何丹娟，梁少榮，陳碧娟

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院中西醫(yī)結(jié)合科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院生殖中心，湖北 武漢 430000)

反復(fù)自然流產(chǎn)是常見的人類生殖疾病，發(fā)病率呈上升趨勢，給女性身心健康造成嚴(yán)重影響[1]。反復(fù)自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，母胎免疫耐受與母胎界面免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切，母胎免疫耐受機(jī)制在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[2-3]，此外，輔助性T細(xì)胞Th1/Th2平衡在免疫微環(huán)境的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可能參與母胎免疫耐受[4]。因此，探討反復(fù)自然流產(chǎn)母胎界面免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制，并尋找有確切療效的藥物具有重要臨床意義。中醫(yī)藥在反復(fù)自然流產(chǎn)的臨床治療中有重要地位。反復(fù)自然流產(chǎn)屬“滑胎”范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎氣不固、腎精虧虛、氣血兩虛、陰血損耗是其主要病機(jī)[5-6]。固腎養(yǎng)陰湯是根據(jù)反復(fù)自然流產(chǎn)病機(jī)、臨床辨證論治原則，總結(jié)壽胎丸與安奠二天湯化裁而成，該方由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生等中藥組成，具有固腎養(yǎng)陰安胎之功效。本研究旨在探討固腎養(yǎng)陰湯對反復(fù)自然流產(chǎn)模型小鼠母胎界面Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/c小鼠6只，均為7周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自華中科技大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2019-0009。

1.2 藥物 固腎養(yǎng)陰湯組方為菟絲子(批號2011002S)15 g，續(xù)斷(批號2009001S)、補(bǔ)骨脂(批號2005001S)、山茱萸(批號2009001C)、阿膠(批號1903005C)各10 g，桑寄生(批號1910001S)、黃芪(批號2006008C)各20 g，杜仲(批號1912002C)、生地黃(批號2007012C)各12 g，枸杞子(批號2006004S)、黃芩(批號2008004C)各9 g，上述藥物均購自合肥華潤三九醫(yī)藥有限公司，經(jīng)湖北省婦幼保健院梅凌峰主管藥師鑒定為正品。所有中藥混合，水煎2次，合并藥液煎煮制成生藥量為1 g/mL的濃煎液，4 ℃保存?zhèn)溆?。黃體酮膠囊(益瑪欣，國藥準(zhǔn)字H20041902，規(guī)格50 mg，批號20200106)購自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.3 試劑 小鼠IFN-γ、IL-10 ELISA試劑盒(滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司，貨號SND-M010、SND-M195)；實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號RR820A、RR037Q)；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號23225)；兔抗小鼠細(xì)胞因子信號傳遞抑制因子SOCS1、SOCS3一抗(英國Abcam公司，貨號ab280886、ab280884)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司，貨號WK355-FOV)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計和合成。

2 方法

2.1 分組與建模 參考文獻(xiàn)[7]方法，60只雌性CBA/J小鼠按照體質(zhì)量排序法隨機(jī)分為正常組、模型組、黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組、中西藥合用組，每組12只。正常組雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，其余各組雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，次日清晨檢出陰栓或陰道分泌物涂片見精子則建模成功，為孕0 d。正常組12只、模型組10只、黃體酮組10只、固腎養(yǎng)陰湯組11只、中西藥合用組11只建模成功入組。

2.2 給藥方法 根據(jù)臨床等效劑量換算[8]黃體酮給藥劑量為0.4 mg/kg，固腎養(yǎng)陰湯給藥劑量為28 g/kg。黃體酮組小鼠灌胃給予0.4 mg/kg黃體酮(蒸餾水稀釋)，固腎養(yǎng)陰湯組小鼠灌胃給予28 g/kg固腎養(yǎng)陰湯，中西藥合用組小鼠同時灌胃給予0.4 mg/kg黃體酮和28 g/kg固腎養(yǎng)陰湯，正常組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，孕0～15 d連續(xù)給藥。

2.3 流產(chǎn)情況及組織取材 孕15 d處死各組小鼠，剖腹取完整子宮組織，記錄吸收胚胎數(shù)和正常胚胎數(shù)，正常胚胎大小均一，肉眼可見紅色條索狀胎盤；吸收胚胎大小不均一，子宮呈黑色或紫褐色。計算胚胎吸收率，公式為胚胎吸收率=吸收胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。取胎盤組織(含蛻膜組織)，部分置于40%中性甲醛中固定48 h備用；部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 母胎界面組織病理形態(tài)觀察 取固定于40%中性甲醛中的胎盤組織，常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm的連續(xù)切片，然后行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察母胎界面組織病理形態(tài)改變情況。

2.5 ELISA法檢測白細(xì)胞介素10(IL-10)、γ干擾素(IFN-γ)水平 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質(zhì)量后剪碎，按照子宮組織與磷酸鹽緩沖液質(zhì)量比1∶9加入磷酸鹽緩沖液，于冰上勻漿，預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取勻漿上清液，采用ELISA法并根據(jù)試劑盒說明書操作，檢測IL-10、IFN-γ水平，于490 nm處檢測光密度值，計算待測樣本濃度。

2.6 母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達(dá)檢測 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質(zhì)量后采用Trizol法[9]提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測總RNA純度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定；反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA，以之為模板鏈進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min；以GAPDH為內(nèi)參對照，按照2-△△CT法[10]計算SOCS1、SOCS3表達(dá)。引物序列為SOCS1正向5′-ACACGTAGGTGCTAGTG-3′，反向5′-CCTAGCTGCTATG CTGA-3′；SOCS3正向5′-GCTGCTGATATGCTGAT-3′，反向5′-ATGCTGATGTCGTGATC-3′；GAPDH正向5′-GGATGCTG ATGTCGTAGCA-3′，反向5′-TAGCTGTAGCTGTAGTCGT-3′。

2.7 母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)檢測 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質(zhì)量后置于液氮中研磨，加入RIPA裂解液冰上孵育25 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液測定蛋白總量。取50 μg待測蛋白與等量上樣緩沖液混勻，沸水水浴10 min變性，于80 V/120 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜上，加入脫脂奶粉封閉2 h，充分洗膜，加入1∶200 SOCS1，1∶400 SOCS3一抗，4 ℃搖床過夜；充分洗膜，加入1∶1 000稀釋二抗，37 ℃孵育1 h；充分洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光液顯影，掃描拍照后，圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值代表蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 胚胎吸收率 正常組、模型組、黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組、中西藥合用組胚胎吸收率分別為(5.50±1.24)%、(28.54±3.29)%、(21.26±3.57)%、(17.41±3.20)%、(12.85±2.72)%，與正常組比較，模型組小鼠胚胎吸收率升高(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組和中西藥合用組小鼠胚胎吸收率均降低，并且中西藥合用組<固腎養(yǎng)陰湯組<黃體酮組(P<0.05)。

3.2 各組小鼠母胎界面組織病理形態(tài)改變 正常組蛻膜細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，血管豐富，絨毛形態(tài)正常；模型組小鼠蛻膜細(xì)胞變性，部分壞死，蛻膜細(xì)胞連接喪失，血管較少，絨毛形態(tài)不一，排列紊亂，多量炎性細(xì)胞浸潤；黃體酮組小鼠蛻膜組織中血管稍增多；固腎養(yǎng)陰湯組和中西藥合用組小鼠蛻膜組織、絨毛形態(tài)明顯改善，血管更為豐富，中西藥合用組改善最為明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠母胎界面組織病理形態(tài)(HE，×100)

3.3 各組小鼠母胎界面勻漿上清液中IL-10、IFN-γ水平 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面勻漿上清液中IFN-γ水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面勻漿上清液IFN-γ水平均降低，IL-10、IL-10/IFN-γ水平升高，且各指標(biāo)活性強(qiáng)度表現(xiàn)為中西藥合用組>固腎養(yǎng)陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表1。

3.4 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達(dá) 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面組織中SOCS1 mRNA表達(dá)升高，SOCS3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面組織中SOCS1 mRNA表達(dá)均降低，SOCS3 mRNA表達(dá)均升高，且各指標(biāo)活性強(qiáng)度表現(xiàn)為中西藥合用組>固腎養(yǎng)陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表2。

表1 各組小鼠母胎界面勻漿上清液中IL-10、IFN-γ水平

表2 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達(dá)

3.5 各組小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面組織中SOCS1蛋白表達(dá)升高，SOCS3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養(yǎng)陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面組織中SOCS1蛋白表達(dá)均降低，SOCS3蛋白表達(dá)均升高，且各指標(biāo)活性強(qiáng)度表現(xiàn)為中西藥合用組>固腎養(yǎng)陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)

圖2 小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白Western blot條帶圖

4 討論

反復(fù)自然流產(chǎn)由遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素交互作用而致，但仍有50%左右原因不明[11-12]。臨床常用激素類藥物治療，但效果尚不理想[13]。母胎界面免疫微環(huán)境失調(diào)與反復(fù)自然流產(chǎn)關(guān)系密切，改善母胎界面免疫微環(huán)境誘導(dǎo)母胎免疫耐受，對提高妊娠成功率有重要意義[14]。

中醫(yī)藥歷史悠久，古今中醫(yī)藥典籍中有許多診治滑胎的方略，安胎療效確切[15-16]。固腎養(yǎng)陰湯由《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的壽胎丸和《傅青主女科》中的安奠二天湯結(jié)合而來，方中含菟絲子、續(xù)斷等11味中藥，多味藥相互配合，達(dá)到固腎養(yǎng)陰、健母益胎的功效。

本研究中黃體酮、固腎養(yǎng)陰湯單獨(dú)及聯(lián)合給藥后，反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠胚胎吸收率降低，母胎界面蛻膜組織病理改變有所改善，IFN-γ水平降低，IL-10水平、IL-10/IFN-γ比值升高，組織中SOCS1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)升高，且各指標(biāo)活性強(qiáng)度表現(xiàn)為中西藥合用組>固腎養(yǎng)陰湯組>黃體酮組，說明黃體酮和固腎養(yǎng)陰湯均能改善母胎界面免疫微環(huán)境，抑制SOCS1，促進(jìn)SOCS3轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且聯(lián)合用藥效果最好。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒對于母體屬于非己抗原，母體識別抗原則產(chǎn)生免疫應(yīng)答，母體通過調(diào)控免疫平衡產(chǎn)生免疫耐受則胎兒順利植入胎盤，否則易排斥胎兒造成流產(chǎn)[17]。Th1/Th2免疫平衡在母胎界面胚胎植入過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子可從多方面影響胚胎植入，如IFN-γ可下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)表達(dá)而使胎盤受到機(jī)體免疫攻擊；IFN-γ的細(xì)胞毒作用可破壞胎盤結(jié)構(gòu)，同時可促進(jìn)黃體細(xì)胞凋亡導(dǎo)致孕酮水平降低[18-19]。Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10、IL-4可抑制機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，具有Th1負(fù)性調(diào)節(jié)作用[20]。藥理學(xué)研究表明，滋陰藥對過亢免疫反應(yīng)具有抑制作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[21]。菟絲子等藥物中含有類雌激素，利于促黃體生成素釋放激素的釋放及卵巢對其反應(yīng)性[22]。Mesaki等[23]發(fā)現(xiàn)，SOCS家族分子具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，與機(jī)體免疫，尤其是與Th1/Th2免疫平衡關(guān)系密切。SOCS1具有抑制Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子的作用，但過度表達(dá)可抑制Th2細(xì)胞分化使Th1/Th2平衡向Th1偏移[24]。

綜上所述，固腎養(yǎng)陰湯有利于改善反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠母胎界面免疫微環(huán)境，聯(lián)合西藥改善效果更佳，維持母胎界面Th1/Th2平衡的Th2型優(yōu)勢，調(diào)控SOCS1、SOCS3表達(dá)，利于胎兒免疫耐受，改善妊娠結(jié)局，為臨床反復(fù)自然流產(chǎn)的防治提供理論基礎(chǔ)。