扶艷艷，成 欽，聞 豪，劉正杰，林 春，黃 玲，楊煥文，毛自朝

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 特色小宗作物研究中心，昆明 650201；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，成都 610300；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，昆明 650201)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)是一種具極高的營(yíng)養(yǎng)和保健功能的蔬菜，享有“蔬菜之王”、“世界十大名菜之一”等美譽(yù)[1]。當(dāng)前中國(guó)雖已成為世界第一大蘆筍生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[2]，但優(yōu)質(zhì)的蘆筍生產(chǎn)用種主要依靠進(jìn)口，解除中國(guó)蘆筍產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的限制因素是培育有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種[3-4]。蘆筍是典型的雌雄異株植物，但其雄株因不結(jié)種子，營(yíng)養(yǎng)消耗少，產(chǎn)品品質(zhì)好，產(chǎn)量也比同期生長(zhǎng)的雌株高出25%以上，且植株壽命長(zhǎng)，抗性強(qiáng)，而受到廣大種植者的青睞，為此培育優(yōu)質(zhì)全雄蘆筍品種成為中國(guó)蘆筍育種家們的奮斗目標(biāo)[5-6]。全雄蘆筍品種的培育可通過(guò)超雄株(MM)與雌株(mm)雜交獲得，因此優(yōu)質(zhì)超雄株的獲取便成為全雄品種培育的關(guān)鍵[7]。但又因蘆筍兩性株自交產(chǎn)生的超雄株存在自交衰退，而通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得性狀優(yōu)良的超雄株的方式也十分困難，且當(dāng)前認(rèn)為植物性染色體起源及性別分化的機(jī)制是植物雌、雄配子發(fā)育相關(guān)基因的突變及隨后同源重組修復(fù)抑制所導(dǎo)致的[8]，因此通過(guò)對(duì)蘆筍配子發(fā)育相關(guān)基因的功能研究，將實(shí)現(xiàn)獲取超雄種質(zhì)的分子育種新途徑，同時(shí)也是解析蘆筍性別分化及性染色體起源的有效方法之一。蘆筍基因組測(cè)序組裝后的基因預(yù)測(cè)及突變體研究發(fā)現(xiàn)，AoTDF1是蘆筍雄株專一、且是Y染色體區(qū)的性別決定區(qū)域(MSY)的性別決定基因中的促雄基因[9-10]。但目前尚未有AoTDF1調(diào)控性別分化的分子機(jī)制及其下游調(diào)控靶基因的相關(guān)報(bào)道。筆者開展RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)AoTDF1在蘆筍雄花雄蕊發(fā)育的早期階段表達(dá)水平高，而在雌花及雄花發(fā)育的晚期階段表達(dá)量低[11 ]，這與其同源的擬南芥TDF1基因的表達(dá)類似[12]；故推測(cè)蘆筍中與擬南芥AMS同源基因編碼蛋白應(yīng)與AoTDF1互作，共同參與蘆筍花粉發(fā)育及性別分化的調(diào)控過(guò)程。

植物雄蕊花藥是雄配子發(fā)育的場(chǎng)所，其花藥壁由外至內(nèi)由表皮層(epidermis)、內(nèi)壁層(endothecium)、中層(middle layer)、絨氈層(tapetum)構(gòu)成[13]。絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層的特殊分泌細(xì)胞，通過(guò)給發(fā)育中的花粉提供營(yíng)養(yǎng)、發(fā)送調(diào)控信號(hào)等在雄配子發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13-14]。目前，在擬南芥中已經(jīng)克隆出與絨氈層發(fā)育相關(guān)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并且確定了1條包含5種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控絨氈層發(fā)育的調(diào)控通路(DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1)[15-16]。在這些關(guān)鍵調(diào)控因子的研究中，Sorensen等[17]發(fā)現(xiàn)ABORTEDMICROSPORES(AMS)是編碼歸屬bHLH基因家族的MYC亞家族成員，調(diào)控絨氈層細(xì)胞發(fā)育及減數(shù)分裂后小孢子的發(fā)育。Xu等[18]和許杰等[19]以擬南芥ams突變體為材料系統(tǒng)地研究和分析了AMS基因在花藥發(fā)育過(guò)程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ams突變體在四分體(tetrad)后絨氈層細(xì)胞異常的膨大，不能完成細(xì)胞程序性死亡過(guò)程(Programmed Cell Death，PCD)，最終導(dǎo)致花粉外壁發(fā)育異常。且AMS的功能發(fā)揮是通過(guò)特異識(shí)別其下游靶基因的啟動(dòng)子中E-box順式元件，調(diào)控下游基因的表達(dá)[18-20]。Xu等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AMS可調(diào)控孢粉素的生物合成以及花粉壁形成的前體物質(zhì)的分泌。Ferguson等[22]研究發(fā)現(xiàn)AMS蛋白具雙時(shí)期(biphasic)表達(dá)與調(diào)控特征，表現(xiàn)為AMS蛋白的含量在花粉發(fā)育早期的絨氈層和花粉發(fā)育晚期的花粉外壁呈雙峰表達(dá)。目前在許多有花植物物種中已克隆鑒定了多個(gè)AMS的同源基因，其中水稻中OsTDR(TAPETUMDEGENERATIONRETARDATION)基因與擬南芥AMS同源，具相似的功能及表達(dá)模式[23-24]。劉辰[25]對(duì)辣椒同源基因CaAMS的功能分析表明，該基因沉默會(huì)導(dǎo)致植株部分花粉敗育，CaAMS在發(fā)育早期的花藥中表達(dá)。Sheng等[26]用甜瓜的雄性不育突變體ms-5為材料克隆了其AMS同源基因CsAMS。 Guo等[27]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)辣椒CaAMS基因在絨氈層發(fā)育的四分體期和單核期強(qiáng)烈表達(dá)，且CaAMS表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致辣椒花絲縮短、皺縮、雄蕊不開裂，最終導(dǎo)致花粉敗育。袁巧玲[28]發(fā)現(xiàn)洋蔥的AcAMS定位于細(xì)胞核，且AcAMS基因具花藥表達(dá)特異性。辛琪琪[29]從白樺樹中克隆了BpAMS基因，亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示其編碼蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，qRT-PCR檢測(cè)野生型白樺的各個(gè)組織，發(fā)現(xiàn)在白樺雄花中的表達(dá)量明顯高于其他組織。這一系列研究預(yù)示AMS及其直系同源基因在物種演化中，其結(jié)構(gòu)及功能都是相對(duì)保守的，因此推測(cè)蘆筍中與擬南芥AMS同源的蛋白，應(yīng)與蘆筍AoTDF1互作，并且在蘆筍絨氈層發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮相似的分子功能。

本研究通過(guò)同源性及進(jìn)化分析初步預(yù)測(cè)到4條蘆筍的AMS同源基因，分別命名為AoAMS_L1、AoAMS_ L2、AoAMS_L3、AoAMS_L4。進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)這4條候選基因進(jìn)行表達(dá)量的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AoAMS_L1在蘆筍超雄株及兩性株的花蕾中表達(dá)量較高，而在雌株的花蕾以及兩性株的根、莖中表達(dá)量極低或不表達(dá)，說(shuō)明AoAMS_L1基因在超雄株和兩性株的花蕾中專一地表達(dá)，故將AoAMS_L1基因作為首選基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

紫蘆筍‘紫色激情’是四倍體，為富含花青素的“水果型甜蘆筍”，暢銷于國(guó)內(nèi)外。因四倍體紫蘆筍的花蕾比普通二倍體蘆筍花蕾大，加之本研究組多年的連續(xù)的篩選與培養(yǎng)獲得了特殊的‘紫色激情’兩性株材料，目前已通過(guò)該材料連續(xù)自交3代獲得的兩性株，雌株、雄株材料[30]，用于蘆筍花器官變異的識(shí)別及配子調(diào)控基因的原位表達(dá)分析。為此，筆者通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增‘紫色激情’中AoTDF1和AoAMS的全長(zhǎng)編碼序列(CDS)，開展AoAMS亞細(xì)胞定位，與AoTDF1的互作，以及AoAMS基因在紫蘆筍雌、雄以及兩性株中早期花蕾發(fā)育階段的花器官表達(dá)分析的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 荷蘭綠蘆筍‘CIJNLIM’品種的雙單倍體(DH，Double Haploid)雌株和超雄株的花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI(National Center for Biotechnology Information )網(wǎng)站SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR1642913)。本研究用的主要材料為3 a生‘紫色激情’(Purple passion)四倍體蘆筍兩性株自交后代的兩性株、雌株、雄株，種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場(chǎng)基地(海拔1 886 m；經(jīng)度102°75′；緯度25°13′)。

于蘆筍開花期分別采集云南農(nóng)大后山農(nóng)場(chǎng)種植的紫蘆筍‘紫色激情’品種兩性株自交后代群體中的兩性株和雌株的幼嫩根、嫩莖和花蕾，做好標(biāo)記后迅速用液氮冷凍，隨后保存在超低溫-80 ℃冰箱用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的二倍體綠蘆筍‘Italy’品種的雌株組培苗用于蛋白亞細(xì)胞定位分析。采集云南農(nóng)大后山農(nóng)場(chǎng)種植的紫蘆筍‘紫色激情’品種兩性株自交后代群體中的雌、雄和兩性株早期花發(fā)育(T1～T3時(shí)期)的花蕾(其中T1：花蕾長(zhǎng)度<1 mm，處于無(wú)雌雄發(fā)育差異的兩性階段；T2：1 mm≤花蕾長(zhǎng)度<2 mm，處于性別發(fā)育的早期；T3：2 mm≤花蕾長(zhǎng)度<3 mm，處于性別發(fā)育的晚期階段)，每個(gè)時(shí)期大約采 20 個(gè)花蕾放入新鮮配制的 FAA 固定液(每100 mL含 50%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛5 mL、甘油5 mL)中進(jìn)行固定，隨后放入4 ℃冰箱保存，用于組織RNA原位雜交試驗(yàn)。

1.1.2 菌株、載體及本研究中所用引物 菌株：大腸桿菌菌株(E.coli)DH5 α、農(nóng)桿菌EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存；酵母菌株Y2H gold由中國(guó)科學(xué)院熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

載體：植物瞬時(shí)表達(dá)載體pBI121-eGFP為本實(shí)驗(yàn)保存，酵母雙雜交載體pGBKT7和pGADT7由中國(guó)科學(xué)院熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室胡彥如博士提供，酵母雙雜交陰性、陽(yáng)性對(duì)照載體由廣州大學(xué)分子遺傳與進(jìn)化創(chuàng)新研究中心陳麗玉博士贈(zèng)送。

所有引物均用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物詳細(xì)信息見表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2 方 法

1.2.1AoAMS基因的篩選與分析 從phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取蘆筍基因組注釋的蛋白序列，與NCBI(https://www.ncbi.nih.gov)下載的AMS蛋白序列(NP_179283.2)，進(jìn)行blastp比對(duì)，并設(shè)置E-value <0.000 001，篩選同源性大于40%，且氨基酸長(zhǎng)度大于100的AoAMS氨基酸序列作為候選基因。用同樣的方法得到了與蘆筍同屬物種文竹、大理天門冬以及茄科的馬鈴薯和番茄的AMS基因的氨基酸序列。用RaXML[31]軟件將所獲得的AMS同源候選基因的氨基酸序列與部分已鑒定基因功能的AMS基因的氨基酸序列以及文竹、大理天門冬、番茄、馬鈴薯的序列進(jìn)行極大似然估計(jì)法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

基因表達(dá)量的分析用的是筆者實(shí)驗(yàn)室開展的18個(gè)‘紫色激情’和6個(gè)荷蘭‘GIJNLIM’品種蘆筍樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)(‘紫色激情’RNA測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)未發(fā)表)，分別經(jīng)fastqc和fastp 質(zhì)控和數(shù)據(jù)清洗后[32]，得到Clean date；再利用hisat2[33]比對(duì)到參考基因組中獲得短序列比對(duì)圖譜(SAM)文件，最后用R中的Rsubread包(https://bioconductor.org/packages/ Rsubread/)提取單個(gè)樣本中基因的表達(dá)量，并進(jìn)行AMS候選基因表達(dá)量(Transcript Per Million Mapped Fragments,TPM)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 亞細(xì)胞定位 利用在線程序(WoLF PSORT http://www.wolfpsort.org/)預(yù)測(cè)AoAMS編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。進(jìn)一步利用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI雙酶切pBI121-eGFP載體，獲得線性化載體，分別設(shè)計(jì)含SalI和XbaI的AoAMS:eGFP-F和AoAMS:eGFP-R引物 ，其中AoAMS:eGFP-R反向引物刪除終止密碼子并加上1個(gè)編碼短肽“GlyGlyGlyAla”的linker： GGG GGA GGG GCA(見表1，黑體部分顯示的是linker的反向互補(bǔ)序列)PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SalI和XbaI雙酶切后，插入pBI121-eGFP載體XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)的位置，隨后轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR以及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后命名為pBI121-35S:: AoAMS -eGFP。 將pBI121-AoAMS:eGFP與空載pBI121-eGFP分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中，然后利用農(nóng)桿菌侵染法侵染蘆筍‘Italy’品種雌株無(wú)菌苗的幼嫩莖段，具體實(shí)驗(yàn)操作參考張園博士的蘆筍遺傳轉(zhuǎn)化方法[34]，同時(shí)設(shè)空載質(zhì)粒pBI121-eGFP 為陰性對(duì)照。侵染完成后，將侵染后的蘆筍莖段平鋪在MS共培養(yǎng)基(MS + 1.0 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA + 2.0 mg/L 2,4-D +蔗糖 3% + 瓊脂粉0.6% + 200 mg/L Carb + 150 μmol/L AS)上于 19 ℃黑暗共培養(yǎng) 3 d后，使用激光共聚焦顯微鏡(OLYMP FV 1000)觀察熒光蛋白信號(hào)的產(chǎn)生。

1.2.3AoAMS在蘆筍雌、雄兩性花中的原位雜交檢測(cè) 紫蘆筍雌、雄及兩性株T1～T3時(shí)期的花蕾樣品均用FAA固定液(每100 mL FAA固定液包含：50%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛5 mL、甘油5 mL)固定后，經(jīng)梯度酒精(50%、60%、70%、80%、90%、100%)每次20 min脫水，用透明溶液(1∶1無(wú)水乙醇/二甲苯混合液，二甲苯，二甲苯)各自浸泡30 min，之后換純蠟酸浸泡2次，每次2 h，完成透明；透明材料包埋后切片，切片厚度約15～20 μm。選擇AoAMS序列中特異性高的區(qū)域，設(shè)計(jì)探針引物(見表1:AoAMS-ISH-F/AoAMS-ISH-R)。用德國(guó)Roche公司的DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒，并按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行探針標(biāo)記和組織原位雜交。

1.2.4 酵母雙雜交互作分析 設(shè)計(jì)AoTDF1和AoAMS基因編碼區(qū)的5′和3′引物：AoTDF1-Y2H-F/AoTDF-Y2H-R、AoAMS-Y2H-F/AoAMS-Y2H-R，引物序列見表1。通過(guò)PCR擴(kuò)增分別在AoTDF1和AoAMS的CDS的5′端和3′端引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)后，用EcoRI和BamHI雙酶切，并插入pGBKT7和pGADT7相同的酶切位點(diǎn)處，而分別獲得AoTDF1-BD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD、AoAMS-AD表達(dá)載體。Y2H gold酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化參照北京酷萊博Coolaber科技有限公司酵母感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化試劑盒(Super Yeast Transformation Kit)說(shuō)明書。同時(shí)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照(53-BD與T-AD)和陰性對(duì)照(Lam-BD與T-AD、BD與AD)。把共轉(zhuǎn)化的酵母懸浮細(xì)胞涂布到二缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp，百思禾Bestplant產(chǎn)品，南京)上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。待SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，選取生長(zhǎng)較好的酵母單克隆于加裝有 100 μL 無(wú)菌水的 EP 管中混勻，吸取 10 μL 置于四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/ Ade/-His，百思禾Bestplant產(chǎn)品，南京)上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 2～3 d 后觀察酵母生長(zhǎng)情況以確定蛋白間的互作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍AoAMS基因的篩選與分析

NCBI 上下載的AMS蛋白序列進(jìn)行Blastp比對(duì)，在蘆筍中篩選出4條同源性最高的AoAMS蛋白序列后，分別命名為AoAMS_L1、 AoAMS_L2、 AoAMS_L3、AoAMS_L4。利用RaXML軟件(https://github.com /stamatak/standard-RAxML/)將4條AoAMS候選基因的氨基酸序列與部分已鑒定基因功能的AMS基因的氨基酸序列、以及文竹、大理天門冬、番茄、馬鈴薯的序列進(jìn)行極大似然估計(jì)法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：AoAMS_L3與AoAMS_L4獨(dú)立的聚為一支，與已鑒定功能的其他物種的同源序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；AoAMS_L1與同屬的文竹(AsparagussetaceusJessop)以及大理天門冬(Asparagustalinensis)中的同源序列聚為一支，且與已確定基因功能的單子葉植物中的水稻(OryzasativaL.)、洋蔥(AlliumcepaL.)的同源序列關(guān)系相對(duì)較近。而 AoAMS_L2則與雙子葉植物中的辣椒(CapsicumannuumL.)、大麻(CannabissativaL.)、馬鈴薯(SolanumtubersumL.)中的同源序列親緣關(guān)系相對(duì)較近(圖1-A)。為進(jìn)一步確定蘆筍中AMS的候選同源基因，分析了4個(gè)AoAMS候選基因在荷蘭‘CIJNLIM’蘆筍品種雙單倍體雌株和超雄株以及‘紫色激情’(‘Purple passion’)蘆筍品種兩性株自交后代的兩性株(A)和雌株(F)中不同器官組織的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： AoAMS_L1在荷蘭蘆筍品種‘CIJNLIM’的雙單倍體(DH)的超雄(SM)花蕾、以及蘆筍‘紫色激情’品種(P)兩性株(A)的花蕾中表達(dá)量較高，但在雙單倍體(DH) 雌株和紫蘆筍雌株的花蕾(F)、以及不同性別紫蘆筍的根和莖中表達(dá)量均較低；AoAMS_L2在所有檢測(cè)的組織和器官中表達(dá)均低； AoAMS_L3除在蘆筍的莖，雌株的花蕾中有一定的表達(dá)外，在其他器官組織中表達(dá)較低或無(wú)表達(dá)；AoAMS_L4除在根中表達(dá)較低外，在所有組織中均有較高表達(dá)(圖1-B)。因AoAMS_L1是唯一的在雄性和兩性株花蕾中專一表達(dá)的AMS同源基因，另進(jìn)化樹分析它與已鑒定功能的其他物種的AMS基因親緣關(guān)系最近(圖1-A)，故將定位于7號(hào)連鎖群的AoAMS_L1(AsparagusV1_07.2467)命名為AoAMS，并進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位、與AoTDF1的互作以及在花早期發(fā)育時(shí)期花蕾中不同器官的表達(dá)分析。

圖B中AoDH_F_F 是荷蘭蘆筍GIJNLIM品種 雙單倍體雌株花蕾；AoDH_SM_F是荷蘭蘆筍CIJNLIM品種 雙單倍體超雄花蕾；AoP_A_F 是‘紫色激情’品種兩性株的花蕾；AoP_A_R是‘紫色激情’品種兩性株的根；AoP_A_S是‘紫色激情’品種兩性株的莖；AoP_F_F 是‘紫色激情’品種雌株的花蕾；AoP_F_R是‘紫色激情’品種雌株的根；AoP_F_S是‘紫色激情’品種雌株的莖

2.2 AoAMS蛋白亞細(xì)胞定位分析

以AoAMS蛋白序列在WoLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白可能定位于細(xì)胞核。通過(guò)農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)法分別將pBI121-GFP與重組pBI121-35s::AoAMS-GFP植物表達(dá)載體(圖2-A)導(dǎo)入二倍體綠蘆筍‘Italy’品種雌株組培苗的幼嫩莖段細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，于共焦距熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白( Green Fluorescent Protein ,GFP)與融合蛋白AoAMS-GFP的定位情況(圖2-B～2-G)。結(jié)果顯示：對(duì)照空載體GFP的熒光信號(hào)在細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中均能檢測(cè)到，而AoAMS-GFP融合蛋白的綠色熒光信號(hào)主要集中發(fā)生在細(xì)胞核中，證實(shí)了AoAMS蛋白定位與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，且該結(jié)果與AoAMS作為轉(zhuǎn)錄因子的定位特征相一致。

Bright-field:明場(chǎng)；GFP：綠色熒光信號(hào)；Merge：疊加圖像，Bar=20 μm

2.3 AoTDF1與AoAMS蛋白的互作分析

AoTDF1和AoAMS的CDS 通過(guò)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，分別連接到酵母表達(dá)載體pGBKT7、pGADT7 的相同酶切位點(diǎn)上，經(jīng)酶切鑒定確定連接正確后，將這些重組載體進(jìn)行測(cè)序分析，確定AoTDF1和AoAMS在構(gòu)建過(guò)程中未發(fā)生突變，此時(shí)說(shuō)明已成功構(gòu)建了酵母醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH1)啟動(dòng)子啟動(dòng)AoTDF1-BD，AoTDF1-AD、AoAMS-BD和AoAMS-AD融合表達(dá)的載體(圖3-A)。試驗(yàn)組和對(duì)照組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，2～3 d后觀察發(fā)現(xiàn)：所有對(duì)照組及試驗(yàn)組的酵母菌落在二缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp)上都能正常生長(zhǎng)，表明轉(zhuǎn)化成功。進(jìn)一步通過(guò)觀察四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His)上試驗(yàn)組與對(duì)照組的酵母菌落生長(zhǎng)情況判斷AoTDF1是否與AoAMS直接互作(圖3-B)。結(jié)果是共同轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照組Lam-BD與T-AD、BD與AD、AoTDF1-BD與AD、AoAMS-BD與AD質(zhì)粒的酵母菌落在四缺培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；而共同轉(zhuǎn)化AoTDF1-BD與AoTDF1-AD、AoTDF1-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD質(zhì)粒的菌落，與共同轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照53-BD/T-AD質(zhì)粒的菌落在四缺培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)化AoTDF1-BD與AoTDF1-AD、AoAMS-BD與AoAMS-AD質(zhì)粒的酵母菌落要比轉(zhuǎn)化AoTDF1-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD質(zhì)粒的酵母菌落相對(duì)較小。結(jié)果表明：在酵母中AoTDF1與AoAMS存在互作，且AoTDF1、AoAMS蛋白能夠自激活形成同源二聚體，預(yù)示AoTDF1、AoAMS可能是以不同亞基組合形式形成復(fù)合物來(lái)調(diào)控花藥絨氈層及花粉的發(fā)育。

圖3 AoTDF1與AoAMS表達(dá)載體構(gòu)建(A)以及互作驗(yàn)證(B)Fig.3 Construction of expression vector of AoAMS and AoTDF1(A)and interaction validation(B)

2.4 蘆筍AoAMS基因在蘆筍花發(fā)育早期階段的花器官中的表達(dá)

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，確定AoAMS主要在蘆筍雄株和兩性株的花蕾中表達(dá)(圖1-B)，但尚不知其在花蕾不同發(fā)育時(shí)期的花器官定位表達(dá)情況，而組織RNA原位雜交分析，將獲得AoAMS基因在蘆筍不同性別花發(fā)育的前3個(gè)時(shí)期的空間表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示：AoAMS基因在紫蘆筍雄花發(fā)育的T1期(無(wú)性別分化期)的絨氈層和花粉中表達(dá)較低，但花被中表達(dá)較強(qiáng)(紫色深淺代表表達(dá)量的高低， 圖4-A)，T2期(性別分化早期，圖4-B)的絨氈層、花粉以及花冠中均有較高表達(dá)，而到了T3期(性別分化晚期)AoAMS在花藥絨氈層中高效表達(dá)，但花被表達(dá)量下降(圖4-C)；而在T1、T2、T3期的雌花中檢測(cè)不到明顯的表達(dá)信號(hào) (圖4-G～4-I)。兩性花蕾的原位RNA雜交分析發(fā)現(xiàn)：AoAMS在T1、T2期及T3期的花粉、絨氈層中均有高的表達(dá)信號(hào)(圖4-M～4-O)，但表達(dá)量T1>T2>T3期，但有趣的是在雄花衰退的雌蕊和兩性花正常發(fā)育的雌蕊中，也能檢測(cè)到AoAMS的表達(dá)信號(hào)(圖4-B、 4-C 、4-N、 4-O)。相應(yīng)的sense-探針作為對(duì)照組的試驗(yàn)中(圖4-D～4-F，4-J～4-L，4-P～4-R)均未檢測(cè)到雜交信號(hào)。以上結(jié)果說(shuō)明AoAMS是雄配子正常發(fā)育所必須的，但與擬南芥AMS的表達(dá)相比，AoAMS基因在正?；ǚ郯l(fā)育的雄花與兩性花的雄蕊的花粉絨氈層中表達(dá)，但不具有擬南芥AMS花粉絨氈層專一性表達(dá)特征，在雄花和兩性花花被，甚至在兩性花正?；蛐刍ㄍ嘶l(fā)育的雌蕊中均有不同程度的表達(dá)。

A～C：雄花發(fā)育T1～T3時(shí)期；D～F：雄花加順式(Sence)探針對(duì)照；G～I(xiàn)：雌花發(fā)育T1～T3時(shí)期；J～L：雌花加順式(Sence)探針對(duì)照；M～O：兩性花發(fā)育T1～T3 時(shí)期；P～R：兩性花加順式(Sence)探針對(duì)照。bar=500 μm

3 討論與結(jié)論

植物避免自交衰退、保持遺傳新組合以適應(yīng)環(huán)境變化的有效機(jī)制之一是性別分化。被子植物中有約160科的15 000個(gè)物種具有性別分化的現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)這些物種的性別分化大約要經(jīng)超過(guò)800余次的性別分化與性染色體獨(dú)立起源[8,35]。在兩性花植物分化為兩性株的過(guò)程中通常認(rèn)為有雄性兩性花(androdioecy)和雌性兩性花(gynodioecy)的途徑，其中雄性兩性花途徑是物種群體中雌配子發(fā)育相關(guān)基因的失活導(dǎo)致雄株和兩性株共存，而雌性兩性花途徑是雄配子發(fā)育相關(guān)基因的突變導(dǎo)致雌株與兩性株共存。因雌性兩性花(gynodioecy)的途徑能較好地形成后代，與雄性兩性花途徑相比是主流的性別分化途徑。蘆筍作為典型的性別分化及性染色體起源較早的植株，是研究性別分化機(jī)制的優(yōu)良材料[10,36]。

Daisuke等通過(guò)蘆筍基因組PCR分析，發(fā)現(xiàn)與擬南芥TDF1同源的AoMYB35/AoTDF1基因定位于蘆筍雄性專一Y染色體區(qū)(Male-specific region of the Y chromosome,MYS)僅在雄株中表達(dá)，Harkess等[10]2020年確定AoMYB35/AoTDF1是兩個(gè)性別決定基因之一的促雄發(fā)育基因，并且該基因在蘆筍雄花花粉及絨氈層中專一表達(dá)。預(yù)示蘆筍染色體起源及兩性分化應(yīng)為雌性兩性株轉(zhuǎn)化(gynodioecy)途徑，因花粉發(fā)育關(guān)鍵基因AoTDF1的功能失活導(dǎo)致花粉敗育而形成雌株。為證實(shí)上述推測(cè)，需闡明AoTDF1是否參與花藥絨氈測(cè)發(fā)育的調(diào)控，及其是否與蘆筍AoAMS互作調(diào)控花粉及絨氈層的發(fā)育等。本研究首次通過(guò)同源比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化樹以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后基因表達(dá)量的綜合分析，最終確定AoAMS_L1基因?yàn)樘J筍雄花或兩性花專一表達(dá)的AoAMS的候選基因(圖1)，進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析， 確定CaMV 35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AoAMS與GFP融合蛋白(AoAMS-GFP)后的熒光主要來(lái)源于細(xì)胞核(圖2-E～2-G)，而CaMV 35S 驅(qū)動(dòng)GFP自身表達(dá)后沒有亞細(xì)胞專一性定位特征(圖2-B～2-D)，確定AoAMS是一個(gè)核定位特征蛋白。項(xiàng)目組前期用雙分子熒光互補(bǔ)分析(Bimolecular Fluorescence Complementation,BIFC)初步確定AoTDF1與AoAMS_L1有互作[11]，本研究進(jìn)一步用酵母雙雜交方法獲得與BIFC方法相一致的AoTDF1與AoAMS互作，且AoTDF1和AoAMS自身也能互作的結(jié)果(圖3-B)。

AoAMS的擬南芥同源基因AtAMS在絨氈層發(fā)育和小孢子減數(shù)分裂后期發(fā)育及花粉壁的形成中起到關(guān)鍵的作用[18，21]。許杰等[19]通過(guò)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AMS在減數(shù)分裂前表達(dá)量很低，但在減數(shù)分裂后表達(dá)量上升；為探究蘆筍AoAMS基因在不同性別花中的表達(dá)情況，經(jīng)RNA原位雜交檢測(cè)，得知AoAMS基因是在蘆筍雄花發(fā)育的T2時(shí)期、T3時(shí)期的花粉、絨氈層中高效表達(dá)，而在T1時(shí)期(小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期)表達(dá)較弱(圖4-A～4-C)。兩性花的AoAMS基因在花藥絨氈層，T1時(shí)期有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，T2時(shí)期、T3時(shí)期信號(hào)較弱(圖4-M～4-O)。AoAMS基因在雌花發(fā)育早期的3個(gè)時(shí)期(T1時(shí)期、T2時(shí)期、T3時(shí)期)均無(wú)表達(dá)(圖4-G～4-I)。說(shuō)明AoAMS確實(shí)是在雄花和兩性花的絨氈層中表達(dá)，但不具花藥絨氈層專一表達(dá)特性，說(shuō)明AoAMS與AtAMS具相似功能，與AoTDF1一起調(diào)控花粉的發(fā)育，但長(zhǎng)時(shí)間的物種演化形成了新AMS基因序列的變異或其非花藥絨氈抑制表達(dá)基因的失活而產(chǎn)生的表達(dá)模式或新的分子功能。值得注意的是雄花早期發(fā)育的花被中AoAMS的表達(dá)明顯高于兩性花，說(shuō)明雌性的正常發(fā)育可能會(huì)抑制AoAMS基因在花被中的表達(dá)，但其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。擬南芥TDF1與AMS的互作復(fù)合物是花粉發(fā)育調(diào)控所必需的，且AtTDF1可直接通過(guò)與AtAMS啟動(dòng)子AACCT順式元件結(jié)合而調(diào)控AMS及其下游調(diào)控通路如AtMYB103基因的表達(dá)[37]。為此進(jìn)一步的工作將可參考擬南芥和水稻中花粉發(fā)育的遺傳調(diào)控通路，尋找AoAMS的下游調(diào)控基因，以及除AoTDF1外的互作蛋白及調(diào)控靶蛋白，進(jìn)一步闡明AoAMS基因在蘆筍絨氈層發(fā)育調(diào)控通路中的分子功能。

AoAMS在蘆筍中與擬南芥AtAMS同源，其編碼蛋白定位于細(xì)胞核，與蘆筍性別決定促雄基因編碼蛋白AoTDF1有互作，在蘆筍早期發(fā)育的雄花和兩性花，而非雌花中表達(dá)的基因。預(yù)示AoAMS基因在蘆筍中發(fā)揮與擬南芥AMS相似的功能，其表達(dá)受AoTDF1的調(diào)控，與AoTDF1形成互作調(diào)控復(fù)合物，通過(guò)調(diào)控蘆筍花粉絨氈層和花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),在性別分化中發(fā)揮促雄的功能。