黃泓軻羅健瑋冉華

（1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，四川 樂山614000； 2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，四川 樂山614000；3.重慶市黔江中心醫(yī)院心內(nèi)科，重慶409000）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種病因復(fù)雜的慢性疾病，內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展過程［1］。藥物治療是動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)心血管疾病的主要治療手段之一，因此有必要篩選有效的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，并探討其作用機(jī)制，尋找敏感的靶點(diǎn)［2］。阿魏酸鈉是傳統(tǒng)活血化瘀類中藥當(dāng)歸、川芎等的主要成分，具有抗細(xì)胞凋亡、抑制血小板聚集、抗血栓形成等作用［3］。阿魏酸鈉通過抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路能夠有效降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用［4］，阿魏酸鈉還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［5］。核因子-κB（NF-κB）信號通路參與炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激等過程，其可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［6］，抑制NF-κB p65 信號通路激活可減弱內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［7］。阿魏酸鈉可通過抑制NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位減輕缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用［8］。沉默miR-136-5p通過靶向標(biāo)IκB 激酶β（IKKβ）調(diào)控NF-κB 信號通路改善大鼠脊髓損傷［9］。因此，用ox-LDL 損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.HY926 建立體外細(xì)胞模型，研究阿魏酸鈉通過miR-136-5p 調(diào)控NF-κB 信號通路對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.HY926 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。阿魏酸鈉（純度＞98%）購自北京索萊寶科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone 公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）購自上海澤葉生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司。Transwell 小室、Matrigel 購自美國BD 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞處理與分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.HY926 培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，待細(xì)胞融合至90% 左右時(shí)進(jìn)行傳代。用50 μg／mL ox-LDL 誘導(dǎo)EA.HY926 細(xì)胞模擬動(dòng)脈粥樣硬化模型，為ox-LDL 組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；分別用25、50、100 μmol／L 阿魏酸鈉和50 μg／mL ox-LDL 處理EA.HY926，為不同濃度阿魏酸鈉組。將miR-NC、miR-136-5p、anti-miR-NC、anti-miR-136-5p 轉(zhuǎn)染至EA.HY926 細(xì)胞中，再用50 μg／mL ox-LDL 處理，分別記為miR-NC＋ox-LDL 組、miR-136-5p＋ox-LDL 組、anti-miR-NC＋ox-LDL 組、anti-miR-136-5p ＋ox-LDL 組；將miR-NC、miR-136-5p 轉(zhuǎn)染至EA.HY926 細(xì)胞中，用50 μg／mL ox-LDL 和50 μmol／L 阿魏酸鈉處理，分別記為阿魏酸鈉＋miR-NC＋ox-LDL 組、阿魏酸鈉＋miR-136-5p＋ox-LDL 組。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450 nm 波長處的光密度值（OD），以O(shè)D值表示細(xì)胞活性。

2.3 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 收集各組細(xì)胞，取200 μL 接種于Transwell 小室上層，培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯鏡下拍照并計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)除用Matrigel 包被Transwell 小室上室外，其余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

2.4 Western blot 法檢測Ki67、MMP2、MMP9、p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行定量，將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，洗膜，用ECL 發(fā)光液顯影，成像，用Quantity One 軟件測定蛋白條帶的灰度值。

2.5 RT-qPCR 檢測miR-136-5p表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，擴(kuò)增條件為95 ℃30 s，60 ℃35 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)。以U6 為內(nèi)參，miR-136-5p正向引物序列 5′-ACTCCATTTGTTTTG ATGATG-3′，反向引物序列 5′-GCTGTCAACGATACGC TACGTAAC-3′；U6 正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞Ki67 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活性降低（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，不同濃度阿魏酸鈉處理組Ki67 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 各組內(nèi)皮細(xì)胞Ki67 蛋白表達(dá)

表1 不同濃度阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（， n＝9）

表1 不同濃度阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL 組比較，＃P＜0.05。

3.2 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較，ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表2 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表2 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL 組比較，＃P＜0.05。

3.3 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)的影響 與對照組比較，ox-LDL 組ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)升高（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，50 μmol／L阿魏酸鈉＋ox-LDL 組ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)降低（P＜0.05），見表3。

表3 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p 表達(dá)的影響（， n＝9）

表3 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p 表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL 組比較，＃P＜0.05。

3.4 miR-136-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響 與miR-NC＋ox-LDL 組比較，miR-136-5p＋ox-LDL組內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)升高，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活性降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC ＋ox-LDL 組比較，anti-miR-136-5p ＋ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)降低，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05），見圖3、表4。

圖3 miR-136-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲和蛋白表達(dá)的影響

表4 miR-136-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表4 miR-136-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與miR-NC＋ox-LDL 組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC＋ox-LDL 組比較，＃P＜0.05。

3.5 miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的作用 與miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL 組比較，miR-136-5p＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL組內(nèi)皮細(xì)胞miR-136-5p表達(dá)升高，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活性降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05），見圖4、表5。

表5 miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表5 miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL 組比較，*P＜0.05。

圖4 miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲和蛋白表達(dá)的影響

3.6 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，50 μmol／L阿魏酸鈉＋ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與miR-NC＋ox-LDL 組比較，miR-136-5p＋ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL 組比較，miR-136-5p＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL 組內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖5、表6。

圖5 各組內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)

表6 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)的影響（， n＝9）

表6 阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL 組比較，＃P＜0.05；與miR-NC＋ox-LDL 組比較，△P＜0.05；與miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸鈉＋ox-LDL組比較，＆P＜0.05。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是引起多種心腦血管疾病的主要原因，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能性障礙是動(dòng)脈粥樣硬化形成第一步，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷是防治動(dòng)脈粥樣硬化的途徑之一［10］。阿魏酸鈉能夠緩解同型半胱氨酸導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［11］，也可通過下調(diào)趨化因子配體1（CXCL1）基因表達(dá)對ox-LDL 損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用［12］。阿魏酸鈉治療冠心病患者有較好的效果，可以有效保護(hù)血管內(nèi)皮功能［13］。本研究顯示，阿魏酸鈉處理后，內(nèi)皮細(xì)胞Ki67 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加，表明阿魏酸鈉可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，對ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

miRNA 參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化形成、發(fā)展的病理生理過程，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能［14］。利帕舒地爾可通過上調(diào)miR-136-5p 減輕RPE 細(xì)胞的炎癥損傷［15］。miR-136-5p 對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未明確。本研究顯示，抑制miR-136-5p 表達(dá)后，ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中Ki67 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)升高，表明抑制miR-136-5p 表達(dá)可促進(jìn)ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。阿魏酸鈉可下調(diào)miR-136-5p 表達(dá)；而過表達(dá)miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)了阿魏酸鈉對ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。提示，阿魏酸鈉可能通過下調(diào)miR-136-5p 表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

NF-κB 信號通路在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用［16］。miR-98 可能通過負(fù)性調(diào)控NF-κB 信號通路抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化早期血管內(nèi)皮損傷［17］。甲基蓮心堿通過抑制NF-κB 信號通路，減輕脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而抗動(dòng)脈粥樣硬化［18］。吐根堿通過抑制NF-κB 信號通路能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力［19］。本研究顯示，阿魏酸鈉處理后，內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)降低，表明阿魏酸鈉可抑制NFκB 信號通路。而過表達(dá)miR-136-5p后，內(nèi)皮細(xì)胞p-p65、p-IкBα 蛋白表達(dá)升高，表明過表達(dá)可激活NF-κB 信號通路；且過表達(dá)miR-136-5p 逆轉(zhuǎn)了阿魏酸鈉對p-p65、p-IкBα蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，阿魏酸鈉可能通過下調(diào)miR-136-5p 表達(dá)抑制NF-κB 信號通路，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。