馬麗莎，尹怡，謝文平，單奇，鄭光明，李麗春，劉書貴，戴曉欣，趙城，魏琳婷，林嘉薇

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來入侵水生生物防控重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(廣州),廣東 廣州 510380)

地西泮又名安定，屬苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑，具鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，地西泮不僅可作為生長促進劑添加到飼料中提高水產(chǎn)品的生長速度,還可在養(yǎng)殖及運輸過程中降低水產(chǎn)品對環(huán)境的應激反應提高其存活率[2-3]，備受養(yǎng)殖戶青睞，但其有蓄積毒性,對人體肝臟、腦及運動神經(jīng)等器官具毒副作用[4-5]，已被中國及歐盟各國禁止用于動物飼養(yǎng)及產(chǎn)品生產(chǎn)過程[6-8]。GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定在動物性食品中不得檢出地西泮[6]；農(nóng)業(yè)部 176 號公告規(guī)定嚴禁在飼料和動物飲用水中使用地西泮等精神類藥物[7]。但近年來，中國仍有地西泮違規(guī)使用的情況發(fā)生，如：云南、河南、上海等地的水產(chǎn)品均有檢出地西泮的報道，其在水產(chǎn)品中的殘留問題已引起廣泛關(guān)注[9]。

《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于加強水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品監(jiān)管的通知》中指出飼料等水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品的質(zhì)量問題可造成養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全隱患。水產(chǎn)飼料的質(zhì)量安全是保障養(yǎng)殖產(chǎn)品安全和食品安全的第一道關(guān)口，關(guān)系到中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，故加強飼料中地西泮含量的檢測是從源頭控制水產(chǎn)品地西泮殘留問題的有效手段之一。但目前針對地西泮的測定主要集中在環(huán)境樣品、動物源性食品、水產(chǎn)品等[10-13]，關(guān)于飼料的報道較少[14-16]。李俊玲等[14]、賈濤[15]及現(xiàn)行標準NY/T 934—2005[16]分別采用GC-MS法、LC-MS/MS法及液相色譜法(HPLC)測定飼料中地西泮殘留，但上述方法均采用固相萃取柱凈化樣品，存在操作繁瑣、費時的缺點，且HPLC法易受雜質(zhì)干擾產(chǎn)生假陽性，同時靈敏度也較低，由此可見上述方法均難滿足目前食品中殘留物快速篩查、精準定量的檢測要求。因此為加強水產(chǎn)養(yǎng)殖源頭監(jiān)控，避免貿(mào)易壁壘，建立水產(chǎn)飼料中地西泮精準、高效的檢測方法尤為重要。

氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)因特異性、抗干擾能力強、靈敏度高等優(yōu)點，成為了目前分析復雜基質(zhì)中痕量組分的首選方法，但液質(zhì)屬大型質(zhì)譜，儀器價格昂貴，普通實驗室無法普及，而氣相色譜質(zhì)譜儀價格適中，有利于方法的推廣。樣品前處理技術(shù)QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)具有快速、簡便、有效、廉價、耐用、安全等優(yōu)點[17],被廣泛用于食品安全檢測樣品的前處理[18-21]。本研究結(jié)合QuEChERS與GC-MS的技術(shù)優(yōu)點，建立了水產(chǎn)飼料(配合飼料、濃縮飼料及飼料預混料)中地西泮殘留的快速檢測方法，具有操作簡單、快速、價廉、靈敏度高等優(yōu)點，單個樣品前處理時間僅需30 min，有利于實現(xiàn)樣品的批量化處理，可為建立水產(chǎn)飼料質(zhì)量安全的有效監(jiān)管、養(yǎng)殖者的風險控制提供有力的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配電子電離源，HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent科技公司;旋渦混勻器，德國IKA公司；離心機，上海飛鴿公司；地西泮、D5-地西泮，質(zhì)量濃度均為100 mg/L,均購自德國Dr. Ehrenstorfor公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA 40～60目)、石墨化炭黑(GCB)及中性氧化鋁(Alumina-N)，美國Agela公司；無水硫酸鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司，500 ℃灼燒4 h,冷卻后儲存于磨口玻璃瓶中備用；氯化鈉(分析純)，廣州化學試劑廠；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯，色譜純，美國霍尼韋爾公司；實驗用水為Milii-Q去離子水。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：移取適量的地西泮標準物質(zhì)用甲醇溶解，配制成10 mg/L的標準儲備液，使用時用甲醇稀釋成1 mg/L的標準使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標儲備溶液：移取適量的D5-地西泮標準溶液，用甲醇溶解配制成10 mg/L 的內(nèi)標儲備液，使用時用甲醇稀釋成1 mg/L的標準使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

空白基質(zhì)提取液:樣品按照1.3節(jié)條件前處理，獲得空白基質(zhì)提取液。

基質(zhì)標準工作溶液的配制：用空白基質(zhì)提取液稀釋標準使用液配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、200、500 μg/L的系列標準曲線工作液,內(nèi)標濃度為50 μg/L。

1.3 樣品及樣品前處理

1.3.1 樣品

水產(chǎn)飼料分為配合飼料、濃縮飼料和預混飼料。預混飼料是飼料生產(chǎn)的核心，是飼料加工生產(chǎn)的基礎(chǔ)。預混料添加適量的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等原料構(gòu)成濃縮料。濃縮料再添加玉米、麥麩等構(gòu)成配合飼料。

1.3.2 樣品制備

飼料樣品經(jīng)粉碎均勻后制成待測樣，于室溫下密封保存。

1.3.3 提取

準確稱取樣品2.00 g(精確到0.01 g),置于50 mL塑料離心管中，加入100 μL地西泮內(nèi)標(10 mg/L)和8 mL去離子水，渦旋5 min，加入10 mL乙腈，渦旋2 min,加入1 g氯化鈉和5 g無水Na2SO4，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL塑料離心管中，重復提取 1 次，合并上清液并加入3 g無水Na2SO4，渦旋30 s，5 000 r/min離心1 min，移取上清液至20 mL比色管中用乙腈定容至刻度線后混勻，待凈化。

1.3.4 凈化

移取1 mL上清液于2 mL塑料離心管中，加入200 mg中性氧化鋁、200 mg二氧化鋯、50 mg PSA及50 mg GCB,渦旋振蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min，取上清液，供GC-MS檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

載氣為純度高于99.999%的氦氣，流速為1.0 mL/min;進樣口溫度290 ℃，采用脈沖不分流進樣，脈沖壓力207 kPa,持續(xù)時間1 min,分流出口開啟時間1 min,進樣體積為1 μL;升溫程序：初始溫度為150 ℃，保持1 min,以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：EI源；電離能量：70 EV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；輔助加熱溫度：280 ℃；檢測方式：選擇離子監(jiān)測模式(SIM)，溶劑延遲：10 min，駐留時間為40 s,監(jiān)測離子(m/z)：地西泮為221、241、256、283，其中定量離子為256，D5-地西泮為226、246、261、288，其中定量離子為261。

1.5 基質(zhì)效應的計算

飼料成分復雜，富含油脂、色素及蛋白等雜質(zhì)，極易干擾質(zhì)譜中目標物的離子化對其產(chǎn)生基質(zhì)效應，導致目標物發(fā)生離子增強或抑制，影響結(jié)果的準確度。實驗采用基質(zhì)效應(ME)=基質(zhì)對照溶液的峰面積/溶劑對照溶液的峰面積，評價地西泮的基質(zhì)效應。若ME>1，表示基質(zhì)對目標物的響應產(chǎn)生增強效應;若ME<1，表示基質(zhì)對目標物的響應產(chǎn)生抑制效應；若ME=1，表示不存在基質(zhì)效應。當ME介于0.8～1.2時，表明基質(zhì)干擾程度較低；當0.51.5，表示基質(zhì)效應的干擾強烈[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在m/z50～550范圍內(nèi)進行全掃描，確定各組分的保留時間和特征離子。為降低干擾、提高靈敏度，采用選擇離子SIM模式，每個化合物選擇1個定量離子、3個定性離子。質(zhì)譜條件優(yōu)化的重點是目標物的靈敏度，駐留時間是儀器采集目標離子停留的時間，可影響目標物的峰形及靈敏度。駐留時間過長可導致色譜峰失真、峰形變矮變寬，過短可導致目標物靈敏度下降。通過實驗，發(fā)現(xiàn)駐留時間為40 ms時，目標物的響應值最大，靈敏度最高，30 ms及50 ms時目標物的響應值均低于40 ms時的響應值。因此，實驗確定各監(jiān)測離子的駐留時間為40 ms。地西泮及D5-地西泮的定性與定量離子見1.4.2，地西泮保留時間為21.211，D5-地西泮保留時間為21.158。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

進樣口溫度及進樣方式可影響目標物的靈敏度。進樣口是樣品完成氣化的地方，合適的進樣口溫度能保證目標物瞬間完全氣化，提高目標物的靈敏度、重現(xiàn)性，但溫度過高，可導致目標物分解，重現(xiàn)性變差。實驗發(fā)現(xiàn)目標物的響應值隨進樣口溫度的升高而變大，當進樣口溫度為290 ℃時，目標物的響應值最大，靈敏度最高，300 ℃時目標物響應值略有下降，310 ℃時TIC色譜圖碎片峰明顯增多，顯示目標物發(fā)生裂解。因此，本研究確定最佳進樣口溫度為290 ℃。

本研究還比較了普通進樣及脈沖不分流進樣兩種方式對目標物靈敏度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，脈沖不分流進樣時目標物的靈敏度高于普通進樣時的靈敏度，且目標峰拖尾情況有所改善，峰形變得尖銳、對稱。這可能是由于脈沖不分流進樣通過瞬間提高進樣口壓力的方式，減少了樣品在進樣口分解及擴散的機會,使樣品更集中地進入色譜柱從而改善了峰形、提高了檢測靈敏度。因此，本研究選用脈沖不分流進樣分析地西泮，并通過優(yōu)化，確定脈沖壓力為207 kPa。

2.3 光照對靈敏度的影響

用乙腈配制6份質(zhì)量濃度為5 ng/mL的地西泮溶液，其中1份為標樣，另外5份用于光照實驗以考察光照對地西泮靈敏度的影響，結(jié)果顯示光照對地西泮的靈敏度影響顯著，其靈敏度隨光照時間的延長下降明顯(圖1)，因此前處理時應避光操作。

圖1 不同光照時間對地西泮響應值的影響注：比值=實驗樣品峰面積/對應濃度標樣峰面積。Fig.1 The effect of different light time on the response value of diazepamNote: ratio=experimental sample peak area/corresponding concentration standard sample peak area.

2.4 提取溶劑的選擇

考察了常用的正己烷/二氯甲烷(v/v=7∶3)、乙腈、乙酸乙酯及甲醇4種提取溶劑。通過基質(zhì)空白實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇的極性較強，提取雜質(zhì)多，而正己烷/二氯甲烷(v/v=7∶3)脂溶性強，提取出的油脂較多，提取液靜置后離心管底部出現(xiàn)一層油脂，TIC色譜圖顯示，上述兩種提取液基線干擾均較嚴重，而乙腈及乙酸乙酯提取后得到的圖譜干擾較少(見圖2)。實驗進一步比較了乙腈及乙酸乙酯對飼料中地西泮的提取效率，結(jié)果顯示：乙腈及乙酸乙酯的回收率均較低，在50%左右，可能與樣品的狀態(tài)有關(guān)，飼料為固態(tài)，水分含量極低，有機溶劑難滲透入飼料中，導致溶劑的提取效率低。水產(chǎn)飼料前處理過程中加入純水可使飼料溶解于水中，有助于目標物從飼料中釋放出來并溶解于有機溶劑中，增大萃取效率。然而實驗時發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取水溶解的飼料樣品時易乳化，不利于樣品的萃取，乙腈萃取時無乳化現(xiàn)象，渦旋振蕩后加入鹽析劑促使有機相與水相分層，溶于水中的目標物轉(zhuǎn)溶于乙腈中，有效提高了目標物回收率(93.8%)。因此本試驗選用乙腈為提取溶劑，并在前處理過程中加入純水以提高乙腈的萃取效率。

圖2 不同溶劑對飼料中雜質(zhì)提取效果的比較注：A為甲醇;B為乙酸乙酯;C為乙腈;D為正已烷/二氯甲烷(v∶v=7∶3)Fig.2 Comparison for extraction effects of different solvents on impurities in feedNote: A was methanol; B was ethyl acetate; C was acetonitrile; D was n-hexane/dichloromethane (v/v=7∶3)

2.5 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法的核心是尋找能夠吸附雜質(zhì)的吸附劑。水產(chǎn)飼料由玉米、魚粉、維生素、氨基酸等微量元素組成，基質(zhì)成分復雜，富含蛋白質(zhì)、脂肪、有機酸、色素等雜質(zhì)，為達最佳凈化效果，吸附劑的選擇至關(guān)重要。常用吸附劑有C18粉、中性氧化鋁、佛羅里硅土、PSA、石墨化碳(GCB)等，其中C18粉、中性氧化鋁及佛羅里硅土能去除脂肪、油脂等干擾物，石墨化碳(GCB)可去除色素、固醇類等，PSA可去除提取液中的有機酸、脂肪酸和極性色素等水溶性雜質(zhì)。

考慮到飼料基質(zhì)復雜，僅使用一種吸附劑難達到理想的凈化效果，因此本研究采用復合吸附劑凈化樣品。首先以配合飼料為切入點篩選適用的吸附劑，再優(yōu)化吸附劑的配比。結(jié)果顯示：中性氧化鋁粉、PSA、GCB對配合飼料基質(zhì)的凈化效果均較好,凈化效果也各有不同，且200 mg中性氧化鋁粉、200 mg PSA及50 mg GCB對地西泮均無吸附。之后實驗在PSA(50～200 mg)、中性氧化鋁粉(50～200 mg)、GCB(20～50 mg)范圍內(nèi)優(yōu)化各吸附劑的用量,發(fā)現(xiàn)50 mg與200 mg PSA的凈化效果相當；中性氧化鋁為200 mg時凈化效果最佳；而提取液的顏色隨GCB含量的增加變淺，加入量為50 mg時，提取液中色素可被完全吸附,本實驗暫定吸附劑組合為中性氧化鋁200 mg+PSA 50 mg+GCB 50 mg，并將其用于凈化配合飼料、濃縮飼料和預混飼料，但色譜圖顯示地西泮定量離子256處有干擾峰，回收率偏低(小于60%)，調(diào)研時發(fā)現(xiàn)飼料生產(chǎn)過程中需加入磷脂提高其抗氧化性并延長保質(zhì)期，但方法采用的吸附劑均不吸附磷脂。二氧化鋯顆粒能吸附磷脂降低基質(zhì)干擾[23],本研究將其加入復合吸附劑中并重新考察了復合吸附劑的凈化效果(表1)。

表1 不同吸附劑對不同基質(zhì)的凈化效果Tab.1 Purification effects of different adsorbents on different substrates

由表1可見，復合吸附劑對飼料基質(zhì)的凈化能力優(yōu)于單一吸附劑，其中復合吸附劑2的凈化效果最佳，基質(zhì)效應最小，提取液經(jīng)復合吸附劑2凈化后，溶液變得清澈透明，色譜圖基線噪音變小，地西泮定量離子256處干擾峰消除(圖3)，回收率在86.3%～104.5%之間。最終確定吸附劑的組合為中性氧化鋁200 mg+二氧化鋯 200 mg+PSA 50mg+GCB 50 mg。

圖3 不同吸附劑對飼料基質(zhì)的凈化效果比較注：A為未凈化提取液；B為復合吸附劑1凈化后提取液；C為復合吸附劑2凈化后提取液。Fig.3 Comparison for purification effects of different adsorbents on feed matrixNote: A was the unpurified extracting solution; B was the purified extracting solution by composite adsorbent 1; C was the purified extracting solution by composite adsorbent 2.

2.6 方法驗證

2.6.1 基質(zhì)效應(ME)

研究采用1.5節(jié)描述對配合飼料、濃縮飼料和預混飼料的基質(zhì)效應進行評價。結(jié)果顯示：地西泮在3種飼料中的基質(zhì)效應在0.90～1.08 之間，表明方法對飼料的凈化效果較好，基質(zhì)干擾程度較低，但為提高定量準確性，需對其基質(zhì)效應進行校正。校正基質(zhì)效應的方法有標準加入法、基質(zhì)匹配標準曲線法、同位素內(nèi)標法、稀釋上機液法及基質(zhì)匹配內(nèi)標法等[22，24 ]，其中基質(zhì)匹配內(nèi)標法可同時校正基質(zhì)效應及回收率，具有操作簡便、定量準確的優(yōu)點，因此本研究采用基質(zhì)匹配內(nèi)標法消除基質(zhì)效應的影響。

2.6.2 線性范圍、檢出限與定量限

按1.2節(jié)配制標準曲線，在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下測定分析，以目標物定量離子峰面積和相應內(nèi)標物定量離子峰面積之比(y)為縱坐標，以目標物濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，分別以3倍和10倍信噪比確定方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果顯示地西泮在5～500 μg/L線性范圍內(nèi)，線性良好，線性方程為y=0.019 6x-0.116 4,線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 2，檢出限為0.05 mg/kg,定量限為0.2 mg/kg, 方法檢出限遠低于標準NY/T 934—2005《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準 飼料中地西泮的測定 高效液相色譜法》的方法檢出限1 mg/kg[16]。

2.6.3 精密度與回收率

選擇空白配合飼料、濃縮飼料及飼料添加劑開展加標回收實驗，分別向?qū)嶒灅悠分刑砑拥汀⒅?、?0.15、0.25、0.50 mg/kg)3個水平的地西泮標準溶液，每個添加濃度設(shè)6個平行，并做空白實驗，計算回收率和相對標準偏差。結(jié)果見表2，方法加標回收率為86.3%～104.5%，相對標準偏差為1.4%～7.8%，說明方法的準確度與精密度較好，能滿足國家標準GB/T 27404—2008《中華人民共和國國家標準 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[25]中實驗室質(zhì)量控制規(guī)范,加標量為0.50 mg/kg的預混飼料加標色譜圖見圖4。

圖4 預混飼料加標TIC圖Fig.4 TIC diagram of spiked premixed feed

表2 水產(chǎn)飼料中地西泮的加標回收率和相對標準偏差Table.2 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of diazepam in aquatic feed n=6

2.7 實際樣品分析

采用本研究建立的分析方法對20批次配合飼料樣品、5批次濃縮飼料樣品及5批次預混飼料樣品進行檢測，以上樣品主要采集于市場、飼料廠及水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，其中1批次配合飼料樣品檢出地西泮，含量為273 μg/kg(圖5),表明水產(chǎn)飼料中存在違規(guī)添加地西泮的問題。

圖5 配合飼料TIC圖Fig.5 TIC diagram of compound feed

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜法測定飼料中地西泮殘留。該方法具有靈敏度高、凈化效果好、操作簡單、精密度和準確度高等優(yōu)點，與國標法NY/T 934—2005相比，極大提高了檢測效率，完成一次前處理僅需30 min,適用于批量樣品中地西泮殘留的測定，且方法所需儀器設(shè)備價格適中，便于該方法在基層檢測機構(gòu)推廣，可為政府加強水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品監(jiān)管提供技術(shù)支撐，以應對日益突出的藥物殘留安全風險的監(jiān)控與監(jiān)管工作需求。