王 羊，鄧 倩,2，鄧群仙，張慧芬，張小艾，李紅春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130；2. 四川省廣安市鄰水縣經(jīng)果技術(shù)推廣所，四川廣安 638500；3. 四川省眉山市彭山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川眉山 620800)

棗是原產(chǎn)中國的優(yōu)勢特色果樹[1]。中國棗產(chǎn)業(yè)分為北方產(chǎn)區(qū)和南方產(chǎn)區(qū)[2]，南方產(chǎn)區(qū)以栽植酸甜適口的鮮食棗為主[3]。

糖酸是果實(shí)最重要的內(nèi)在品質(zhì)，其組分、含量及比例共同決定果實(shí)風(fēng)味[4]。桃、梨等成熟果實(shí)以蔗糖為主要糖組分[5-6]，蔗糖磷酸合酶基因(SPS)、轉(zhuǎn)化酶基因(INV)、蔗糖合酶基因(SS)等共同影響蔗糖含量[7]。蘋果以積累果糖為主[8]，葡萄以積累葡萄糖為主[9]，己糖激酶基因(HK)、果糖激酶基因(FK)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(Zj UGP)等協(xié)同調(diào)控果糖和葡萄糖含量[10]。李主要積累蘋果酸，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸酶(NADP+-ME)、NAD+-蘋果酸脫氫酶(NAD+-MDH)是影響蘋果酸含量的關(guān)鍵因子[11]。柑橘為檸檬酸積累型，檸檬酸合酶基因(CS)、烏頭酸合酶基因(Aco)、蘋果酸酶基因(ME)等基因共同影響檸檬酸含量[12-13]。

‘駿棗’‘冬棗’‘贊皇大棗’屬蔗糖積累型，‘山東梨棗’和‘北京雞蛋棗’屬果糖積累型[14-15]；‘冬棗’和‘新鄭灰棗’等大多數(shù)棗的蘋果酸含量最高，‘稷山板棗’奎寧酸含量最高，而‘太古雞心蜜’琥珀酸含量最高[14,16]。不同品種的棗果實(shí)糖酸積累模式不同。目前北方棗的糖酸代謝分子機(jī)理研究較為深入，而南方鮮食棗的相關(guān)報(bào)道較少。

“蜀脆棗”為‘魯北冬棗’引種四川后發(fā)現(xiàn)的早果豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)芽變材料，定植第3年進(jìn)入豐產(chǎn)期，無需環(huán)剝畝產(chǎn)量達(dá)2 000 kg以上，肉質(zhì)細(xì)脆，酸甜爽口，鮮食品質(zhì)極佳[17]。課題組前期已開展“蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育規(guī)律及基本營養(yǎng)品質(zhì)的相關(guān)研究，但果實(shí)糖酸積累規(guī)律及相關(guān)代謝的機(jī)理尚不清楚。本試驗(yàn)以“蜀脆棗”為試材，測定果實(shí)發(fā)育過程中可溶性糖和有機(jī)酸組分與含量，分析糖酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，探索“蜀脆棗”果實(shí)糖酸形成與調(diào)控機(jī)制，以期為南方鮮食棗的分子輔助育種和品質(zhì)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)園位于四川省德陽市羅江區(qū)白馬關(guān)鎮(zhèn)萬佛村五組(31°26′34″N，104°46′18″E)，海拔約660 m，氣候?qū)儆趤啛釒駶櫺?，氣候溫和，四季分明，最高氣?6.6 ℃，最低氣溫-6.7 ℃，年均氣溫16.5 ℃；年均降水量910 mm，年無霜期278 d，年均日照時(shí)數(shù)1 260 h[17]。

1.2 供試材料

試驗(yàn)樹為露地栽培3 a生嫁接苗“蜀脆棗”，株行距為2 m×3 m，單株為一小區(qū)，3次重復(fù)。謝花20 d后開始采集大小一致、無病蟲害的果實(shí)，前期每隔14 d采樣一次，中后期每隔7 d采樣一次[17]。花后20～34 d為幼果期，花后48～69 d為膨大期，花后76 d為白熟期，花后83 d為著色初期，花后90 d為成熟期(半紅期)。果實(shí)置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，切碎，液氮處理后立即放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 果實(shí)糖酸組分及含量的測定 糖組分及含量的測定：用液氮將果實(shí)研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g，加入5 mL乙醇-水(80∶20,V∶V)，80 ℃水浴30 min，常溫6 000 r/min離心10 min，上清液移至25 mL容量瓶，重復(fù)提取1次，定容后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾待測[18]。色譜柱Innoval NH2(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相乙腈∶水 (80∶20，V∶V)，示差檢測器，流速1 mL/min，檢測池溫度40 ℃，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL[19]。

酸組分及含量的測定：用液氮將果實(shí)研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g，加入3 mL 0.04 mol/L的KH2PO4，超聲20 min，常溫6 000 r/min離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜過濾待測[20]。色譜柱MZ PerfectSil Target C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相4%甲醇水溶液，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL[20]。

1.3.2 糖酸代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的分析 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成：參照改良CTAB法提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，核酸蛋白儀檢測RNA濃度。cDNA第一鏈的合成參照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)NCBI上棗的全基因組序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)有機(jī)酸代謝相關(guān)基因的引物，糖代謝引物及內(nèi)參基因引物序列參考張春梅[21](表1)。采用TOYOBO熒光定量試劑盒(THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Without ROX)在定量PCR儀(Bio-Rad，USA)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。UBQ為內(nèi)參基因，反應(yīng)總體積10 μL，包含：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Without ROX 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL和無RNA酶水3.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，Tm 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)水平用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt表示。以上所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，每次試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中的糖酸積累

2.1.1 可溶性糖組分及含量的動(dòng)態(tài)分析 “蜀脆棗”發(fā)育過程中總糖含量大致呈逐漸上升趨勢，成熟期達(dá)到最大值146.83 mg/g(圖1)。果糖和葡萄糖含量相當(dāng)，為14.66.47～27.48 mg/g，發(fā)育過程中變化平穩(wěn)，約占發(fā)育前中期總糖的80%。白熟期蔗糖含量迅速上升，并在成熟期上升至最大值107.43 mg/g，約占總糖的73%。

誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示同一組分不同花后時(shí)間在0.05水平上差異顯著。下同

2.1.2 有機(jī)酸組分及含量的動(dòng)態(tài)分析 “蜀脆棗”總酸含量隨果實(shí)發(fā)育整體呈現(xiàn)“W”型的變化趨勢，花后48 d達(dá)到峰值6.67 mg/g(圖2)?！笆翊鄺棥钡挠袡C(jī)酸組分主要有3種，其含量和變化趨勢均不一致。蘋果酸含量最高，呈上升-下降-上升趨勢，成熟期達(dá)3.30 mg/g，占總酸的 65.74%。檸檬酸含量次之，呈“W”型趨勢，成熟期含量為1.56 mg/g，占總酸的31.08%。酒石酸發(fā)育過程中變化不大，且含量最低，成熟期含量為0.16 mg/g，僅占總酸的3.19%。

圖2 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸組分及含量Fig.2 Components and contents of tartaric acid, citric acid, and malic acid during development of “Shucuizao” fruits

2.2 糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.2.1 蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)模式各不相同(圖3)。Zj SS1和Zj SS2在花后20 d的表達(dá)最高，隨果實(shí)發(fā)育整體逐漸下降；Zj SS3的表達(dá)在成熟期達(dá)峰值。Zj SPS1、Zj SPS2和Zj SPS4的表達(dá)整體呈先上升后下降的趨勢，均于花后83 d達(dá)到最大值。Zj nINV1、Zj vINV2和Zj cINV3在幼果期和膨大期有高表達(dá)，Zj vINV2在白熟期以后幾乎不表達(dá)。

圖3 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.3 Analysis of relative genes expression in sucrose metabolism during development of “Shucuizao” fruits

2.2.2 己糖代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析 己糖代謝相關(guān)基因在“蜀脆棗”果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期存在差異表達(dá)(圖4)。Zj HK1、Zj HK5的表達(dá)在幼果期最高，隨果實(shí)發(fā)育下調(diào)，成熟期的表達(dá)最低。Zj HK3、Zj HK6、Zj UGP、Zj FK2的表達(dá)整體呈上升-下降-上升趨勢。Zj FK4的表達(dá)隨果實(shí)成熟先上升后略微下降。

2.3 果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.3.1 蘋果酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析 “蜀脆棗”蘋果酸代謝相關(guān)基因在不同發(fā)育時(shí)期有不同的表達(dá)模式(圖5)。Zj NADP-ME1的表達(dá)量在成熟期最低；Zj NADP-ME4的表達(dá)呈現(xiàn)“M”型趨勢。MS在果實(shí)發(fā)育前中期表達(dá)較低，于成熟期急劇上調(diào)。Zj MDH1、Zj MDH4的表達(dá)在成熟期最高。Zj FUM的表達(dá)量在花后69 d達(dá)峰值。Zj PEPC1在幼果期和膨大期的表達(dá)量較高，隨后下調(diào)，在成熟期略微上調(diào)；Zj PEPC4的表達(dá)量在花后20 d最低。Zj PEPCK1-1在果實(shí)發(fā)育中期幾乎不表達(dá)，成熟期的表達(dá)量最高。

2.3.2 檸檬酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸代謝相關(guān)基因有不同的表達(dá)模式(圖6)。Zj ATP-CS2和Zj ATP-CS3的表達(dá)整體呈先上升后下降趨勢，均在花后34 d表達(dá)量最高。Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2、Zj NADP-IDH2、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1隨果實(shí)成熟大致上升-下降-上升，在幼果期的表達(dá)量均最低。

圖6 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.6 Analysis of relative genes expression in critic acid metabolism during development of “Shucuizao” fruits

2.4 果實(shí)糖酸含量與代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析

2.4.1 糖含量與其代謝基因的相關(guān)性 表2是“蜀脆棗”17個(gè)糖代謝基因表達(dá)量與可溶性糖含量的相關(guān)系數(shù)。果糖含量與Zj nINV1、Zj cINV3、Zj HK1呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，與Zj SPS4、Zj HK2、Zj HK6、Zj UGP呈顯著或極顯著正相關(guān)。Zj SS1、Zj nINV1、Zj cINV3與葡萄糖含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj HK2、Zj HK6、Zj UGP呈顯著或極顯著正相關(guān)。蔗糖含量與Zj SS2、Zj vINV2、Zj HK1、Zj HK2、Zj HK5、Zj FK4表達(dá)量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2極顯著正相關(guān)。

表2 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中糖含量與其代謝基因的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between sugar content and its metabolism gene during development of “Shucuizao” fruits

2.4.2 有機(jī)酸含量與其代謝基因的相關(guān)性 表3為“蜀脆棗”17個(gè)有機(jī)酸代謝基因表達(dá)量與有機(jī)酸含量的相關(guān)系數(shù)。酒石酸含量與Zj NADP-ME1、Zj PEPCK1-1、Zj ATP-CS2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj PEPC1呈顯著正相關(guān)。檸檬酸含量與Zj NADP-ME1、Zj NADP-ME4、Zj ATP-CS2、Zj ATP-CS3表達(dá)量呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，而與Zj MS、Zj PEPCK1-1、Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2呈顯著正相關(guān)。蘋果酸含量與Zj PEPC1、Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1表達(dá)量呈極顯著或顯著正相關(guān)。

表3 “蜀脆棗”果實(shí)發(fā)育過程中酸含量與其代謝基因的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between organic acid content and its metabolism gene during development of “Shucuizao” fruits

3 討 論

在本研究中，“蜀脆棗”幼果期和膨大期主要積累果糖和葡萄糖，成熟期主要積累蔗糖，與‘金鈴圓棗’成熟期主要積累己糖不一致[22]?！笆翊鄺棥庇袡C(jī)酸主要由蘋果酸、檸檬酸和酒石酸組成，蘋果酸含量始終最高，與‘梨棗’等一致[23]?！笆翊鄺棥睂僬崽?、蘋果酸積累型的優(yōu)質(zhì)鮮食棗。

糖代謝由多基因綜合調(diào)控，SS調(diào)控果糖合成蔗糖，葡萄糖在HK、UGP和SPS作用下合成蔗糖，INV調(diào)控蔗糖降解成果糖和葡萄糖[24-25]。本試驗(yàn)中，Zj nINV1、Zj cINV3與果糖和葡萄糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，果實(shí)發(fā)育中后期INV的表達(dá)下調(diào)致使果糖和葡萄糖合成減少；ZjHK2、Zj HK6和Zj UGP與果糖和葡萄糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，果實(shí)發(fā)育后期其表達(dá)量較低或變化不大，致使果糖和葡萄糖降解減少，兩方面結(jié)合導(dǎo)致果糖和葡萄糖含量變化不大。MdHK1的上調(diào)表達(dá)顯著促進(jìn)了富士蘋果葡萄糖轉(zhuǎn)化[26]，與本研究不一致，推測是不同種類的果實(shí)糖代謝相關(guān)基因差異表達(dá)的結(jié)果。“蜀脆棗”白熟期以后蔗糖迅速積累，Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2迅速上調(diào)，且與蔗糖含量極顯著正相關(guān)；Zj vINV2幾乎不表達(dá)，與蔗糖呈顯著負(fù)相關(guān)。果實(shí)發(fā)育后期Zj SS3、Zj SPS1和Zj SPS2的高表達(dá)與Zj vINV2的低表達(dá)協(xié)同促進(jìn)蔗糖的快速積累。本研究結(jié)果與蔣爽等[27]研究結(jié)果一致，但與Zj SS3表達(dá)促進(jìn)‘駿棗’‘灰棗’和‘冬棗’果實(shí)還原糖積累的研究結(jié)果[15]相反，推測是不同品種間的糖代謝差異所致。蔗糖的迅速積累是“蜀脆棗”糖代謝的基礎(chǔ)，Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2和Zj vINV2是糖代謝關(guān)鍵基因。

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，草酰乙酸經(jīng)MDH催化生成蘋果酸，草酰乙酸與乙酰輔酶A經(jīng)CS催化形成檸檬酸，運(yùn)輸至液泡，檸檬酸又被Aco可逆催化形成異檸檬酸，NADP-IDH促進(jìn)異檸檬酸合成α-酮戊二酸，NAD-IDH則催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸[28]。CS的高表達(dá)促進(jìn)西瓜[29]、碰柑[30]和酸棗[21]果實(shí)中的檸檬酸積累。本試驗(yàn)中，成熟期Zj PEPCK1-1、ZjMS、Zj CS3、Zj NAD-IDH1-2的高表達(dá)共同促進(jìn)果實(shí)檸檬酸含量上升。Zj PEPCK1-1與檸檬酸含量相關(guān)性最強(qiáng)，是調(diào)控“蜀脆棗”檸檬酸代謝的關(guān)鍵基因?；ê?8～55 d和花后90 d 的Zj PEPC1、Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1高表達(dá)協(xié)同促進(jìn)了蘋果酸高水平積累。Zj PEPC1與蘋果酸含量相關(guān)性最強(qiáng)，是影響蘋果酸含量變化的主要因素。但馬倩倩[31]認(rèn)為Zj PEPC對(duì)酸棗中蘋果酸的代謝調(diào)控作用不大，推測果實(shí)種類的不同是造成這種差異的主要因素。蘋果酸含量是“蜀脆棗”總酸積累的主要因素，Zj PEPC1對(duì)“蜀脆棗”有機(jī)酸代謝起主導(dǎo)作用，Zj PEPC4、Zj NAD-IDH1-1、Zj Aco2-1、Zj NADP-IDH1起輔助作用。

4 結(jié) 論

“蜀脆棗”發(fā)育前期以積累果糖和葡萄糖為主，隨后蔗糖迅速積累，成為成熟期的主要糖組分；蘋果酸含量在發(fā)育過程中始終最高，其次是檸檬酸，酒石酸含量最低?！笆翊鄺棥惫麑?shí)發(fā)育過程中糖酸代謝相關(guān)基因表達(dá)模式存在差異，相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控共同影響果實(shí)的糖酸積累。Zj SS3、Zj SPS1、Zj SPS2和Zj vINV2是調(diào)控果實(shí)糖代謝的關(guān)鍵基因，Zj PEPC1是影響有機(jī)酸代謝的主要因素。