周倩宇,呂曉玲,王改麗,李 姿,賀文琦* (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 006;.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 晉中 00800;.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春 006)
豬血凝性腦脊髓炎病毒(PHEV)屬于單鏈RNA病毒,是一種典型的嗜神經(jīng)性冠狀病毒,主要感染哺乳期仔豬,引起腦脊髓炎和/或消化系統(tǒng)疾病,以嘔吐、衰竭及中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙為特征[1-2]。該病毒攻擊宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞,但其神經(jīng)損傷機(jī)制尚不清楚[3]。肌動(dòng)蛋白(F-actin)是真核細(xì)胞骨架的重要組成部分,神經(jīng)細(xì)胞的突觸可塑性、胞質(zhì)環(huán)流、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等均受其動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)所驅(qū)動(dòng)[4]。同時(shí),細(xì)胞F-actin骨架重塑在防御病毒入侵、病毒胞內(nèi)運(yùn)輸及病毒粒子釋放過(guò)程中扮演重要的角色[5-7]。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)具有磷脂酰肌醇激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,通常為激活細(xì)胞整合素信號(hào)所必需的,參與特定病毒的入侵過(guò)程,如單純皰疹病毒1型(HSV-1)、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒(EBv)和腺病毒(adenovirus)[8-11]。哺乳動(dòng)物中的絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt又稱(chēng)蛋白激酶B,包括3種亞型Akt1、Akt2和Akt3,它們是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子。PI3K調(diào)節(jié)亞基可與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合,對(duì)其催化亞基進(jìn)行激活以催化PIP3形成,隨后將Akt募集到細(xì)胞膜上而起作用[12-13]。同時(shí),PI3K可通過(guò)下游Akt信號(hào)調(diào)控F-actin細(xì)胞骨架重塑過(guò)程[14]。盡管PHEV通過(guò)劫持整合素α5β1-黏著斑激酶(FAK)-絲切蛋白(CFL)信號(hào)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞F-actin骨架已被證實(shí)[15],但PI3K信號(hào)通路是否在這一過(guò)程中起作用尚不明確。
PI3K-Akt通路的下游調(diào)控因子眾多,其中Ras相關(guān)蛋白超家族研究較廣泛。Ras蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),Ras蛋白結(jié)合GDP時(shí)為失活態(tài),結(jié)合GTP時(shí)為活化態(tài)。當(dāng)細(xì)胞外存在信號(hào)分子時(shí),Ras蛋白釋放出自身的GDP并結(jié)合GTP,從而由失活態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)變,最終實(shí)現(xiàn)將胞外信號(hào)向胞內(nèi)傳遞。Ras相關(guān)蛋白超家族可分為3個(gè)亞家族Rho、Rac和Cdc42,它們可以利用鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合和水解循環(huán)發(fā)揮作用[16-18]。其中,小G蛋白R(shí)ho亞家族GTP酶成員A(Rho A)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架系統(tǒng),特別是肌動(dòng)蛋白CFL的功能[19],已經(jīng)被廣泛認(rèn)可?;诖耍狙芯繑M探究PI3K-Akt-Rho A信號(hào)通路是否參與PHEV入侵宿主細(xì)胞過(guò)程以及該通路在PHEV入侵過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制,有助于進(jìn)一步闡明PHEV誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的致病機(jī)制,并尋找有吸引力的治療靶點(diǎn)。
1.1 細(xì)胞小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a細(xì)胞,ATCC:CCL131)在DMEM(6%胎牛血清)中傳代培養(yǎng)。
1.2 病毒PHEV CC14毒株(GenBank:MF083115.1)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物病理解剖實(shí)驗(yàn)室保存,在N2a細(xì)胞中傳代繁殖。
1.3 主要試劑鼠源PHEV-N單克隆抗體,由本實(shí)驗(yàn)室提取并保存;Cofilin(3318)、p-cofilin(3313)、PI3K(4255)、p-PI3K(4228)、Akt(4685)、p-Akt(4060)等單克隆抗體購(gòu)于CST公司;GAPDH(60004-1)、FITC-phalloidin F-actin(SA00003-2)等單克隆抗體購(gòu)于Proteintech公司;PI3K抑制劑(LY 294002)、Rho A抑制劑(CCG-1423)等購(gòu)于GLPBIO公司;RNAiso-plus(9109)、SYBR Green qPCR試劑盒等購(gòu)于TaKaRa公司。
1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡PHEV(MOI=1)孵育N2a細(xì)胞2 h,并給予藥物干預(yù)。細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解,12 000 r/min離心后,取上清液重懸于5×SDS-PAGE緩沖液中,并煮沸??扇苄约?xì)胞裂解產(chǎn)物在12% SDS-PAGE凝膠上分離,轉(zhuǎn)移到0.45 μm孔徑硝化纖維素膜上,用5%牛血清白蛋白封閉并孵育抗體。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。
1.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)利用RNAiso-plus試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用TaKaRa SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。特異性引物:PHEV-P1,5′-TCT GGG AAT CCT GAC GAG C -3′;PHEV-P2,5′-AGG CGC TGC AAC ACT TAC-3′;GAPDH-P1,5′-CTC AAC TAC ATG GTC TAC ATG TTC-3′;GAPDH-P2,5′-ATT TGA TGT TAG TGG GGT CTC GCT C-3′。
1.6 間接免疫熒光將N2a細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片,用信號(hào)分子抑制劑干預(yù)細(xì)胞后,再用PHEV孵育1 h,用0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次,去除細(xì)胞表面未結(jié)合的病毒,于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用4%多聚甲醛和冷甲醇固定細(xì)胞,0.5% Triton X-100透膜處理,5% BSA封閉。孵育FITC-phalloidin特異性標(biāo)記F-actin或PHEV-N一抗,Hoechst染核后于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Olympus FluoView FV1000)下觀察。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,2組間差異用雙邊非配對(duì)t-test檢驗(yàn),3組及以上組間差異用單因素方差分析檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*示P<0.05,**示P<0.01,***示P<0.001。
2.1 PHEV入侵N2a細(xì)胞激活PI3K-Akt信號(hào)通路如圖1A所示,PHEV感染N2a細(xì)胞5 min時(shí)PI3K迅速發(fā)生磷酸化,隨后其磷酸化水平下降,并在20 min后磷酸化作用消失。檢測(cè)PI3K下游底物Akt活性發(fā)現(xiàn),PHEV感染早期(5~15 min)Akt磷酸化水平較高,20 min后其活性逐漸下降(圖1B)。利用滅活的PHEV感染細(xì)胞后,PI3K磷酸化水平并未見(jiàn)顯著變化(圖1C)。該結(jié)果表明,PHEV入侵N2a細(xì)胞早期可迅速激活PI3K-Akt信號(hào)通路。
A,B.Western blot檢測(cè)PHEV入侵N2a細(xì)胞后PI3K/p-PI3K及Akt/p-Akt蛋白水平;C.Western blot檢測(cè)滅活PHEV入侵N2a細(xì)胞后p-PI3K和p-Akt蛋白水平圖1 病毒感染時(shí)PI3K和Akt蛋白水平變化
2.2 PI3K信號(hào)失活抑制PHEV入侵N2a細(xì)胞為了檢測(cè)PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)F-actin動(dòng)態(tài)重塑及PHEV入侵的影響,使用PI3K特異性抑制劑LY294002(LY)預(yù)處理N2a細(xì)胞,然后接種PHEV 15 min。結(jié)果表明,PI3K抑制劑顯著抑制PHEV蛋白表達(dá)(圖2A),并呈劑量依賴(lài)性抑制PHEV感染效率(圖2B)。免疫熒光標(biāo)記研究表明,5 μmol/L LY可有效降低F-actin骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,同時(shí)抑制病毒內(nèi)化作用(圖2C)。上述研究證明,PI3K信號(hào)通路障礙可破壞F-actin骨架動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性從而抑制PHEV入侵N2a細(xì)胞。
A.Western blot檢測(cè)PHEV蛋白水平;B.RT-qPCR檢測(cè)PHEV mRNA水平;C.共聚焦顯微鏡觀察F-actin骨架及病毒入侵圖2 PHEV入侵及F-actin骨架重塑
2.3 Rho A調(diào)控PHEV入侵N2a過(guò)程前期研究已證實(shí),PHEV入侵N2a細(xì)胞過(guò)程中cofilin(CFL)磷酸化和去磷酸化呈動(dòng)態(tài)變化,CFL活性的動(dòng)態(tài)變化可以引起F-actin骨架發(fā)生一系列變化[20]。為了研究PI3K信號(hào)通路中Rho GTP酶成員Rho A對(duì)F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影響,我們用Rho A特異性抑制劑CCG-1423(CCG)對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,并接種PHEV。如圖3A所示,CCG-1423可使PHEV感染效率呈藥物濃度依賴(lài)性降低。免疫熒光檢測(cè)表明,1 μmol/L CCG-1423可降低病毒內(nèi)化,并且降低F-actin骨架穩(wěn)定性(圖3B)。上述研究證明,在PHEV感染早期,增強(qiáng)Rho A信號(hào)可以調(diào)控PHEV入侵N2a細(xì)胞。
A.Rho A被抑制后p-CFL和PHEV的蛋白水平檢測(cè);B.共聚焦顯微鏡觀察PHEV入侵圖3 Rho A對(duì)F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影響
前期研究工作已證實(shí),PHEV入侵神經(jīng)細(xì)胞可激活整合素α5β1-FAK-CFL信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)細(xì)胞F-actin骨架動(dòng)態(tài)重排[15]。PI3K對(duì)整合素信號(hào)敏感,且其效應(yīng)底物Akt可以通過(guò)活化下游因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[21-22]。為了明確PHEV入侵N2a細(xì)胞時(shí)PI3K-Akt這一經(jīng)典通路的激活狀態(tài),本研究進(jìn)行了系統(tǒng)地檢測(cè)。結(jié)果顯示PI3K/p-PI3K和Akt/p-Akt在PHEV感染早期出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,提示PHEV有效入侵可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路。結(jié)合PI3K抑制劑處理及F-actin骨架形態(tài)學(xué)觀察,我們進(jìn)一步證明PI3K-Akt信號(hào)通路可以調(diào)控PHEV入侵N2a細(xì)胞過(guò)程。
Rho A作為Rho家族中的一個(gè)成員,是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)的關(guān)鍵分子,激活后的Rho A可參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞形態(tài)和功能變化過(guò)程,包括細(xì)胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和屏障功能的調(diào)節(jié)等[23]。因此,Rho A又被稱(chēng)為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性的分子開(kāi)關(guān)。有研究證明PI3K-Akt信號(hào)調(diào)控F-actin骨架重塑過(guò)程與其下游Rho A信號(hào)密切相關(guān)[14,24]。因此Rho A信號(hào)分子
在PHEV入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,本研究發(fā)現(xiàn),抑制Rho A功能顯著降低PHEV感染效率,表明在PHEV感染早期,增強(qiáng)Rho A信號(hào)可以調(diào)節(jié)PHEV入侵N2a細(xì)胞。
綜上所述,本研究證實(shí)PHEV入侵能夠激活PI3K-Akt信號(hào)通路,且Rho A作為該信號(hào)通路的下游調(diào)控因子參與調(diào)控F-actin骨架穩(wěn)定性及PHEV入侵神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程。該研究為闡明PHEV誘導(dǎo)神經(jīng)損傷性疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了理論依據(jù),并為抗病毒藥物篩選提供了潛在靶標(biāo)。
中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)2022年5期