào)控靶點(diǎn)有關(guān)。Gu 等[24]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因、放射免疫沉淀試驗(yàn)技術(shù)、RNA 下拉試驗(yàn)證實(shí)miR-590-3p 為lncRNA UCA1靶標(biāo)，lncRNA UCA1 能負(fù)調(diào)控miR-590-3p 上調(diào)CREB1 表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，胃癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1 高表達(dá)，miR-590-3p 低表達(dá)，與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，可能作為預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但本研究樣本量較少，隨訪(fǎng)時(shí)間較短，且關(guān)于兩指標(biāo)參與胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。