鐘輝 劉亞軍 王濱花 和夢潔 吳蘭

（1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031；2. 南昌大學(xué) 鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330031）

微生物是地球上數(shù)量最多、物種和功能多樣性最高的生物，廣泛分布于自然環(huán)境中，維持著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)［1-2］。16S rRNA基因具有高度的保守性及特異性，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、組成和多樣性的研究［3-4］。隨著測序技術(shù)在環(huán)境微生物組學(xué)方面的大量應(yīng)用，人們對高通量測序數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可比性提出了更高的要求。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，受16S rRNA基因序列高變區(qū)的保守程度不同，測定不同高變區(qū)會(huì)顯著影響細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，其中V3-V4區(qū)特異性好，數(shù)據(jù)庫信息全，是目前細(xì)菌多樣性分析注釋的常用選擇［5］。此外，測序通量的大小也是影響細(xì)菌群落信息的重要因素，例如，Illumina MiSeq之所以逐漸取代了最初的454 GS Junior（Roche）測序平臺(tái)，正是由于Illumina MiSeq具有較高的測序通量，測序結(jié)果能夠更為精準(zhǔn)的反應(yīng)龐雜的微生物群落特征。除了測序片段和平臺(tái)，測序深度也是影響可獲得微生物群落信息的重要影響因素，較低的測序深度會(huì)導(dǎo)致一些低豐度物種的信息丟失［6-8］。然而，以往的研究多集中在上機(jī)測序過程，而對于海量的下機(jī)數(shù)據(jù)，不同的處理方式也可能會(huì)影響最終的分析結(jié)果，尤其是最小分類單元的劃分越來越受到科研工作者重視［9-10］。

最小分類單元是指將16S rRNA基因擴(kuò)增序列按特定的相似性閾值分配到操作分類單位中（例如OTU）［11］。最初，由于可比對的數(shù)據(jù)信息有限，將獲得的基因序列按照97%相似性進(jìn)行聚類分析，確定最小分類單元，這在一定程度上掩蓋PCR及測序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，同時(shí)簡化了基因序列的分析。97%的相似性閾值仍然是當(dāng)前最小分類單元最常用的劃分方式［9］。然而，隨著16S rRNA基因測序的廣泛應(yīng)用、相關(guān)數(shù)據(jù)庫的不斷完善，有研究認(rèn)為將序列相似性閾值提升到98%［12］。99%［13］甚至100%［14］，可以更準(zhǔn)確反應(yīng)微生物群落的真實(shí)信息。此外，通過DADA2模型算法可以糾正PCR和測序過程中的錯(cuò)誤，并將去重復(fù)后得到的單核苷酸變體（ASV）作為最小分類單元［15］，該劃分方式也越來越多地用于環(huán)境微生物組學(xué)的分析。

目前，關(guān)于環(huán)境微生物的研究主要集中在其多樣性、組成以及與環(huán)境的協(xié)同進(jìn)化上［16］。微生物群落作為一個(gè)整體，其多樣性與組成不僅能夠直接表征環(huán)境生物的物種遺傳信息，還在一定程度上體現(xiàn)其在自然環(huán)境中扮演的重要生態(tài)功能差異［17］?？紤]到微生物的多功能性和對環(huán)境變化的高敏感性，探索影響其時(shí)空變化特征的環(huán)境變量，成為當(dāng)前微生物生態(tài)學(xué)研究的重要方向。然而，目前在細(xì)菌基因序列分析過程中，對于最小分類單元?jiǎng)澐址椒ǎ嬖诙喾N方法并行的奇特研究現(xiàn)狀［18］。而不同分類單元?jiǎng)澐址绞綄?xì)菌群落16S分析結(jié)果的影響，尤其是對細(xì)菌群落多樣性、組成以及其與環(huán)境因子關(guān)系的影響仍待進(jìn)一步探究?；诖?，我們選擇了5個(gè)不同生境下的微生物群落樣本，在Illumina MiSeq平臺(tái)上對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測序。我們同時(shí)采用97%、98%、99%、100%相似性聚類OTU和非聚類的ASV方法對測序結(jié)果進(jìn)行分析，以評估不同分類單元?jiǎng)澐址绞綄ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)以及多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

為了評估不同分類分辨率方法對微生物菌群組成和多樣性的影響，選擇5種生境下的環(huán)境樣品進(jìn)行研究，分別是森林土壤（FS）、濕地土壤（WS）、農(nóng)田土壤（CS）、湖泊沉積物（LS）和湖泊水體（LW）樣本。在每種生境下選擇4個(gè)樣地進(jìn)行樣品采集，每個(gè)樣地采集3個(gè)重復(fù)，共計(jì)60個(gè)樣本。將采集好的土壤樣品低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分裝和預(yù)處理。對于土壤樣品，一部分土樣自然風(fēng)干供理化性質(zhì)分析；一部分保存在-80℃用于DNA提取測序分析。對于水體樣品，理化指標(biāo)在樣品帶回實(shí)驗(yàn)室24 h 內(nèi)進(jìn)行測定；同時(shí)取1 L 水樣通過微孔濾膜（孔徑0.22 mm）進(jìn)行抽濾，濾膜-80℃保存用于DNA提取測序分析。

所有樣本的pH、TOC（總有機(jī)碳）、TN（總氮）、TP（總磷）、NH+-N（氨態(tài)氮）、NO3--N（硝態(tài)氮）的測定參照劉亞軍等［19］描述的方式（表1-2）。使用PowerSoil DNA 提取試劑盒提取了樣本中的總微生物 DNA［20］。使用超微量分光光度計(jì)檢驗(yàn) DNA 的濃度以及純度，通過用通用細(xì)菌引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增16S rRNA 基因序列的V3-V4區(qū)來構(gòu)建擴(kuò)增子文庫。合格的文庫被送往派森諾（上海）有限公司通過Illumina Miseq 2500平臺(tái)（2×300 bp）進(jìn)行測序。原始測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為森林 土壤（PTJNA388530）、濕地土壤（PRJNA559977）、農(nóng)田土壤（PRJNA329019）、湖泊沉積物（PRJNA632434）和湖泊水體（PRJNA528375）。

表1 土壤和沉積物樣本信息表及環(huán)境參數(shù)Table1 Information and environmental parameters of soil and sediment samples

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)序列分析 使用QIIME2（v2020.11）［21］平臺(tái)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，不同生境的樣本單獨(dú)進(jìn)行分析。首先使用cutadapt［22］插件切除序列兩端的引物片段，引物切除時(shí)設(shè)置最大堿基差異率為15%，最低序列長度為225 bp（300×75%），引物去除后的序列分別按以下方式分別進(jìn)行分析得到4個(gè)OTU數(shù)據(jù)集以及一個(gè)ASV數(shù)據(jù)集。

表2 水體樣本信息表及環(huán)境參數(shù)Table2 Water samples information and environmental parameters

1.2.2 序列分析 OTU數(shù)據(jù)集構(gòu)建：分別使用Vsearch［23］插 件 的join-pairs、quantity-filter、dereplicate-sequences模塊對去除引物的雙端序列進(jìn)行拼接、質(zhì)控和去冗余。處理過程中除以下參數(shù)外均使用默認(rèn)參數(shù)：拼接設(shè)置最小重疊區(qū)域（minovlen）為15 bp，重疊區(qū)域最大堿基差異（maxdiffs）為3 bp；質(zhì)量控制設(shè)置滑動(dòng)窗口（quality-window）為30 bp，質(zhì)量閾值（min-quality）為20。再通過Vsearch插件cluster-feature-de-novo模塊對非冗余序列按97%、98%、99%以及100%的相似性閾值聚類，得到4個(gè)不同聚類閾值的分類操作單元數(shù)據(jù)集（后文按聚類閾值簡稱97 OTU、98 OTU、99 OTU以及100 OTU數(shù)據(jù)集），并過濾掉reads數(shù)為1的OTU。

ASV數(shù)據(jù)集構(gòu)建：使用dumx summarize插件對去引序列的堿基質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并按照序列的質(zhì)量分布情況，使用DADA2［15］插件對序列進(jìn)行質(zhì)控、糾錯(cuò)以及嵌合體的去除（處理過程中除截?cái)嚅L度設(shè)置為260/240 bp外均采用默認(rèn)參數(shù)），最后得到單核苷酸序列變體（ASV）數(shù)據(jù)集。

1.2.3 物種注釋 將各數(shù)據(jù)集的代表序列使用Silva 138數(shù)據(jù)庫［24］的16S序列預(yù)先訓(xùn)練的樸素貝葉斯分類器［25］進(jìn)行物種注釋，而后根據(jù)注釋結(jié)果去除線粒體、葉綠體以及非細(xì)菌序列。使用MAFFT［26］算法對數(shù)據(jù)集的代表序列進(jìn)行對齊，使用FASTTREE［27］軟件構(gòu)建了各數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹。以樣地序列數(shù)最低樣本為基準(zhǔn)，分別對各生境下的所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行抽樣，而后使用q2-diversity插件進(jìn)行了細(xì)菌群落的α和β多樣性分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析都是在R（v.4.0.3）中使用vegan［28］，stats以及multcomp［29］軟件包完成，可視化則是通過ggplot2［30］軟件包完成。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著性均在α = 0.05的水平上確定。

為了評估不同分類分辨率是否會(huì)顯著影響群落的α多樣性，使用方差分析（ANOVA）以及Tukey多重檢驗(yàn)鑒定了不同分類分辨率數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育多樣性（Faith’s PD指數(shù)）和物種多樣性指數(shù)（Chao1及Shannon）的差異?；谌郝銪ray-curtis距離進(jìn)行的主坐標(biāo)分析（PCoA）以及多元方差分析（PERMANOVA）評估樣本間群落的差異性和相似性。此外，還通過冗余分析（RDA）量化了環(huán)境因子對不同分類分辨率下群落結(jié)構(gòu)變化的解釋程度［9］。

2 結(jié)果

2.1 不同分類分辨率對細(xì)菌群落α多樣性的影響

微生物群落的α多樣性體現(xiàn)了群落內(nèi)物種多樣性以及豐度。我們選擇最為常用的Chao1、Shannon以及PD指數(shù)用來表征細(xì)菌群落α多樣性，所有細(xì)菌群落α多樣性均是在最小分類單元（OTU或者ASV）上進(jìn)行（表3）。研究發(fā)現(xiàn)，所有生境下OTU數(shù)據(jù)集的Shannon和Chao1指數(shù)均受最小分類單元?jiǎng)澐址绞降娘@著影響（P ＜ 0.05），隨著分類分辨率［9］（分類單元的精細(xì)程度）的上升而上升，表現(xiàn)為100 OTU ＞ 99 OTU ＞ 98 OTU ＞ 97 OTU。而PD指 數(shù) 受OTU數(shù)據(jù)集分類分辨率的影響較小，僅在濕地土壤中有顯著差異，表現(xiàn)為98 OTU（135.4 ± 20.4）最高，其次是97 OTU（131.8 ± 20）和99 OTU（131.7 ± 21），而100 OTU（112.2 ± 17.6）最低。

表3 細(xì)菌群落的α多樣性Table 3 Alpha diversity of bacterial community

值得注意的是，所有生境下基于ASV分類水平所得的Chao1指數(shù)均顯著低于基于OTU分類方法得到的Chao1指數(shù)（P ＜ 0.05）。而對于Shannon指數(shù)，單從數(shù)值上看，所有生境下ASV數(shù)據(jù)集的Shannon指數(shù)大小均介于97 OTU和100 OTU之間。ASV數(shù)據(jù)集的PD指數(shù)和Chao1指數(shù)類似，在數(shù)值上均低于OTU數(shù)據(jù)集，且在森林和濕地土壤中差異顯著（P ＜ 0.05）。總之，提高OTU數(shù)據(jù)集的分類分辨率，可以獲得更高的Shannon和Chao1指數(shù)，而ASV劃分方法會(huì)在一定程度上降低Chao1和PD（系統(tǒng)發(fā)育多樣性）指數(shù)。

2.2 不同分類分辨率對群落組成的影響

為了研究不同分類單元?jiǎng)澐址绞綄?xì)菌群落組成的影響，同時(shí)在門和屬水平對物種的相對豐度進(jìn)行了單因素方差分析（ANOVA）。結(jié)果表明，在門水平（圖1-A），不同分類分辨率對濕地土壤、農(nóng)田土壤、湖泊沉積物和湖泊水體樣本的物種組成（門水平）無顯著影響（P ＞ 0.05），僅對森林土壤中Armatimonadota和Bdellovibrionota的相對豐度有顯著影響（P ＜ 0.05）。其中Bdellovibrionota的相對豐度隨著分類分辨率（OTU數(shù)據(jù)集）的上升而下降，同時(shí)基于ASV分析方法注釋得到的豐度最低。隨著分類分辨率的上升，Armatimonadota并未表現(xiàn)出規(guī)律性變化，其在99 OTU中相對豐度最高，而基于ASV分析方法并未注釋出相應(yīng)的門。

進(jìn)一步并將有顯著差異（P ＜ 0.05）的門/屬的豐度（不同劃分方式下該門/屬相對豐度的均值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，相對于門水平，更多的注釋屬受到分類單元?jiǎng)澐址椒ǖ挠绊懀ū?和圖1）。具體而言，在不同的分類單元?jiǎng)澐址绞较拢?、濕地、農(nóng)田、湖泊沉積物和水體樣品中分別有75（2.9%）、30（0.35%）、38（3.21%）、15（14.9%）和18（1.32%）個(gè)屬的相對豐度存在顯著差異（P ＜ 0.05）。進(jìn)一步對豐度較高（top10）差異屬的分析發(fā)現(xiàn)，湖泊沉積物的Vibrionimonas（11.4%）是相對豐度最高的差異屬，其相對豐度隨分類分辨率上升而下降，而ASV方法注釋的豐度與100 OTU近似。除Vibrionimonas外，其他差異屬的相對豐度均較低（小于0.2%），它們在不同樣地中表現(xiàn)出不一樣的規(guī)律，例如，農(nóng)田土壤和湖泊水體OTU數(shù)據(jù)集中的WWE3并不會(huì)隨分類分辨率的變化而發(fā)生改變，而ASV方法注釋得到的相對豐度顯著高于OTU數(shù)據(jù)集；森林和濕地土壤中g(shù)_0319_6G20的相對豐度隨分類分辨率上升而下降，而ASV注釋的豐度最低；Bdellovibrio在濕地土壤中的豐度會(huì)隨分類分辨率的上升而下降，ASV則近似于100 OTU，但在森林土壤中表現(xiàn)為98 OTU ＞ 97 OUT ＞ 99 OTU ＞ 100 OTU ＞ ASV?？偠灾?，分類方法的改變對于門水平的物種豐度影響較小，更多的影響體現(xiàn)在屬水平，大多數(shù)受影響的屬均不屬于優(yōu)勢屬（top100），且在不同生境下受影響的模式可能并不一致。

表4 最小分類單元?jiǎng)澐址椒▽?xì)菌群落門和屬水平物種豐度的影響Table 4 Effects of the minimum taxonomy unit division method on the abundances of bacterial community phylum and genus

圖1 最小分類單元?jiǎng)澐址椒▽?xì)菌群落門（A）和屬（B）相對豐度的影響Fig.1 Effects of the minimum taxonomy unit division method on the relative abundance of bacteria community phylum（A）and genus（B）

2.3 不同分類方法對微生物群落β多樣性的影響

基于不同分類分辨率間可比較的最低分類組成（屬水平）進(jìn)行聚類分析（圖2-A）和主坐標(biāo)分析（PCoA，圖2-B）。聚類分析表明，在同一生境類型下，同一樣地不同分類分辨率所得的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為接近（圖2-A）。其中98 OTU和99 OTU聚在一起，ASV和100 OTU注釋的分類群更為接近。類似的，主坐標(biāo)分析也發(fā)現(xiàn)，同一生境下不同樣地（S1、S2、S3和S4）的細(xì)菌群落沿第一軸分開（圖2-B）。值得注意的是，最小分類單元的劃分對細(xì)菌群落也造成了一定的影響，使得同一細(xì)菌群落在不同的分類分辨率下沿第二軸依次排列。為進(jìn)一步分析最小分類單元的劃分方式對細(xì)菌群落β多樣性的影響，我們計(jì)算了生境下各樣本間的Bray- Curtis距離指數(shù)，并通過ANOVA（單因素方差分析）和Tukey（事后多重檢驗(yàn)）檢驗(yàn)了各分辨率間β多樣性的差異（圖3-C）。分析發(fā)現(xiàn)所有生境下OTU數(shù)據(jù)集的β多樣性均隨著分類分辨率的上升而上升，表現(xiàn)為100 OTU ＞ 99 OTU ＞ 98 OTU ＞ 97 OTU。值得注意的是，ASV分類方法得到了較高的β多樣性（圖3-C），與100 OTU無顯著差異（P ＞ 0.05）。總而言之，提高分類分辨率會(huì)提升群落的β多樣性，但對整體群落間的差異影響較小。

圖2 基于細(xì)菌群落（屬水平）bray-curtis距離的β多樣性分析Fig.2 Analysis of β diversity based on the bacterial community（genus level）bray-curtis dissimility

2.4 不同分辨率下的微生物群落與環(huán)境因子的 聯(lián)系

通過OTU/ASV水平的微生物群落組成與6個(gè)環(huán)境因子（pH、TOC、TN、TP、NH4+-N和NO3--N）的RDA（冗余分析）分析發(fā)現(xiàn)，隨著分類分辨率的上升，環(huán)境因子對OTU數(shù)據(jù)集的解釋度逐漸增加，表現(xiàn)為100 OTU ＞ 99 OTU ＞ 98 OTU ＞ 97 OTU。此外，基于ASV分析方法得到的數(shù)據(jù)結(jié)果也與環(huán)境因子有較高的匹配度，在所有生境下均高于99 OTU（圖3-A）。進(jìn)一步對環(huán)境因子的貢獻(xiàn)度進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)（圖3-B），在所有生境下97、98和99 OTU各因子的貢獻(xiàn)排序一致，不同于100 OTU和ASV的分析結(jié)果。比如，在濕地土壤中，97、98和99 OTU數(shù)據(jù)集中，影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最主要的環(huán)境因子是TN，而100 OTU和ASV的分析結(jié)果是pH。對于農(nóng)田土壤，97、98和99 OTU的分析結(jié)果認(rèn)為NO3--N對細(xì)菌群落的影響要大于TP和TOC，而100 OTU和ASV的分析結(jié)果則相反。類似的，對于湖泊沉積物和水體樣品，NH4+-N對細(xì)菌群落的重要性也受到不同分析方法的影響。然而，在森林土壤中，分類方法的變化不會(huì)影響環(huán)境因子的相對次序。總而言之，隨著分類分辨率的上升，環(huán)境因子對微生物群落組成變化的解釋力也逐漸提高。同時(shí)，受最小分類單元?jiǎng)澐址绞降挠绊?，在探究?xì)菌群落驅(qū)動(dòng)因素時(shí)，不同環(huán)境因子的相對重要性可能會(huì)發(fā)生改變。

圖3 環(huán)境因子對不同分類分辨率數(shù)據(jù)集的群落組成變異的解釋程度 Fig.3 Variation of community composition explained by environment factors in different taxonomy resolution dataset

3 討論

α多樣性常用于表征群落中的個(gè)體總數(shù)、物種數(shù)目、物種均勻性以及系統(tǒng)發(fā)育的進(jìn)化廣度等生物學(xué)信息［31］?；谖锓N數(shù)目和物種豐度獲得Chao1和Shannon指數(shù)，是目前最常用的微生物群落α多樣性指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著分類分辨率提升，Shannon和Chao1指數(shù)會(huì)顯著上升，但對PD多樣性指數(shù)的影響較小（表3）。在Chao1和Shannon指數(shù)的計(jì)算 中，物種的數(shù)目有較大權(quán)重，而OTU分類分辨率的上升會(huì)增加最小分類單元的數(shù)目，因而較高的分類分辨率往往有更高的Shannon和Chao1指數(shù) 值［10，32］。此外，有研究認(rèn)為，提高分類分辨率有利于我們發(fā)現(xiàn)一些難以檢測到的低豐度物種，然而較高的分類分辨率（如100 OTU）可能無法排除PCR和測序錯(cuò)誤，進(jìn)而高估微生物多樣性［33-34］。與Shannon和Chao1指數(shù)不同，PD多樣性指數(shù)基于序列的相似性［35］，在本研究中，OTU數(shù)據(jù)集分辨率提升產(chǎn)生的OTU代表序列與更低分辨率的OTU代表序列的差異較?。ㄐ∮?%），分類分辨率的變化對系統(tǒng)發(fā)育多樣性影響并不顯著。ASV數(shù)據(jù)集的Chao1和PD指數(shù)顯著低于OTU，但Shannon指數(shù)與97 OTU沒有顯著差異，這表明Shannon指數(shù)在不同的分類方法之間更趨于一致。與OTU聚類不同，ASV的劃分并不是不按照序列相似性進(jìn)行聚類，而是通過錯(cuò)誤概率模型對可能存在的測序錯(cuò)誤進(jìn)行糾正，這在一定程度上減少了假陽性序列［18］。此外，兩種方法使用不同的嵌合體過濾方法，這也可能是導(dǎo)致ASV與OTU數(shù)據(jù)集多樣性指數(shù)差異的原因［36］。ASV數(shù)據(jù)集的Chao1以及PD指數(shù)顯著低于OTU，但Shannon指數(shù)介于97 OTU以及100 OTU之間，表明從OTU方法轉(zhuǎn)到ASV方法，稀有物種所受的影響更大［37-38］。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在多樣性較低的（LS、LW）樣地ASV數(shù)據(jù)集與97 OTU、98 OTU和99 OTU數(shù)據(jù)集中Shannon和PD指數(shù)并沒有顯著差異，這表明在多樣性較低的樣地中ASV方法和OTU方法都能較好地估計(jì)群落的豐富度［18］。總而言之，對下機(jī)數(shù)據(jù)（堿基序列）最小分類單元的劃分方式會(huì)影響細(xì)菌群落α多樣性的最終分析結(jié)果。

群落的物種組成是環(huán)境微生物群落研究的另一個(gè)重要方面，不同組成的微生物群落往往行使著不同的生態(tài)功能［39］。目前，環(huán)境中微生物群落組成的研究主要是基于門（較高的分類學(xué)水平）和屬（較低的分類學(xué)水平）。我們的研究發(fā)現(xiàn)不同的分類方法對較高的分類學(xué)水平（門水平）的物種組成影響較小，更多的差異體現(xiàn)在較低的分類學(xué)水平（屬水平），并且在不同的生境中的差異模式并不一致。這表明分類方法的變化會(huì)影響基于屬水平的分析結(jié)果，尤其是一些低豐度的屬（＜ 0.2%）。而最近的研究發(fā)現(xiàn)稀有種屬在生態(tài)功能發(fā)揮中起著重要的作用，越來越多的人關(guān)注于稀有物種在群落中的作用［40］。例如，在本研究的森林土壤的差異屬中，Paenibacillus具有促進(jìn)植物生長、固氮以及磷酸鹽溶解等功能，是一種具有廣泛運(yùn)用前景的農(nóng)作物促生菌［41-42］，而 Conexibacter可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在生態(tài)修復(fù)等方面具有重要的作用［43-44］。濕地土壤與湖泊水體中的差異屬M(fèi)ethylorosula是廣泛分布于濕地中的一種甲基營養(yǎng)菌，是濕地甲烷排放的重要物種［45］。因此，未來對于低豐度物種的分析，要更加注重最小分類單元的劃分方式帶來的差異。此外，無論是不同聚類閾值的OTU還是ASV都是希望從種水平重建微生物的分類，當(dāng)我們在較高的分類學(xué)水平分析樣地間細(xì)菌群落組成差異時(shí)，分類方法并不會(huì)造成太大的影響。

β多樣性常用來量化群落間物種組成差異，對于理解物種多樣性的時(shí)空變化和群落組成的機(jī)制至關(guān)重要［46］。在本研究中，提高分類分辨率水平更有利于體現(xiàn)不同細(xì)菌群落間的差異。Li等［33］認(rèn)為，分類分辨率的提升（從97%轉(zhuǎn)到99%）會(huì)使得群落的組成進(jìn)一步細(xì)化，從而增大了群落間的差異，這在一定程度上可以幫助我們更好的區(qū)分不同的微生物群落。然而，值得注意的是不同樣地間的差異大小對于群落β多樣性對分類分辨率變化的響應(yīng)有一定的影響。例如，在β多樣性變化幅度較大的湖泊沉積物生境下，分類方法的變化并不會(huì)顯著影響β多樣性，但在群落組成更為接近的農(nóng)田土壤中，分類分辨率會(huì)顯著影響其β多樣性。這意味著在一些變量梯度均勻的實(shí)驗(yàn)（例如精準(zhǔn)的模擬控制實(shí)驗(yàn)）中，更易于受到最小分類單元?jiǎng)澐址绞降挠绊憽?/p>

微生物對環(huán)境條件的變化十分敏感，能夠更加迅速的對環(huán)境變化做出響應(yīng)，其群落動(dòng)態(tài)可以在一定程度上表征生態(tài)系統(tǒng)功能的變化［20，47］。RDA（冗余分析）常被用來分析環(huán)境對微生物群落驅(qū)動(dòng)影響。然而，我們的研究發(fā)現(xiàn)最小分類單元的劃分方式會(huì)影響環(huán)境因子對細(xì)菌群落變化的解釋度，表現(xiàn)為更高分類分辨率具有更好解釋度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在多樣性更高的樣地（FS、WS和CS）中，ASV劃分方式相比于OTU的劃分方式往往與環(huán)境因子有較好的擬合效果，表明ASV方法可以捕捉到更為準(zhǔn)確的群落信息?；诖耍覀兺茰y對多樣性高的樣本（如土壤）更宜采用ASV的劃分方式對細(xì)菌群落進(jìn)行探索。而在多樣性較低的樣地（LS和LW）OTU方法也能夠捕捉群落的復(fù)雜性。Li等［33］的研究也表明，分類分辨率的提升使得群落組成進(jìn)一步細(xì)分，能夠捕捉到更多的群落變異，從而使得它們能夠在排序分析中可以更好地被區(qū)分，這與我們的結(jié)論相印證。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同最小分類單元的劃分方式，往往會(huì)改變特定環(huán)境因子的相對重要性。例如，基于100 OTU和ASV 劃分方式的結(jié)果表明pH是影響濕地土壤細(xì)菌群落組成最重要的環(huán)境因子，與An等［48］的研究結(jié)論一致。而基于較低分類分辨率 （97%，98%和99%）的分析結(jié)果認(rèn)為造成細(xì)菌群落組成差異最主要的因素是土壤TN，表明最小分類單元的劃分方式會(huì)影響環(huán)境因子對群落組成相對貢獻(xiàn)的結(jié)果。因而，為了能夠得出更為穩(wěn)健的生物學(xué)結(jié)論，未來可能需要同時(shí)對下機(jī)數(shù)據(jù)（基因序列）進(jìn)行多種最小分類單元的劃分，采用更多種（如RDA和Mantel等）關(guān)聯(lián)性分析手段分析環(huán)境因子與微生物群落之間的聯(lián)系。

4 結(jié)論

通過對比分析不同最小分類單元?jiǎng)澐址绞较?6S rRNA基因擴(kuò)增測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高分類分辨率能夠提高群落的α多樣性（Chao1和Shannon指數(shù)）和β多樣性，同時(shí)影響一些低豐度類群（屬水平）的組成。此外，還發(fā)現(xiàn)分辨率的提升會(huì)提升環(huán)境因子對群落組成變化的解釋度，因而對于物種信息更為復(fù)雜的環(huán)境樣品（如土壤）建議采用ASV劃分方式。