邱 敏，馮煉君，趙才軍，包麗娟，李 爽，郝浩揚(yáng)，付云賀，胡曉宇，張乃生 (吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

乳腺炎是奶牛尤其高產(chǎn)奶牛最為嚴(yán)重的疾病之一，會(huì)對(duì)乳腺組織造成損傷，降低產(chǎn)奶量和乳質(zhì)量，增加死亡率和撲殺率[1]。通常認(rèn)為乳腺炎癥主要由細(xì)菌感染所致，大腸桿菌是最主要的病原體之一[2-3]。當(dāng)大腸桿菌感染宿主細(xì)胞，其細(xì)胞壁的脂多糖被Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)免疫反應(yīng)[4]，導(dǎo)致核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路的激活，并誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)[5]。目前常用的乳腺炎治療方法是抗生素以及激素療法，但長(zhǎng)期的抗生素治療會(huì)造成大量耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，同時(shí)抗生素殘留也會(huì)對(duì)人類健康造成巨大的威脅，這對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重危害[6]。因此，尋找一種安全高效可代替抗生素的藥物迫在眉睫。枯草芽胞桿菌(B.subtilis)廣泛存在水體、土壤及動(dòng)物的胃腸道中，某些菌株在宿主體內(nèi)表現(xiàn)出抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[7]。而且，B.subtilis易于分離和培養(yǎng)，已成為抗生素的最佳替代品之一[8]。因此，本研究旨在從奶牛乳汁中篩選出優(yōu)勢(shì)B.subtilis，并將此優(yōu)勢(shì)菌株應(yīng)用于動(dòng)物試驗(yàn)，探討其抗炎作用，為乳腺炎的預(yù)防提供了新的可能性，也為B.subtilis制劑的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡BALB/c小鼠30只，雌性20只，雄性10只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)吉林大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。適應(yīng)環(huán)境1周后，雌性和雄性在小型隔離籠子中以2∶1的比例混合。試驗(yàn)期間給予充足的食物和飲水。

1.2 主要試劑TNF-α，IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioLegend公司；LPS(Escherichiacoli055：B5)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司；β-actin、p65、IκB、p-p65、p-IκB、ZO-1和Claudin 3 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；MPO試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司。

1.3 細(xì)菌及培養(yǎng)條件從吉林省白城地區(qū)奶牛場(chǎng)健康奶樣品中分離到B.subtilis。B.subtilis在TSB培養(yǎng)基中37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜，D600 nm約為0.5(約1×108CFU/mL)。

1.4 乳腺模型建立及分組將產(chǎn)后5～7 d的20只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、LPS組、B.subtilis組(每100 μL PBS含1×108CFU)、B.subtilis(每100 μL PBS含1×108CFU)+ LPS組。為了誘導(dǎo)乳腺炎，將LPS(1 g/L)注射到小鼠的每側(cè)乳腺中。在LPS處理前2 h，將B.subtilis分別注射到兩側(cè)乳頭。對(duì)照組小鼠相同部位注射等體積無(wú)菌PBS。LPS處理后24 h對(duì)小鼠進(jìn)行剖殺并取其乳腺組織，儲(chǔ)存在-80℃下。

1.5 HE染色將各組乳腺組織樣品在4%多聚甲醛中固定48 h。將樣品嵌入石蠟中，并切成4 μm的切片。脫脂后，用蘇木精和伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。

1.6 乳腺組織MPO活性檢測(cè)取乳腺組織，在冰上用反應(yīng)緩沖液將其制備成勻漿。MPO活性的檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。通過(guò)在460 nm 處測(cè)量吸光度來(lái)檢測(cè)酶的活性。

1.7 ELISA檢測(cè)利用ELISA試劑盒檢測(cè)炎性細(xì)胞因子，具體操作參照制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在冰上將乳腺組織移入勻漿器，加入預(yù)冷的PBS(質(zhì)量/體積比為1∶9)，將組織制備成勻漿。將勻漿4℃,12 000 r/min 離心10 min，去除脂質(zhì)層，收集中間上清液進(jìn)行檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在450 nm和570 nm處的吸光值。

1.8 Western blot使用組織蛋白提取試劑盒提取乳腺組織的總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，制備樣品。配制分離膠和濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉2 h。清洗后依次孵育一抗以及二抗，最后加入ECL試劑顯影后觀察結(jié)果。

1.9 免疫組織化學(xué)所有乳腺組織在常規(guī)中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，將載有石蠟包埋組織的載玻片在二甲苯和不同濃度的酒精中進(jìn)行脫蠟；用0.01 mmol/L枸楷酸鹽緩沖液熱修復(fù)；自然冷卻后置于3%過(guò)氧化氫中，37℃ 10 min,PBS沖洗3 min×3次；將切片與Claudin-3(1∶700)抗體，ZO-1(1∶700)抗體在4℃進(jìn)行孵育過(guò)夜；洗滌3次后，將切片與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)在37℃下孵育20 min；DAB染色后，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1B.subtilis對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺組織病理學(xué)的影響如圖1所示，對(duì)照組和單獨(dú)B.subtilis處理組小鼠乳腺組織形態(tài)正常，無(wú)組織病理學(xué)變化，LPS組小鼠的乳腺組織出現(xiàn)水腫、明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，顯示B.subtilis處理明顯減弱了LPS誘發(fā)的乳腺病理?yè)p傷以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外，炎癥評(píng)分也顯示，B.subtilis減弱了LPS誘導(dǎo)的乳腺組織損傷。

A.對(duì)照組；B.BS組；C.LPS模型組；D.BS+LPS組；E.組織病理學(xué)評(píng)分。組織病理學(xué)指標(biāo)是通過(guò)充血(0～3級(jí)，從正常到嚴(yán)重，包括正常、輕度、中度、重度)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度(0～5級(jí))進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖中BS代表B.subtilis,下同圖1 乳腺組織病理學(xué)變化

2.2B.subtilis對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺組織中促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響從圖2可知，與對(duì)照組相比，LPS組的TNF-α和IL-1β表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與LPS組相比，用B.subtilis預(yù)處理后，TNF-α和IL-1β的含量顯著減少(P<0.05)。

A.TNF-α；B.IL-1β。試驗(yàn)重復(fù)3次，圖中展示了代表性結(jié)果圖2 乳腺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的變化

2.3B.subtilis對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺組織中MPO活性的影響MPO活性可直接反映中性粒細(xì)胞的數(shù)量。如圖3所示，LPS組小鼠乳腺組織中MPO活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.001)；與LPS組相比，用B.subtilis預(yù)處理后，小鼠乳腺組織中MPO活性極顯著下降(P<0.001)。

圖3 乳腺組織中MPO活性的變化

2.4B.subtilis對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響為了闡明B.subtilis的抗炎機(jī)制，我們研究了B.subtilis對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。如圖4所示，與對(duì)照組相比，LPS處理組小鼠乳腺組織中IκB的磷酸化水平和NF-κB p65的磷酸化上調(diào)；同LPS處理組相比，B.subtilis預(yù)處理組小鼠乳腺組織中IκB和NF-κB p65的磷酸化水平明顯減少。同時(shí)，與對(duì)照組相比，B.subtilis處理組在這些信號(hào)通路上沒(méi)有明顯的變化。

A.NF-κB信號(hào)通路蛋白的Western blot結(jié)果；B.p-p65的相對(duì)表達(dá)水平；C.p-IκB的相對(duì)表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)了3次，圖中展示了代表性結(jié)果圖4 BS對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺炎NF-κB信號(hào)通路的影響

2.5B.subtilis對(duì)乳腺組織中緊密連接蛋白表達(dá)的影響為了研究B.subtilis對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮屏障完整性的影響，檢測(cè)了ZO-1和Claudin-3的表達(dá)水平。如圖5所示，同對(duì)照組相比，LPS處理組小鼠乳腺組織中的ZO-1和Claudin-3的含量明顯減少；同LPS處理組相比，B.subtilis預(yù)處理組小鼠乳腺組織中ZO-1和Claudin 3的含量明顯提高。

A.Claudin-3表達(dá)的變化(a.對(duì)照組； b.BS組；c.LPS模型組；d.BS+LPS組)；B.ZO-1表達(dá)的變化(a.對(duì)照組； b.BS組；c.LPS模型組；d.BS+LPS組)。陽(yáng)性染色為褐色；每個(gè)樣品至少隨機(jī)拍攝5～8張不同部位的圖片，圖中展示了各組代表性結(jié)果圖5 乳腺組織細(xì)胞連接處緊密連接蛋白Claudin-3和ZO-1分布的變化(×200)

3 討論

乳腺炎一般由機(jī)械、物理、化學(xué)、病原微生物等引起[9]，其中病原菌感染是乳腺炎的主要原因，大腸桿菌是主要致病菌之一，脂多糖作為其細(xì)胞壁主要活性成分在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]。最近，越來(lái)越多的研究表明，益生菌有可能治療多種疾病，如炎癥性腸病、肥胖癥和糖尿病[11-12]。B.subtilis是一種無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性的益生菌[13]，廣泛存在水體、土壤及動(dòng)物的胃腸道中，具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群及提高動(dòng)物免疫力的作用，B.subtilis易于分離和培養(yǎng)，已成為抗生素的最佳替代品之一[14]。有報(bào)道說(shuō)，B.subtilis對(duì)普通抗生素沒(méi)有抵抗力，可以作為益生菌的候選者[12]。因此，本研究使用小鼠乳腺炎模型來(lái)研究B.subtilis對(duì)乳腺局部炎癥的保護(hù)作用。

細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，包括促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子[15]。LPS可通過(guò)激活乳腺上皮細(xì)胞中的NF-κB激活TLR4并啟動(dòng)先天免疫和炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，B.subtilis明顯減少了TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，表明B.subtilis改善了LPS引起的炎癥程度。MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和活化標(biāo)志，其水平和活性的變化代表了中性粒細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)[16]。本研究表明，LPS組的MPO活性明顯高于對(duì)照組，B.subtilis預(yù)處理組MPO活性明顯下降。NF-κB信號(hào)通路已被證明與各種炎癥反應(yīng)中炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，B.subtilis通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少了促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，ZO-1和Claudin-3在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞上皮屏障功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、維持細(xì)胞極性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用[18]。免疫組化的結(jié)果顯示，B.subtilis可以明顯增加細(xì)胞連接處的緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-3的分布。綜上所述，B.subtilis預(yù)處理可以有效抑制LPS引起的小鼠乳腺炎，本研究為B.subtilis的益生菌作用提供了支持，為治療炎癥性疾病提供了合理的參考，同時(shí)也證明B.subtilis可能是一種有治療乳腺炎潛力的候選菌。