譚琪明，李 俊，何 珺

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025；3.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

銀杏為銀杏科銀杏屬植物。銀杏是裸子植物類，是目前地球上唯一能幸存下來的銀杏科銀杏屬植物，又稱為“活化石”[1]。銀杏分布地廣泛，在中國、朝鮮、韓國、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、法國、美國、俄羅斯等國家和地區(qū)均有種植。從地理資源分布來看，中國是世界上銀杏的主產(chǎn)區(qū)，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、河北、江蘇、山東、廣西、湖北、河南、浙江等省區(qū)。中國的銀杏跨越北緯2l°30′～41°46′，東經(jīng)97°～125°，遍及22個省及自治區(qū)和3個直轄市，主要分布于溫帶和亞熱帶氣候區(qū)[2]。銀杏既是國家一級保護植物，也是我國傳統(tǒng)重要的經(jīng)濟林和綠化樹種。中國的銀杏資源占全世界的85%，銀杏種植面積約40萬m2，栽培數(shù)量達25億株以上，銀杏種植每年都以2 000～2 500萬株速度遞增[3]。銀杏葉是銀杏的干燥葉子，目前相當多資料表明，銀杏葉具有斂肺、活血化瘀、止痛等功效，對冠心病、咳喘病、高脂血癥、心絞痛等疾病有一定的治療作用[4-5]。其最為主要的化學(xué)成分有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸、多糖類等[6]。目前，已知銀杏提取物的化學(xué)成分有200多種，其中藥用成分有170余種，主要有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸類、糖類、醇類、酮類、生物堿類、氨基酸微量元素及其他(維生素、葉綠體、生物堿類等)[7]。銀杏葉提取物及其制劑可用于健康食品、醫(yī)藥、化妝品及生物農(nóng)藥和生物飼料[8]，但銀杏葉提取物在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢棄液，而這些廢棄液都直接廢棄掉。

本研究對銀杏葉提取物生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄液中蛋白質(zhì)成分進行綜合回收利用，從廢棄液中分離制備出含量較高的蛋白質(zhì)，一方面，銀杏葉蛋白質(zhì)含有豐富的亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸，該6種人體必需氨基酸的含量達424.89 mg/g蛋白質(zhì)[9]，故從銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液來提取蛋白質(zhì)，變廢為寶，為保健品、蛋白粉等開發(fā)以及作為精飼料的添加提供原料保證；另一方面，由于銀杏葉生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量較高，因此，通過從銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液來提取蛋白質(zhì)，可以增加蛋白質(zhì)的來源途徑。蛋白質(zhì)是整個人類生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，無論是人類還是動物都離不開生命物質(zhì)蛋白質(zhì)，但是迄今為止，世界上仍然大約有1/5的人口缺乏蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)資源短缺和蛋白質(zhì)來源匱乏顯然已經(jīng)是當今世界尤其是發(fā)展中國家亟須解決的重大問題。

因此，探索新的蛋白質(zhì)資源途徑具有非常重要的現(xiàn)實意義，故采用廉價原料、試劑與儀器，設(shè)計出合適的工藝路線，為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)打開新的大門，為蛋白質(zhì)資源短缺提供緩沖的機會，同時也為廠家節(jié)約成本，實現(xiàn)經(jīng)濟效益最大化。因此有必要對銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)的純化工藝進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京))、紫外可見分光光度計(Cary 60 UV-Vis Agilent Technologies)、分液漏斗(泰州市康之達實驗器材)等；乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠)，正丁醇(分析純，上海申博化工)，三氯甲烷(重慶川江化學(xué)試劑廠家)，氫氧化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，酒石酸鉀鈉(成都金山化學(xué)試劑有限公司)，無水硫酸銅(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯(天津市富宇精細化工有限公司)等。

1.1.2 供試材料 酪蛋白對照品(上海廣銳生物科技有限公司)；銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液(浙江和陜西：廠家要求保密，不便于透露)。

1.2 方法

1.2.1 測定方法 本文選用雙縮脲比色法測定銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中的蛋白質(zhì)，其原理是：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與銅離子產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)，肽鍵越多反應(yīng)就越明顯。雙縮脲試劑使用的是“1.2.1”中①項下配制的。使用電子天平精密稱定浸膏并加純水稀釋，再加相應(yīng)的雙縮脲溶液反應(yīng)，然后在560 nm波長處，用紫外分光光度計測其吸光度。根據(jù)回歸曲線方程：y=0.064 5x-0.000 4，R2=0.998計算相應(yīng)的濃度。再結(jié)合以下兩個公式即可算出蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)=測定蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)× 樣液體積(mL)

蛋白質(zhì)含量=蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)/樣品的質(zhì)量(mg)×100%

(1)雙縮脲試劑的配制：使用電子天平精密稱定30.15 g氫氧化鈉溶于300 mL水中得到A液，使用電子天平精密稱定質(zhì)量為5.99 g的酒石酸鉀鈉和質(zhì)量為1.50 g的無水硫酸銅，然后溶解在500 mL的水中并混勻即得到B液，將A液和B液混合并搖勻即可得到雙縮脲試劑。

(2)0.05 mol/mL氫氧化鈉溶液使用電子天平精密稱取0.60 g氫氧化鈉溶于300 mL的蒸餾水中，攪拌混勻備用。

1.2.2 酪蛋白標準品溶液的制備 用分析天平精密稱定1.49 g酪蛋白于制備好的0.05 mol/mL的氫氧化鈉溶液當中，攪拌混勻即可得到標準品溶液。

1.2.3 樣品溶液制備 將來自不同廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄物料液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮得浸膏備用。

1.2.4 線性關(guān)系考察 取7支具塞試管，按梯度要求精密移取酪蛋白標準溶液，然后向7支具塞試管中立即加入6 mL的雙縮脲試劑，振蕩均勻，各管加完后將其置于室溫下反應(yīng)，反應(yīng)時間為30 min，然后在波長為560 nm下，以0管為空白對照，迅速逐一測量各管的吸光度。以標準品酪蛋白的濃度作為橫坐標，以各管的吸光度值作為縱坐標，然后繪制標準曲線如圖1：酪蛋白的線性范圍為(0.50～5.00) mg·mL-1，結(jié)果顯示R2>0.99具有良好的線性關(guān)系。

圖1 酪蛋白標準曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量的測定

將不同廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液按上述“1.2.3”進行前處理，然后精密移取5 mL純水加入“1.2.3”的樣品中，然后再移取2 mL溶液，分別加入6 mL的雙縮脲試劑，搖勻，靜置30 min，再按“1.2.1”進行測定，結(jié)果見表1。

表1 兩個廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢液中蛋白質(zhì)含量

結(jié)果表明：廠家不同，銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量不同，其中浙江廠家的蛋白質(zhì)含量為3.93%～5.09%，陜西廠家為8.34%～14.10%，原因是兩個廠家生產(chǎn)工藝不同，其中浙江廠家采用高濃度乙醇提取，而陜西廠家采用低醇提取。

2.2 銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)分離純化工藝研究

2.2.1 超濾純化研究 200 kg銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液浸膏，加純水200 kg，攪拌均勻后進行超濾，中間補水3次，每次加200 kg純水，透過液為超濾液，將該超濾液濃縮為浸膏。然后取樣，在向裝有樣品的試管里加入5 mL純水稀釋，取出2 mL溶液，再加入雙縮脲試劑，反應(yīng)時間為30 min，再按“1.2.1”進行測定，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，原料1經(jīng)過超濾后含量由3.93%提升到14.29%，原料2經(jīng)過超濾后含量由8.34%提升到44.38%，采用超濾的純化方式可以將蛋白質(zhì)含量提升5倍左右，表明該方法對蛋白質(zhì)的分離純化有顯著的作用，可以運用到蛋白質(zhì)的分離純化工藝當中。

2.2.2 萃取純化研究 量取80 mL的純水加入到裝有64.70 g原料浸膏的燒杯中溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，再加入20 mL乙酸乙酯，雙手托住分液漏斗，右手按住瓶塞，水平放置且上下振蕩，并將分液漏斗傾斜45°，打開活塞，將氣泡排除。然后將其放置在鐵架臺上，靜置分層，等到分層足夠明顯時，將下層的液體從下面放出去，將上層的液體從上面倒出來，然后留樣。重復(fù)上述操作4次。將每次的樣品加入純水稀釋5倍，然后用移液管取出2 mL于比色管中，并加入6 mL的雙縮脲溶液，反應(yīng)30 min，再按“1.2.1”進行測定，結(jié)果見表3。

表3 萃取結(jié)果

結(jié)果表明，采用乙酸乙酯萃取來分離純化銀杏葉提取物柱層析廢棄液中的蛋白質(zhì)，是沒有純化效果，說明該原料液中溶于乙酸乙酯的有機物含量很少。

2.2.3 醇沉純化研究 醇沉的原理：在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量與水可以互溶的乙醇，使蛋白質(zhì)表面失去水化層相互聚集而沉淀[10]。精密稱取浸膏165 g，在溫度為80 ℃水浴中加入500 mL 95%乙醇。加入乙醇的同時要不停攪拌，然后在常溫靜置沉淀，到深棕色沉淀變?yōu)槊S色沉淀時，將上清液傾出，將沉淀部分進行取樣。然后重復(fù)操作兩次并取樣。然后在向裝有樣品的試管里加入5 mL純水稀釋，取出2 mL溶液，再加入雙縮脲試劑，反應(yīng)30 min后，再按“1.2.1”進行測定，結(jié)果見表4。

表4 醇沉結(jié)果

從醇沉結(jié)果可以看出，含量從14.29%提升至34.62%，有顯著的提升。從表5可以看出，醇沉次數(shù)對蛋白質(zhì)的提升并沒有顯著的影響，結(jié)合生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率等方面的影響，選用醇沉次數(shù)為1次。

綜上，最終蛋白質(zhì)的分離純化選用超濾和醇沉這兩種方式。

3 結(jié)論

由上述結(jié)果可知，對銀杏葉生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)進行分離純化時，采用乙酸乙酯萃取不會提高蛋白質(zhì)的純度，有效提高蛋白質(zhì)純度的方法主要是超濾和醇沉，經(jīng)超濾和醇沉結(jié)合工藝進行銀杏葉蛋白質(zhì)的純化，可以將蛋白質(zhì)含量為8.43%的原料純化蛋白質(zhì)含量86.20%的產(chǎn)品。綜上所述，對銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)成分，采用超濾和醇沉進行純化，就能夠大幅提高蛋白質(zhì)純度，且操作簡單可行，工藝路線穩(wěn)定。

4 討論

對銀杏葉提取物生產(chǎn)的廢棄液中的蛋白質(zhì)進行提純工藝研究，本論文采用銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液為原料，分別采用萃取、超濾、醇沉三種方式進行純化研究，萃取的方式對蛋白質(zhì)的分離純化沒有顯著的效果，說明原料中有機類物雜質(zhì)很少；利用超濾的方式可以將蛋白質(zhì)含量提升5倍左右，是利用了蛋白質(zhì)分子量大，與小分子雜質(zhì)可以有效分離；而醇沉的方式可以將蛋白質(zhì)含量提高2倍左右，主要是利用了蛋白質(zhì)不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)來純化。