于新友，李天芝，王金良，姚春陽，沈志強* (.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600；.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬后可引起非洲豬瘟(African swine fever，ASF)，該病是一種烈性、高度接觸性傳染病[1]。臨床表現(xiàn)為豬高熱、嘔吐、皮膚出血、血便[2]，死亡豬剖檢可見內(nèi)臟各器官廣泛出血[3]。ASV于2018年8月首次在我國沈陽某豬場被檢出[4]，至今在我國豬場流行已近3年時間，臨床有變異毒株出現(xiàn)，病毒毒力變?nèi)?，豬場疫情逐漸緩和，一些豬場出現(xiàn)感染豬病死率低的現(xiàn)象[5]。豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員[6]，感染豬后可引起圓環(huán)病毒病，在世界豬群中廣泛流行，臨床表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙、腸炎等[7]。PCV2是一種免疫抑制性病原，可導(dǎo)致豬免疫抑制[8]。PCV2可與多種病原混感，病原對外界環(huán)境抵抗力強，能耐受多種消毒劑，豬群一旦發(fā)病，很難從豬群中清除，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[9]。

疫苗中外源病毒污染不僅影響疫苗的有效性，給接種動物造成巨大的安全隱患，還可能會引起嚴重的生物安全問題[10]，因此，一定要重視活疫苗中外源病毒的污染情況，保證使用純凈合格的疫苗。防止ASFV污染主要依賴生物安全和檢測，最核心的就是防止病原通過人員、物料、車輛、生物制品等外來物品攜帶進場，因此，ASFV是當(dāng)前進場疫苗的必檢項目之一。疫苗生產(chǎn)中用到的胰酶多為豬源材料制備，發(fā)生PCV2污染的幾率很高。疫苗成品中不應(yīng)帶有ASFV、PCV2等外源病毒污染，這2種外源病毒為成品疫苗出廠前或使用前必須檢驗的項目。亟需開發(fā)一種快速檢測試劑盒，以滿足實際疫苗快速品控需求。

熒光PCR 已作為一種快速、靈敏、便宜的檢測方法被廣泛使用，與傳統(tǒng)PCR檢測比，敏感性高，反應(yīng)后不需要通過電泳檢測PCR產(chǎn)物，減少了實驗室發(fā)生氣溶膠污染的風(fēng)險。因此熒光PCR檢驗可作為生物制品外源病毒的一種檢驗手段。目前同時檢測ASFV和PCV2 2種病原的雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR方法未見報道。為提升檢測效率，本試驗建立了一種能快速檢測ASFV和PCV2的雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株和檢測樣品含ASFV和PCV2特異性基因片段的質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF1由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成；豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒(從市售滅活疫苗中采用氯仿抽提獲得)等由本實驗室保存；偽狂犬病活疫苗樣品為從市場購買的不同廠家生產(chǎn)的不同批次產(chǎn)品。

1.2 主要試劑和儀器SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒購自百泰克生物科技公司；MyGo Pro熒光PCR擴增儀購自青島巴菲特生物公司。

1.3 引物設(shè)計與合成從GenBank中下載ASFV p72和PCV2 ORF1的基因序列，用分子生物學(xué)軟件DNAStar進行分析，根據(jù)保守部分設(shè)計特異性引物，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.4 病原核酸的提取按試劑盒說明書提取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒等病原的核酸，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立和優(yōu)化將ASFV的干粉狀引物F1、R1 和PCV2的干粉狀引物F2、R2，分別用無菌超純水稀釋至15 μmol/L。按SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，總體積為20 μL，其中2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，模板質(zhì)粒pMD-p72 1 μL、質(zhì)粒pMD-ORF1 1 μL，不斷調(diào)整優(yōu)化引物在反應(yīng)體系中的加入量，用超純水補足20 μL。以超純水為模板的陰性對照，混勻后置于MyGo Pro熒光PCR擴增儀中。設(shè)定反應(yīng)程序，分別以50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60℃等不同退火溫度進行擴增反應(yīng)。

1.6 靈敏度檢測將合成的模板質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，置于LB液體培養(yǎng)液中，37℃溫箱振蕩培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒。測定濃度和純度后，分別將質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF1 10倍比系列梯度稀釋，作為模板加入到熒光PCR反應(yīng)體系中，用建立的雙重?zé)晒釶CR方法進行擴增。

1.7 特異性試驗將1.6中稀釋后的同濃度梯度質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF1等體積混合制備混合質(zhì)粒pMD-p72/ORF1。分別以質(zhì)粒pMD-p72、pMD-ORF1、pMD-p72/ORF1以及提取豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒等病原的核酸為模板，用建立的雙重?zé)晒釶CR方法進行擴增，檢驗方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗分別選取1.6中梯度稀釋質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF 的3種稀釋度樣品為模板，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，分別進行雙重?zé)晒釶CR檢測，對熔解曲線Tm值進行分析，計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.9 干擾性試驗為驗證同一反應(yīng)體系中模板濃度高的樣本是否干擾濃度低樣本的擴增效果，將質(zhì)粒pMD-p72和pMD-ORF1按不同濃度配比組合(5.6×105和3.2×101copies/μL；5.6×101和3.2×106copies/μL；5.6×107和3.2×102copies/μL)，組成質(zhì)?；旌弦?，用建立的ASFV和PCV2雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR方法進行擴增。

1.10 臨床樣品采集與檢驗每瓶豬偽狂犬病毒活疫苗用2 mL生理鹽水進行稀釋，取1 mL疫苗以12 000 r/min離心2 min，取上清為模板，用建立的雙重?zé)晒釶CR方法進行檢測，并同時以國家標準GB/T 18648-2020規(guī)定的和中華人民共和國獸藥典三部(2015年版)中提供的ASFV和PCV2的標準檢測方法進行檢測，比較分析其檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 引物的篩選通過大量試驗，初步篩選出可同時檢測ASFV和PCV2的引物組合，引物信息見表1。

表1 引物和探針序列及相關(guān)信息

2.2 雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立和優(yōu)化PCR加樣反應(yīng)體系優(yōu)化后，確立了體系中引物的最適加入量：20 μL反應(yīng)體系中F1 0.7 μL、R1 1.0 μL、F2 0.8 μL和R2 1.5 μL；優(yōu)化退火溫度后確立的最佳退火溫度為54℃；確立的熒光PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性5 s，54℃退火20 s (此處收集熒光)，40個循環(huán)。擴增結(jié)束后，進行熔解曲線分析，步驟為以0.1℃/s的速率升溫至97℃，連續(xù)收集熒光，繪制產(chǎn)物的熔解曲線(圖1)。

1.質(zhì)粒標準品模板；2.陰性對照圖1 雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)熔解曲線分析

2.3 靈敏度檢測測定質(zhì)粒pMD-p72的濃度為5.6×109copies/μL，10倍比梯度稀釋后，進行熒光PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果顯示，對質(zhì)粒pMD-p72的最低檢測限度為5.6 copies/μL。測定質(zhì)粒pMD-p72的濃度為3.2×109copies/μL，10倍比梯度稀釋后，進行熒光PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果顯示對質(zhì)粒pMD-p72的最低檢測限度為3.2 copies/μL。

2.4 特異性試驗用建立的雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR方法進行檢測，結(jié)果顯示，質(zhì)粒pMD-p72有特異性峰，Tm值為(83.16±0.5)℃，質(zhì)粒pMD-ORF1有特異性峰，Tm值為 (80.12±0.5)℃，質(zhì)粒pMD-p72/ORF1有雙峰，Tm值分別為(83.16±0.5)和(80.12±0.5)℃。豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒等核酸均無(83.16±0.5)或(80.12±0.5)℃特異性Tm值(圖2)，表明所建方法特異性良好，與其他病原基因無交叉擴增反應(yīng)。

1.質(zhì)粒pMD-p72/ORF1；2.質(zhì)粒pMD-p72；3.質(zhì)粒pMD-ORF1；4～9.分別為豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和口蹄疫病毒圖2 雙重?zé)晒釶CR擴增特異性

2.5 重復(fù)性試驗質(zhì)粒pMD-p72稀釋后選取5.6×105，5.6×103，5.6×101copies/μL 3種不同濃度，每種濃度重復(fù)3次，進行雙重?zé)晒釶CR檢測。質(zhì)粒pMD-ORF1稀釋后選取3.2×105，3.2×103，3.2×101copies/μL等3種不同的濃度，每種濃度重復(fù)3次，進行雙重?zé)晒釶CR檢測。記錄所檢測樣品Tm值，分別計算組內(nèi)變異系數(shù)(CV)及組間變異系數(shù)。結(jié)果顯示，2組質(zhì)粒組內(nèi)和組間變異系數(shù)均不超過于1%，表明方法具有良好的重復(fù)性(表2)。

表2 熒光PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 干擾性試驗2種高低不同濃度的質(zhì)粒組合在同一PCR擴增體系中進行雙重?zé)晒釶CR檢測時，依然能檢測出低濃度質(zhì)粒樣本，結(jié)果不受高濃度質(zhì)粒干擾，表明所建方法適合臨床混合樣本中低濃度樣本檢測。

2.7 臨床樣品檢測對收集的14份疫苗樣本，采用建立的雙重?zé)晒釶CR進行檢測，結(jié)果顯示ASFV陽性樣本0份，PCV2陽性樣本0份。同時參照相關(guān)國家標準GB/T 18648-2020規(guī)定和中華人民共和國獸藥典規(guī)定的檢測方法進行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的雙重?zé)晒釶CR方法與這些檢測的結(jié)果完全一致。

3 討論

疫苗生產(chǎn)中需要用到細胞、血清、胰蛋白酶等動物源性材料，存在外源病毒污染的風(fēng)險。傳統(tǒng)外源病毒檢測方法操作繁瑣，費時、費力，亟需開發(fā)疫苗中外源病毒快速、簡單的檢測方法[11]。熒光PCR方法具有檢測速度快、敏感性高、操作簡便等特點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各病原檢測。熒光PCR方法可分為染料法和探針法2種，與探針法熒光PCR方法相比，染料法不需要合成昂貴的探針，研發(fā)成本低。染料法與探針法相比對，引物要求更高，雙重PCR方法對引物的挑選更為嚴格，也是建立方法的關(guān)鍵。與探針法熒光PCR不同，染料法擴增結(jié)束后增加了一步熔解曲線分析，隨溫度升高，一半擴增產(chǎn)物發(fā)生解鏈時的熔解溫度為Tm峰值，每個峰值代表不同產(chǎn)物。通過對Tm峰值的差別進行分析，可實現(xiàn)病原的多重檢測，且對熒光PCR儀器要求低，通用性好。目前尚無檢測ASFV和PCV2的雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測方法。

ASFV基因組是雙鏈DNA，大小為170～190 kb，p72基因保守性好，在是ASFV分子檢測常選用的靶基因[12]。ORF1基因編碼PCV2復(fù)制相關(guān)蛋白，保守性好，是PCV2分子檢測常選用靶基因。本試驗建立的同時檢測ASFV和PCV2的雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR方法，僅需40 min即可完成2種病原的快速篩查。雙重?zé)晒釶CR檢測方法能否成功建立，引物的設(shè)計非常關(guān)鍵，本試驗通過大量引物篩選初步找到4條能用的引物，引物退火溫度相近，引物之間不相互干擾，優(yōu)化了各引物加入量，檢測結(jié)果與單重?zé)晒釶CR一致，但可降低成本，減少繁瑣的加樣步驟。ASFV和PCV2的特異性Tm峰值分別為 (83.16±0.5)和(80.12±0.5)℃，方法特異性好，不與豬常見病原發(fā)生交叉反應(yīng)。對ASFV和PCV2的最低檢測限度為5.6和3.2 copies/μL。選取不同濃度ASFV和PCV2質(zhì)粒樣本測試，結(jié)果顯示所建方法具有良好重復(fù)性，2組質(zhì)粒模板的Tm值組內(nèi)和組間變異系數(shù)均不超過于1%。應(yīng)用雙重?zé)晒鈾z測14份偽狂犬活疫苗樣品，同時參照相關(guān)國家標準GB/T 18648-2020和中華人民共和國獸藥典規(guī)定的檢測方法進行檢測，檢測結(jié)果完全一致，但可節(jié)約時間，減少費用，提高檢測效率。不同試劑和不同儀器擴增同一目標產(chǎn)物的Tm值可能會不同，有的偏差較大。本試驗中2種病原的Tm值是使用現(xiàn)有的試劑盒和儀器得到的，但2種產(chǎn)物的Tm值差數(shù)不變。2種不同目標產(chǎn)物的Tm值雖有波動，但不超過1℃，而且2種產(chǎn)物的Tm值差在2℃以上，因此，可以在同一管中檢測并區(qū)分ASFV和PCV2。本研究所建ASFV和PCV2雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR方法可用于這2種病原的快速檢測，為疫苗中外源病毒的快速檢測提供了一種簡便的方法。