王銀龍，嚴(yán) 靜，王廣澤，張 玥，汪培嘉，許小琴 (揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

滲出性肺炎(exudative pneumonia，EP)是肺炎的一種，病理變化以肺泡腔及支氣管大量的炎性滲出為主，并常伴有肺泡、肺間質(zhì)及支氣管的充血、出血等，是多種肺部疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，夏平凡[1]認(rèn)為，EP的形成與水通道蛋白(aquaporin，AQPs)及黏蛋白(MUC5AC)的表達(dá)關(guān)系密切。為探討AQPs體系與EP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，諸多研究人員陸續(xù)報(bào)道了通過滴鼻、手術(shù)氣管滴入、氣管彌散等攻菌方式用肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae,KP)制備大鼠肺炎模型，取得了較好的效果，為肺炎疾病的研究做出了重要的貢獻(xiàn)[2-5]。然而，單用KP 1周2次滴鼻，需要8周以上才能成模，雖然手術(shù)時(shí)間較短，但對(duì)環(huán)境、設(shè)備、人員等條件要求高，而且其不能很好的模擬自然性肺炎的發(fā)病過程。童明慶等[6]在建立小鼠肺炎克雷伯桿菌性肺炎模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果提前給予小鼠腹腔注射一定量的氫化可的松和環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑，可大大提高小鼠肺炎模型的穩(wěn)定性，并減少所需造模時(shí)間。據(jù)報(bào)道，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，可作用于目標(biāo)細(xì)胞膜的TLR4受體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成動(dòng)物機(jī)體免疫力明顯降低[7-8]。為模擬臨床疾病特征，簡(jiǎn)化造模方法，縮短造模時(shí)間，本研究采用低劑量LPS腹腔注射后，每天以低劑量KP雙側(cè)滴鼻5 d的方法建立大鼠EP模型，檢測(cè)大鼠的臨床和病理變化，探究該造模方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只體質(zhì)量(200±10)g的6周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(26±2)℃，相對(duì)濕度為(60±10)%，自然光照，自由采食和飲水。

1.2 主要試劑KP購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保藏于獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CVCC4080；LPS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；AQP3抗體、AQP5抗體、MUC5AC抗體、熒光標(biāo)記的二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器EPOCH-M491酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；RM-2016組織切片機(jī)、MC-15光學(xué)顯微鏡、TCSSP8STED超高分辨率共聚焦顯微成像系統(tǒng)，德國(guó)Lecia公司產(chǎn)品；Western Blot-6000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法將50只大鼠隨機(jī)分為A組(高劑量，H-KP)、B組(低劑量，L-KP)、C組(LPS)、D組(LPS+L-KP)、E組(Con)，每組10只。適應(yīng)性飼喂3 d。D組：于試驗(yàn)第1天腹腔注射2 mg/kg LPS，其后，連續(xù)5 d鼻腔滴注接種50 μL 1×107CFU/mL KP菌液；A組：于試驗(yàn)第2天開始，鼻腔滴注接種50 μL 1×109CFU/mL KP菌液，連續(xù)5 d；B組：于試驗(yàn)第2天開始，鼻腔滴注接種50 μL 1×107CFU/mL KP菌液，連續(xù)5 d；C組：于試驗(yàn)開始第1天腹腔注射2 mg/kg LPS；E組：于試驗(yàn)第2天開始，鼻腔滴注50 μL PBS溶液，連續(xù)5 d。各組均在造模結(jié)束后3 d(72 h)處死，試驗(yàn)分組及處理見表1。

表1 試驗(yàn)分組及處理

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1臨床癥狀 觀察大鼠整體狀態(tài)，記錄大鼠出現(xiàn)咳嗽、噴嚏等呼吸道癥狀的時(shí)間；體溫：采用電子溫度計(jì)測(cè)量肛溫；呼吸頻率：大鼠安靜狀態(tài)，以腹部起伏1次計(jì)1次呼吸數(shù)，計(jì)時(shí)1 min，每組計(jì)3次，取平均數(shù)。

1.5.2炎性指標(biāo) 攻菌結(jié)束后，用過量戊巴比妥鈉溶液麻醉，剖開腹腔，腹腔靜脈采血并分裝至EDTA抗凝管和離心管，分別留作白細(xì)胞計(jì)數(shù)和IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子測(cè)定；每組隨機(jī)選擇3只大鼠(選擇的大鼠不再用于肺組織采樣)，剖開頸部皮膚，暴露氣管，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，用4 mL PBS反復(fù)沖洗肺組織3～5次，收集1 mL灌洗液分裝至2個(gè)離心管，分別留作IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子測(cè)定。

1.5.3剖檢及病理組織切片觀察 打開大鼠胸腔，觀察肺部組織病理變化，取出肺組織置于10%多聚甲醛中固定36 h，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.4MUC5AC表達(dá)檢測(cè) 選擇1.5.3制作的石蠟切片，進(jìn)行免疫組織熒光染色，在超高分辨率共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.5.5AQP3、AQP5表達(dá)檢測(cè) 打開大鼠胸腔，取右肺組織，通過Western blot檢測(cè)組織中AQP3、AQP5的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)結(jié)果以采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠臨床癥狀觀察結(jié)果攻毒結(jié)束后，A、B、C、D造模組大鼠均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，具體表現(xiàn)：造模結(jié)束后，D組大鼠體溫極顯著高于E組(P<0.01)，并且顯著高于B、C組(P<0.05)(圖1A)； D組大鼠每分鐘呼吸數(shù)極顯著高于E組(P<0.01)，并且極顯著高于B組(P<0.01)(圖1B)；D組從第攻毒第3天有大鼠出現(xiàn)咳嗽，至造模結(jié)束共有8只大鼠出現(xiàn)明顯的咳嗽癥狀，占總數(shù)8/10，高于A組的3/10、B組的2/10、C組的0/10、D組的0/10(圖1C)。

A.處死前體溫；B.每分鐘呼吸次數(shù)；C.出現(xiàn)咳嗽癥狀的大鼠個(gè)數(shù)。與E組相比，*示 P<0.05，**示P<0.01;與D組相比，#示P<0.05；##示P<0.01。下同圖1 不同造模方法對(duì)大鼠臨床癥狀的影響(n=10)

2.2 大鼠炎性指標(biāo)測(cè)定結(jié)果攻毒結(jié)束后，A、B、C、D造模組大鼠炎性指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的變化，具體表現(xiàn)：造模結(jié)束后，D組大鼠白細(xì)胞總數(shù)極顯著高于E組(P<0.01)，其中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著高于E組(P<0.05)(圖2A)；D組大鼠血清中IL-6表達(dá)量顯著高于E組(P<0.05)(圖2B)；D組大鼠肺泡灌洗液中IL-6表達(dá)量顯著高于E組(P<0.05)，且顯著高于C組(P<0.05)；IL-1β表達(dá)量顯著高于E組(P<0.05)；TNF-α表達(dá)量極顯著高于E組(P<0.01)，且顯著高于A、B、C組(P<0.05)，(圖2C)。

A.白細(xì)胞及3分類計(jì)數(shù)；B.血清中IL-6表達(dá)量；C.肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量圖2 不同造模方式對(duì)大鼠炎性指標(biāo)的影響(n=10)

2.3 剖檢及病理切片觀察結(jié)果剖檢結(jié)果顯示：A組有2只大鼠肺部組織可見充血點(diǎn)，右肺中葉可見明顯壞死灶；B組有1只大鼠肺部組織可見紋理增粗現(xiàn)象；C組7只大鼠肺部組織無明顯病理變化；D組有6只大鼠肺部組織可見充血、出血點(diǎn)，右肺中葉可見明顯壞死灶，其中3只左肺下葉尖、右肺上葉、右肺下葉尖可見明顯的充血區(qū)域；E組7只大鼠肺組織均完整，結(jié)構(gòu)清晰，呈水粉色。病理組織切片顯示：A組大鼠肺部組織可見支氣管管壁增厚、管腔狹窄，肺泡腔內(nèi)大量的炎性滲出；B、C組大鼠肺組織支氣管粘膜及肺泡結(jié)構(gòu)完整，C組大鼠可見支氣管內(nèi)壁增厚現(xiàn)象； D組大鼠肺組織可見支氣管粘膜斷裂，部分柱狀上皮細(xì)胞脫落，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂大小不一，肺泡壁增厚、塌陷，肺泡腔可見大量的炎性滲出物；E組大鼠肺組織支氣管黏膜完整，纖毛整齊、豐富，肺泡結(jié)構(gòu)完整，交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

A.H-KP組；B.L-KP組；C.LPS組；D.LPS+L-KP組；E.空白組。A1、B1、C1、D1、E1.以肺組織支氣管為主視野；A2、B2、C2、D2、E2.以肺組織肺泡腔為主視野圖3 不同造模方式對(duì)大鼠肺部組織病理變化的影響(HE染色,400×；n=7)

2.4 肺部組織MUC5AC免疫熒光檢測(cè)結(jié)果免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，D組大鼠肺部組織MUC5AC平均熒光強(qiáng)度顯著高于E組(P<0.05)；其余組的熒光強(qiáng)度和E組無明顯差別(表2)(圖4)。

對(duì)肺部組織MUC5AC進(jìn)行綠色熒光染色處理，其中每個(gè)樣品按“回”字形至少隨機(jī)拍攝10張照片，不同組別樣品觀察時(shí)只調(diào)節(jié)共聚焦顯微鏡“Z”軸，其余光源強(qiáng)度等條件均不作改變，圖中展示了各組代表性的結(jié)果(400×)圖4 不同造模方法對(duì)大鼠肺組織MUC5AC表達(dá)量的影響

表2 不同造模方法對(duì)大鼠肺組織MUC5AC表達(dá)量的影響(n=6)

2.5 肺部組織AQP3、AQP5 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與E組比較，D組大鼠肺組織中AQP3表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)；A、D組大鼠肺組織AQP5表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(表3，圖5)。

表3 不同造模方法對(duì)大鼠肺組織AQP3、AQP5表達(dá)量的影響(n=6) ×105

A.H-KP組；B.L-KP組；C.LPS組；D.LPS+L-KP組；E.空白對(duì)照組圖5 Western blot檢測(cè)不同造模方法對(duì)大鼠肺部組織AQP3(左)、AQP5(右)表達(dá)量的影響(n=6)

3 討論

EP為非經(jīng)典醫(yī)學(xué)名詞， 主要指以肺泡腔有大量炎性滲出為病理特征的肺部炎癥，是多種肺部疾病病理發(fā)展的基礎(chǔ)，尤其在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)[1]和 急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)疾病進(jìn)程中扮演了關(guān)鍵的角色[9]。單純性EP動(dòng)物臨床表現(xiàn)為明顯的精神萎頓、體溫升高、呼吸加快并伴有頻繁的咳嗽癥狀；剖檢可見肺泡、支氣管充血、出血及肺泡腔大量的炎性滲出物等病理變化。一個(gè)理想的EP動(dòng)物模型應(yīng)能夠準(zhǔn)確呈現(xiàn)上述癥狀，且方法簡(jiǎn)便、易行。目前常用的造模方法是用KP菌液長(zhǎng)周期、間隔性單側(cè)滴鼻，該方法穩(wěn)定性好、個(gè)體差異小，效果較好，但是需要的時(shí)間周期長(zhǎng)，人為不確定因素干擾大；部分學(xué)者采用手術(shù)方法，剖開氣管，滴注KP菌液，該方法時(shí)間短，但是個(gè)體差異性大，并且需要一定的技術(shù)和設(shè)備，不利于制備規(guī)?；膭?dòng)物模型。據(jù)報(bào)道，呼吸障礙是EP動(dòng)物最早出現(xiàn)的臨床癥狀[10]。推測(cè)可能是由于外界病原微生物通過呼吸進(jìn)入呼吸道定植，或者動(dòng)物機(jī)體免疫下降，呼吸道中條件性致病菌增殖所致[11]。LPS作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁特有成分，為一種強(qiáng)效的致炎因子，腹腔注射可引起動(dòng)物嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫力下降。因此，為模擬這一臨床癥狀，本研究先給大鼠腹腔注射LPS，然后連續(xù)雙側(cè)滴鼻接種KP，5 d后檢查發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠剖檢肺部組織病理變化符合預(yù)期并且與臨床呼吸障礙存在相關(guān)性，達(dá)到較好的造模效果。

AQPs是一個(gè)具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子功能的蛋白家族，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種AQPs，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP5在肺部組織大量表達(dá)[12-13]。AQPs以同源四聚體結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞膜，類似于“沙漏”橫跨細(xì)胞膜內(nèi)外，水分子可不與AQPs結(jié)合，僅靠滲透和質(zhì)子排斥便可橫跨細(xì)胞膜[13]，極大提高水分子的運(yùn)輸效率。HILL等[14]和MA等[15]發(fā)現(xiàn)，敲除體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的AQPs基因，細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)率會(huì)減少80%～90%。VERKMAN[16]發(fā)現(xiàn)，敲除大鼠的AQPs基因，大鼠整體水轉(zhuǎn)運(yùn)率也會(huì)減少50%～60%，說明AQPs在動(dòng)物機(jī)體水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中扮演了至關(guān)重要的作用。這也引起了研究EP學(xué)者的注意，EP的典型癥狀為支氣管及肺泡大量炎性滲出物，這些炎性滲出物的形成和AQPs的關(guān)系及相互作用機(jī)理，成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。有研究表明，將小鼠的AQPs基因敲除，小鼠肺泡毛細(xì)血管通透性明顯下降[17]；另有研究結(jié)果顯示，肺部炎癥的發(fā)生時(shí)，AQP1和AQP5出現(xiàn)表達(dá)降低的現(xiàn)象[18]；羅建紅等[19]發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建大鼠肺炎模型時(shí)，模型組大鼠肺組織APQ1、AQP4、AQP5的表達(dá)顯著降低，而TNF-α、IL-6表達(dá)明顯上升。楊志軍等[20]對(duì)大鼠肺炎模型進(jìn)行治療研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠TNF-α表達(dá)量顯著性降低，AQP1、AQP5表達(dá)量顯著性升高，說明水通道蛋白參與肺部組織炎癥的進(jìn)程，并可能與炎性反應(yīng)進(jìn)程及部分炎性因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

黏蛋白(mucoprotein，MUC)是一類主要由上皮杯狀細(xì)胞分泌的糖蛋白，正常情況下，MUC5AB為呼吸道黏液的主要組成部分，但在病理情況下，呼吸道黏液則以MUC5AC為主[21]。OKUDA等[22]認(rèn)為，MUC5AC的表達(dá)量和呼吸道炎癥的進(jìn)程成正相關(guān)關(guān)系。劉敏等[23]在用雞卵白蛋白構(gòu)建小鼠氣道高分泌模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織MUC5AC及其mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著增高。張騫等[24]在用香煙聯(lián)合LPS法構(gòu)建大鼠慢性肺阻塞模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織MUC5AC表達(dá)量與空白組比較顯著升高，在用藥物治療取得一定效果后，肺組織MUC5AC表達(dá)量較模型組顯著性降低；說明MUC5AC與AQP3、AQP5一樣參與了肺部組織的炎癥進(jìn)程，而且與炎性反應(yīng)進(jìn)程及部分炎性因子的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。

腫瘤壞死因子α-水通道蛋白-黏蛋白調(diào)節(jié)軸(TNF-α-AQPs-MUC5AC regulating shaft,TAM-R)為解釋調(diào)控呼吸道黏液分泌的假想模型。目前，沒有明確證實(shí)其有上下游調(diào)節(jié)關(guān)系，只是基于眾多學(xué)者研究肺部炎癥進(jìn)展時(shí)發(fā)現(xiàn)，TNF-α分泌增多的情況下，AQPs表達(dá)量會(huì)顯著性降低，MUC5AC分泌量會(huì)顯著性增加，并且在治療后，AQPs表達(dá)量升高時(shí)，MUC5AC會(huì)相應(yīng)的降低[25]。CHEN等[26]發(fā)現(xiàn)，敲除氣道腺體AQPs基因后5 d，MUC5AC的合成和分泌量分別增加了57.9%和85.3%。學(xué)者們便根據(jù)因果關(guān)系預(yù)測(cè)TAMR的存在，但具體、明確、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)節(jié)關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)大鼠進(jìn)行造模干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，模型組大鼠肺組織AQP3、AQP5表達(dá)量顯著性下降，MUC5AC表達(dá)量顯著性升高；血液中IL-6表達(dá)量顯著性高于空白對(duì)照組，肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組，表明大鼠在被LPS致弱的情況下，KP感染導(dǎo)致肺部組織充血、出血及大量的炎性滲出物，使動(dòng)物體溫上升，在KP感染后5 d，便導(dǎo)致肺部組織充血、出血及大量的炎性物滲出，動(dòng)物出現(xiàn)體溫上升、呼吸障礙等典型的滲出性肺炎癥狀。該造模方法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等特點(diǎn)，為探討EP與炎癥進(jìn)程及AQPs的關(guān)系，以及EP治療藥物的研究提供了快速易行的試驗(yàn)動(dòng)物模型。