朱金成，劉戈輝，張鵬飛，郭文婷，張 薇

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，中國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。棉花枯萎病是棉花的重要病害之一，由于常年連作，病害逐年加重，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，培育抗枯萎病的棉花新品種是解決這個(gè)問題的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育棉花抗病品種提供了新的途徑[1]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子[2]。Guo等[3]從海島棉‘7124’克隆得到一個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子GbERF1-like，可以通過激活木質(zhì)素合成提高對(duì)黃萎病菌的抗性。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達(dá)GbERFb可以提高煙草對(duì)大麗輪枝菌的抵抗力。在擬南芥中，過量表達(dá)B3亞組的AtERF14能增強(qiáng)防衛(wèi)基因的表達(dá)，并能調(diào)控ERF1、ERF2等其他抗病相關(guān)ERF基因的表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)erf14突變體對(duì)枯萎病菌更加感病，且AtERF14的功能缺失不能被其他ERF互補(bǔ)；表明AtERF14在枯萎病抗性中表現(xiàn)出很重要的作用[5]。過量表達(dá)GbERF1可以提高棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性，而下調(diào)GbERF1基因則增加棉花對(duì)大麗輪枝菌的敏感性[6]。此外，ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起到了重要作用。ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子的基因受多種信號(hào)分子的誘導(dǎo)而表達(dá)[7]。Guo等[8]研究發(fā)現(xiàn),棉花等多種高等植物受到黃萎病等真菌侵染時(shí)會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生許多小分子物質(zhì)，如乙烯和水楊酸等。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子TaERF3在對(duì)病原物白粉菌的抗性反應(yīng)途徑中發(fā)揮作用，從而激活植物對(duì)病原物的防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物對(duì)病原菌脅迫響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。近年來，雖然人們已克隆了一些與抗枯萎病相關(guān)的ERFs家族基因，但仍有許多調(diào)控棉花抗枯萎病反應(yīng)的關(guān)鍵基因的功能尚不清楚。劉戈輝等[10]從高抗枯萎病的棉花品種中克隆了1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因GhB301，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入野生型棉花品種YZ-1并獲得純合株系，枯萎病抗性鑒定結(jié)果表明，過表達(dá)GhB301的轉(zhuǎn)基因棉花株系病情指數(shù)為 14.77%，顯著低于野生型對(duì)照(病情指數(shù)為 37.50%)，顯著提高棉花對(duì)枯萎病的抗性。本研究在此基礎(chǔ)上，通過分析GhB301基因?qū)γ藁共∠嚓P(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響，探討GhB301基因在棉花抗枯萎菌中的功能，為棉花抗枯萎病分子育種提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 棉花材料的種植

供試棉花材料為過表達(dá)GhB301轉(zhuǎn)基因棉花純合株系(OE)與野生型對(duì)照YZ-1(WT)，其中棉花轉(zhuǎn)基因純合株系在石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)中獲得。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照材料的種子分別用50～60 ℃的溫水浸泡30 min，放在發(fā)芽盒中于37 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 3 d。然后將發(fā)芽的種子清理好種植于營(yíng)養(yǎng)缽中[V(花土)∶V(蛭石)=3∶1)]，放置于光照培養(yǎng)箱(光照16 h、25 ℃，黑暗8 h、23 ℃，濕度65%)中進(jìn)行培養(yǎng)，待棉苗第1片真葉完全展平時(shí)進(jìn)行接菌處理。

1.2 枯萎病菌的活化及接菌處理

供試菌株為枯萎病菌7號(hào)生理小種強(qiáng)致病菌株F430，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花分子育種實(shí)驗(yàn)室提供?；罨筇羧尉溆诓槭弦后w培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min暗培養(yǎng)7～10 d，待菌液達(dá)到1×107個(gè)孢子/mL時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缽中棉苗進(jìn)行傷根處理，用注射器吸取10 mL菌液注射到傷口處，對(duì)照注射10 mL的去離子水。每次處理30株，重復(fù)3次，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 抗病相關(guān)酶活性的測(cè)定

分別取轉(zhuǎn)基因棉花材料和野生型材料接菌后0、1、3、5、7 d的葉片，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱。過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性測(cè)定參考汪紅等[11]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參考Bailly等[12-13]的方法。

1.4 抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析

提取枯萎病菌處理后24 h的轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照系的根部RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。內(nèi)參基因?yàn)镚hUBQ7，qRT-PCR反應(yīng)體系及程序設(shè)計(jì)參考TransStart Tip Green qPCR SuperMix說明書。共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[14]。用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由北京華大基因公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010、SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花葉片防御酶活性分析

2.1.1 SOD活性變化 在接種棉花枯萎病菌后，無論是轉(zhuǎn)基因材料(OE)還是野生型材料(WT)中超氧化物歧化酶(SOD)活性都比相應(yīng)的接水對(duì)照(CK-OE、CK-WT)高，并且都隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但其SOD活性大小與峰值出現(xiàn)時(shí)間不同(圖1)。其中轉(zhuǎn)基因材料的峰值出現(xiàn)較早，在接菌后的第3天，是同期轉(zhuǎn)基因接水的2.66倍，野生型材料峰值出現(xiàn)的較晚，在接菌后的第5天，是同期野生型接水的1.78倍。

2.1.2 POD活性變化 由圖2可知，兩個(gè)接水處理的棉花材料葉片中過氧化物酶(POD)活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且轉(zhuǎn)基因材料(OE)的POD活性均高于野生型材料(WT)，尤其是在第3天，是野生型接水對(duì)照(CK-WT)的2.20倍。在接菌處理后，轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)基因材料的POD活性均高于相應(yīng)的野生型材料，轉(zhuǎn)基因材料在第3天達(dá)到峰值，而野生型材料在第5天才達(dá)到峰值；在接種后3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因接菌材料是轉(zhuǎn)基因接水材料的2.26倍，野生型接菌材料是野生型接水材料的1.56倍。

2.1.3 CAT活性變化 由圖3可以看出，在接菌處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因材料(OE)葉片CAT活性與野生型(WT)相比顯著增加；隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)棉花材料葉片CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因材料葉片峰值出現(xiàn)在接菌后的第3天，是同期轉(zhuǎn)基因接水對(duì)照(CK-OE)的2.57倍，野生型材料葉片CAT活性在第5天出現(xiàn)峰值，是同期野生型接水對(duì)照(CK-WT)的1.41倍。在接水處理的條件下，轉(zhuǎn)基因材料葉片的過氧化氫酶(CAT)活性與野生型材料無明顯差異；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型棉花葉片CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且在第5天達(dá)到峰值，轉(zhuǎn)基因材料葉片中CAT活性變化不明顯。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

*和**分別表示同期接菌處理與接水對(duì)照間在0.05和 0.01水平存在顯著性差異；下同

圖2 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后POD活性變化Fig.2 Changes of peroxidase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.1.4 PAL活性變化 如圖4所示，在接菌處理?xiàng)l件下，兩個(gè)材料PAL活性均出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，與POD、SOD活性不同的是，轉(zhuǎn)基因材料(OE)在第5天達(dá)到峰值，是同期轉(zhuǎn)基因接水材料(CK-OE)的3.04倍，但在野生型材料(WT)中PAL活性在第3天達(dá)到峰值，是同期野生型接水對(duì)照(CK-WT)的1.75倍。在接水處理?xiàng)l件下，兩個(gè)材料也都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，但不明顯。

圖3 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后CAT活性變化Fig.3 Change of catalase activity in transgenicand wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

圖4 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后PAL活性變化Fig.4 Change of phenylalanine ammonia lyase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.1.5 PPO活性變化 圖5顯示，在接種棉花枯萎病菌后，轉(zhuǎn)基因材料(OE)和野生型材料(WT)中多酚氧化酶(PPO)活性都比相應(yīng)的接水對(duì)照(CK-WT、CK-OE)顯著增加，并且都隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，兩個(gè)材料的PPO活性峰值均出現(xiàn)在第3天，但其PPO活性大小不同。在第3天轉(zhuǎn)基因接菌材料是同期轉(zhuǎn)基因接水材料的2.98倍，野生型接菌材料是同期野生型接水材料的2.02倍。在接水處理的條件下，兩個(gè)材料的PPO活性變化也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在第5天，并且在第5天時(shí)轉(zhuǎn)基因接水材料的PPO活性顯著高于野生型接水材料，是野生型接水材料的 1.22倍。

圖5 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后PPO活性變化Fig.5 Change of polyphenol oxidase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.2 抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡明GhB301在棉花枯萎病抗性中的功能，利用qRT-PCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因棉花材料(OE)和野生型材料(WT)在接種枯萎病菌24 h后苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因、JA/ET路徑相關(guān)基因、SA路徑相關(guān)基因、PR基因等抗病相關(guān)基因的表達(dá)，如圖6所示。結(jié)果表明，與野生型材料相比，轉(zhuǎn)基因材料在枯萎病菌處理后除GhERF1、GhJAZ1、GhNPR1外，大多數(shù)基因均上調(diào)表達(dá)。

在苯丙烷代謝途徑中(圖6-A)，共檢測(cè)6個(gè)基因，其中GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhF5H2在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于野生型材料，GhCCR1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型材料，GhHCT1在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異。

在JA/ET路徑中(圖6-B)，共檢測(cè)5個(gè)基因，其中乙烯合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因GhAOS1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于野生型材料，GhAOC1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型材料；GhEIN2在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異，僅略高于野生型材料，而GhERF1和GhJAZ1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量均低于野生型材料，特別是GhJAZ1在轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于野生型材料。

在SA路徑中(圖6-C)，共檢測(cè)4個(gè)基因，其中GhICS1和GhEDS1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于野生型材料，GhPAD4在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型材料，GhNPR1在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異。

在PR基因中(圖6-D)，共檢測(cè)4個(gè)基因，其中只有GhPR4在轉(zhuǎn)基因材料中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型材料，另外3個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因材料中僅略高于野生型材料。

綜上所述，在接種枯萎病菌24 h后，過表達(dá)GhB301棉花中與苯丙烷代謝途徑、JA/ET路徑、SA路徑、PR基因等多個(gè)抗病相關(guān)基因被激活，僅有個(gè)別基因的表達(dá)無明顯差異，由此推測(cè)過表達(dá)GhB301的轉(zhuǎn)基因棉花增強(qiáng)對(duì)枯萎病抗性的原因可能與抗病相關(guān)基因的激活有關(guān)。

A.苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量;B.JA/ET路徑相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量;C.SA路徑相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量;D.PR基因相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

當(dāng)植株受到病原菌侵害時(shí)體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化，包括組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變，以及相應(yīng)的物理化學(xué)的抗病反映[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)接種大麗輪枝菌后不同抗性棉花品種的PAL、POD、PPO、CAT等的酶活性隨著品種抗病性的增強(qiáng)而升高[17]。Gayoso等[18]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有Ve基因的抗黃萎病番茄在受到黃萎病菌侵染后，PAL和POD的活性升高并且木質(zhì)素含量增加。SOD、GPX、CAT和APX可以清除細(xì)胞中的活性氧，以保護(hù)細(xì)胞免受過氧化傷害，并且轉(zhuǎn)基因植株的酶活性更高[19]。李娟[20]對(duì)轉(zhuǎn)基因抗病棉花品種與對(duì)照材料進(jìn)行接種枯萎病菌處理,發(fā)現(xiàn)其PAL、POD活性的變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因抗病棉花的酶活性變化更快，峰值更高。本研究以過表達(dá)GhB301轉(zhuǎn)基因棉花純合株系和野生型對(duì)照為試驗(yàn)材料，接種棉花枯萎病菌后，發(fā)現(xiàn)棉花葉片SOD、CAT、PAL、PPO、POD活性逐漸增高，均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因棉花材料的SOD、CAT、POD、PAL、PPO活性均高于野生型材料，且SOD、POD、CAT活性峰值均早于野生型材料2 d左右，這與前人研究結(jié)果基本一致。

前人研究發(fā)現(xiàn)棉花代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量變化與植物抗病性相關(guān)。苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑是苯丙烷途徑的重要分支，通過此途徑可以合成木質(zhì)素[21]。植物木質(zhì)化程度越高，相應(yīng)的抗病性就越強(qiáng)[22]。木質(zhì)素合成相關(guān)基因可以通過正向調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成和提高木質(zhì)素含量，來提高棉花對(duì)枯萎病的抗性[23]。JA/ET和SA現(xiàn)已被證明是植物與病原菌互作中重要的激素，植物受病原菌脅迫后能夠顯著改變這些激素的生物合成和下游信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)[24-25]。ERF1作為JA/ET響應(yīng)應(yīng)答調(diào)控因子起作用，超表達(dá)ERF1的擬南芥對(duì)枯萎病菌及其他一些腐生型真菌的抗性增強(qiáng)，ERF2也具有類似的功能[26]。研究發(fā)現(xiàn)GbERF1的表達(dá)受黃萎病的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過量表達(dá)GbERF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥能增強(qiáng)多個(gè)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，與野生型擬南芥相比，對(duì)黃萎病的抗性也明顯提高[27]。李超[28]發(fā)現(xiàn)棉花和擬南芥通過增強(qiáng) JAZ1 來抑制茉莉酸通路激活赤霉素通路，從而降低棉花抗病性來調(diào)節(jié)植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定接種枯萎病菌后轉(zhuǎn)基因棉花株系和野生型株系中抗病相關(guān)基因的表達(dá)，被檢測(cè)基因中大部分在轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型對(duì)照，推測(cè)接菌后有效提高苯丙烷代謝途徑、JA/ET途徑、SA途徑中相關(guān)基因和PR基因的表達(dá)，且JAZ1作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子表達(dá)量降低也得到驗(yàn)證。結(jié)合前期對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花株系抗病性的鑒定，推測(cè)轉(zhuǎn)GhB301棉花株系對(duì)枯萎病抗性增強(qiáng)可能是由于GhB301基因的過表達(dá)引起棉花抗病相關(guān)基因表達(dá)量升高進(jìn)而增加了防御相關(guān)酶活性所致。