祖蓓蓓 馬倩倩 饒?jiān)伱?李美榮 劉 琳 張 麗

1.江蘇省徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221009；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇徐州 221009；3.江蘇省徐州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇徐州 221009

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性多系統(tǒng)受累的自身免疫疾病，臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性、復(fù)雜性。發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要與免疫功能異常有關(guān)[1-2]。其中趨化因子可通過對(duì)免疫細(xì)胞調(diào)控，參與自身免疫病的發(fā)病[2-3]。

CXC 型趨化因子受體（CXC chemokine receptor，CXCR）7 屬于7 次跨膜G 蛋白偶聯(lián)受體超家族中一員，其與CXC 型趨化因子配體（CXC-type chemokine ligand，CXCL）12、CXCL11 雙配體結(jié)合，發(fā)揮對(duì)免疫細(xì)胞遷移、促進(jìn)炎癥、增強(qiáng)血管生成和白細(xì)胞外滲等免疫調(diào)節(jié)作用[4-7]。近年來有研究報(bào)道CXCL11、CXCR7 在骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病、皮肌炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬皮病、自身免疫性甲狀腺炎、炎癥腸病等免疫相關(guān)疾病中高表達(dá)[6-12]趨化因子CXCL11、CXCL12及其受體CXCR7 在狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）患者中表達(dá)情況，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的研究結(jié)論。本研究擬通過檢測(cè)LN 患者及健康者外周血中CXCL11、CXCL12、CXCR7 表達(dá)水平，探討CXCR7/CXCL11/CXCL12 生物軸在LN 發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得江蘇省徐州市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及入組受試者簽署知情同意書。依據(jù)SLE 分類標(biāo)準(zhǔn)（美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂）[13-14]，入組40 例我院風(fēng)濕免疫科2018 年10 月至2020 年10 月就診SLE 患者，再根據(jù)LN 必須滿足尿蛋白>0.5 g/24 h或紅細(xì)胞管型尿>5 個(gè)/幽門螺旋桿菌的要求[13-14]，將入組的SLE 患者分為LN 組24 例，平均年齡（36.8±12.6）歲；男2 例，女22 例。無腎損害SLE 患者組（非LN 組）16 例，平均年齡（37.4±11.3）歲；男1 例，女15 例。對(duì)照組：20 名健康對(duì)照組為我院健康體檢者，平均年齡（37.2±11.8）歲；男2 例，女18 例。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

各組外周血中CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 表達(dá)，及SLE患者24 h 尿蛋白定量、ANA、ANA 譜、免疫球蛋白、補(bǔ)體、紅細(xì)胞沉降率臨床指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 分別采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血共8 ml，分2 管（4 ml/管）。其中1 管（肝素抗凝管）4 ml 血標(biāo)本行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，另一管（分離膠促凝管）4 ml 血標(biāo)本離心，離心半徑10 cm，3000 r/min，離心10 min，收集血清，-80℃凍存，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 依次取熒光抗體CD3FITC 10 μl+CD19PE 10 μl+IgG2αAPC 10 μl+抗凝全血50 μl 加入1 支流式管中，取熒光抗體CD3FITC 10 μl+CD19PE 10 μl+CXCR7APC 10 μl+抗凝全血50 μl 熒光抗體加入第2 支流式管中（美國BD 公司，批號(hào)：9151960、7299982、8339984、9229185，F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀），混勻、室溫避光孵育、溶血、孵育10 min、離心半徑10 cm，1000 r/min 離心5 min，離心去上清液、1 ml PBS 離心洗滌2 次，去上清液、500 μl PBS 混勻、3 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)、軟件獲取數(shù)據(jù)及分析。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，將檢測(cè)待測(cè)樣本、標(biāo)本品儲(chǔ)存液稀釋備用，分別加入檢測(cè)孔、孵育、洗滌、吸干、加入樣本結(jié)合物、孵育、洗滌、吸干、加底物溶液、反應(yīng)、加入反應(yīng)終止液、靜置30 min 后測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本中CXCL11、CXCL12 的濃度（美國R&D System 公司，貨號(hào)：DCX110/891030、DSA00/890813）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位）[M（P25，P75）]表示，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。相關(guān)分析數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布資料，采用Spearman 相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血中CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 表達(dá)情況

三組CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其中LN 組CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 表達(dá)水平均高于非LN 組、健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。非LN 組CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組外周血中CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞、CXCL11、CXCL12 比較

2.2 狼瘡腎炎患者外周血中CXCL11、CXCL12、CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞與24 h 尿蛋白定量的相關(guān)性分析

狼瘡腎炎患者外周血中CXCL11、CXCL12、CD3+CXCR7+T 淋巴細(xì)胞、CD19+CXCR7+B 淋巴細(xì)胞表達(dá)水平與24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.860、0.853、0.740、0.816，P ＜0.001）。

3 討論

SLE 是一種慢性、多系統(tǒng)多臟器受累的自身免疫疾病[1]，臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性、復(fù)雜性和多樣性。發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要的免疫異常表現(xiàn)為先天和適應(yīng)性免疫異常、免疫細(xì)胞異?；罨蚬δ墚惓＃瑢?dǎo)致異?？贵w、細(xì)胞因子、趨化因子生成，進(jìn)一步引起組織臟器損傷[1-2]。

趨化因子是一組小分子量（7～12 kD）蛋白家族，是細(xì)胞因子家族中唯一作用于G 蛋白偶聯(lián)受體的超家族的成員，趨化因子可以通過對(duì)免疫細(xì)胞時(shí)間和空間定位調(diào)控，發(fā)揮對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育、免疫監(jiān)視、免疫啟動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。即可通過受體誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的游走和活化，保護(hù)機(jī)體防御外來致病物，同時(shí)趨化因子可在特定的環(huán)境中異常表達(dá)，過度活化免疫細(xì)胞進(jìn)而攻擊正常組織，導(dǎo)致自身免疫性疾病，故趨化因子和自身免疫性疾病密切相關(guān)[14-17]。

根據(jù)趨化因子N 端保守的半胱氨酸基序，趨化因子可分為4 個(gè)亞家族（XC、CC、CXC 和CX3C），相應(yīng)結(jié)合受體分別命名（XCR、CCR、CXCR 和CX3CR）[16]。典型的跨膜趨化因子受體與配體結(jié)合，通過G 蛋白依賴途徑向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，發(fā)揮趨化效應(yīng)[16]。除了18 個(gè)典型的趨化因子受體外，趨化因子受體家族還包括4 種非典型趨化因子受體（Atypical chemokine receptor，ACKR），即ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACKR4[18-20]。其中ACKR3 又命名為CXCR7，與CXCL11 和CXCL12雙配體結(jié)合，通過非G 蛋白依賴性信號(hào)的β-arrestin通路途徑，不具有經(jīng)典的趨化性，但能調(diào)節(jié)趨化因子的趨化性、可用性和效應(yīng)性，故又稱為清道夫受體或誘騙受體[20-21]。

趨化因子CXCL12 是表達(dá)最廣泛的趨化因子，其主要由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞表面及樹突細(xì)胞表達(dá)[22]。CXCL11 為γ 干擾素誘導(dǎo)，白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞系產(chǎn)生[23]。CXCL11、CXCL12 共受體為CXCR7，其中CXCL11 依賴于CXCR7 的N 端和一些細(xì)胞外環(huán)位置進(jìn)行初級(jí)結(jié)合，細(xì)胞外環(huán)殘基介導(dǎo)次級(jí)結(jié)合和β-arrestin招募。而CXCL12 與CXCR7 結(jié)合需要關(guān)鍵殘基Asp-1794.60 和Asp-2756.58，沒有明顯的N 端殘基參與，提示CXCL11 與CXCR7 結(jié)合、CXCL12 與CXCR7 結(jié)合模式不同，其趨化效應(yīng)、免疫學(xué)效應(yīng)也有所不同[24-25]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，趨化因子CXCL11 在皮肌炎患者肌肉中的表達(dá)增加[6]。CXCL11 在正常的唾液腺中幾乎不存在，在干燥綜合征的唾液腺病變中高表達(dá)CXCL11mRNA，提示CXCL11 參與干燥綜合征的唾液腺免疫損傷病理過程[11]。CXCL11 參與系統(tǒng)性硬化癥毛細(xì)血管病變，并與系統(tǒng)性硬化癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，CXCR7 在滑膜內(nèi)皮細(xì)胞和未受刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，CXCL12 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)升高，血管生成和促炎因子增強(qiáng)[10]。另外，CXCL11 在骨關(guān)節(jié)炎滑膜中上調(diào)，通過激活破骨細(xì)胞與脾細(xì)胞的分化，發(fā)揮促炎作用[12]。本課題組前期研究結(jié)果提示CXCL12 與其另一受體CXCR4 在SLE、LN 患者外周血T 細(xì)胞上高表達(dá)，且CXCL12、CXCR4 與SLE 疾病活動(dòng)評(píng)分和腎損害、血液系統(tǒng)損害正相關(guān)[26-27]。

本研究結(jié)果顯示，LN、非LN 的SLE 患者外周血中T、B 細(xì)胞表面CXCR7 和血清中CXCL11、CXCL12表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。上述指標(biāo)表達(dá)，LN 患者高于非腎損害SLE 患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），LN 組患者外周血中CXCR7、CXCL11、CXCL12 表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)，提示CXCR7、CXCL11、CXCL12在LN 患者體內(nèi)有意義的高表達(dá)，與腎損害嚴(yán)重程度相關(guān)，CXCR7/CXCL11/CXCL12 生物軸參與LN 發(fā)生發(fā)展過程。筆者推測(cè)LN 患者體內(nèi)高表達(dá)的CXCL11、CXCL12，可與T、B 細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR7 結(jié)合，通過β-arrestin 途徑，發(fā)揮趨化因子清除、內(nèi)化、降解、胞吞及自我雙向表達(dá)調(diào)控，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性B 細(xì)胞、T 細(xì)胞分化和活化，促進(jìn)免疫復(fù)合物沉積在腎臟，促進(jìn)補(bǔ)體活化和腎臟組織損傷[23-25]。

總結(jié)，本研究提示趨化因子CXCR7、CXCL11、CXCL12 高表達(dá)與SLE 合并腎臟損害有關(guān)聯(lián)，CXCR7/CXCL11/CXCL12 生物軸可能是LN 發(fā)病過程中一種重要的免疫介質(zhì)，CXCR7/CXCL11/CXCL12 生物軸可能成為LN 治療的新靶點(diǎn)或有針對(duì)性地進(jìn)行藥物干預(yù)的關(guān)鍵因子，這也為LN 的臨床治療開辟了新的思路和視野。CXCR7/CXCL11/CXCL12 生物軸與LN 患者腎臟組織結(jié)構(gòu)中的病理特點(diǎn)相關(guān)性如何？以及其參與腎損害的下游信號(hào)機(jī)制為何？本課題組將進(jìn)一步探討和研究。