倪 琳，王 娟

(1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅蘭藥藥業(yè)有限公司，甘肅 蘭州 730046)

貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)是由黃芪、女貞子2味中藥組成的制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰的功效，具有提高人體免疫功能、保護(hù)骨髓和腎上腺皮質(zhì)功能的功效，常用于各種疾病引起的虛損，可配合手術(shù)、放射線、化學(xué)治療，促進(jìn)正常功能的恢復(fù)[1-4]。貞芪扶正系列產(chǎn)品原有質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，三個(gè)劑型原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)、含量測(cè)定項(xiàng)中樣品前處理繁瑣，且采用的是薄層色譜掃描法測(cè)黃芪甲苷的含量，其樣品斑點(diǎn)分離不好，測(cè)定數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，誤差較大。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[5-12]，貞芪扶正系列產(chǎn)品一般采用LC-MS、HPLC法測(cè)定貞芪扶正膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、紅景天苷等成分的含量，采用近紅外光譜法對(duì)貞茂扶正顆粒進(jìn)行快速鑒別等，但有關(guān)統(tǒng)一貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究旨在建立簡(jiǎn)單的樣品前處理HPLC法，統(tǒng)一貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量測(cè)定方法，為貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；METTLER AE240型電子天平(瑞士梅特勒公司)；薄層加熱板(瑞士CAMAG公司)；Waters ACQUITY ARC型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

1.2.1 對(duì)照品 黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-201717，以96.9%計(jì))，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)111920-201606，以97.6%計(jì))，特女貞苷對(duì)照品(111926-201605，以93.3%計(jì))，以上對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2.2 供試品 由甘肅蘭藥藥業(yè)有限公司提供30批貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)；試劑：甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(32∶68)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液10 μL、25 μL，供試品溶液20 μL；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算>4 000[13]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照11.60 mg至25 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容，即得(此濃度適用于貞芪扶正片和貞芪扶正膠囊含量的計(jì)算)。再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(此濃度適用于貞芪扶正顆粒的含量計(jì)算)。

2.1.3 供試品溶液的制備 取貞芪扶正片樣品20片，精密稱定，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定；取貞芪扶正膠囊樣品10粒，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)樣品10袋，精密稱定，研細(xì)，取約2 g，精密稱定；分別置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻)50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用含4%濃氨溶液的80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取貞芪扶正顆粒(含糖型)樣品10袋，精密稱定，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻)50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用含4%濃氨溶液的80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇液提取4次，每次50 mL，合并正丁醇液，蒸干，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含黃芪的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖1。結(jié)果樣品中黃芪甲苷達(dá)到基線分離，且陰性無(wú)干擾。

注：A．對(duì)照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；D.供試品(貞芪扶正顆粒無(wú)糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對(duì)照(1.黃芪甲苷)。圖1 黃芪HPLC圖譜

2.1.6 線性關(guān)系考察 (1)貞芪扶正片和貞芪扶正膠囊線性關(guān)系考察：精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.449 6 mg/mL)1 mL、3 mL、4 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL、0.134 88 mg/mL、0.179 85 mg/mL)，各濃度進(jìn)樣體積為20 μL。精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.449 6 mg/mL)5 mL置10 mL

量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.224 8 mg/mL)，進(jìn)樣體積為30 μL。精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.449 6 mg/mL)1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.089 92 mg/mL)，進(jìn)樣體積為20 μL。以上得到系列進(jìn)樣量的黃芪甲苷對(duì)照品，測(cè)得峰面積的積分值，以峰面積的積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(logA)，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg) 的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(logc)，作圖，得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的一條直線，回歸方程：logA=2.149 8logc+3.846 6，r=0.996 5。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.899 2～6.744 2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

(2)貞芪扶正顆粒線性關(guān)系考察：精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.089 9 mg/mL)2.5 mL、4 mL、5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.022 5 mg/mL、0.035 97 mg/mL、0.044 96 mg/mL)，各濃度進(jìn)樣體積為20 μL。精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.089 92 mg/mL)5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL)，進(jìn)樣體積為30 μL。精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品(0.089 92 mg/mL)5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL)，進(jìn)樣體積為50 μL。以上得到系列進(jìn)樣量的黃芪甲苷對(duì)照品，測(cè)得峰面積的積分值，以峰面積的積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(logA)，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg) 的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(logc)，作圖，得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的一條直線，回歸方程：logA=1.183 0logc+4.462 0，r=0.998 6。結(jié)果表明，貞芪扶正顆粒中黃芪甲苷在0.449 6～2.248 1 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度對(duì)照品溶液20 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芪甲苷峰面積，RSD為1.39%，表明此方法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)供試品溶液20 μL，每隔2 h進(jìn)樣測(cè)定1次，結(jié)果在12 h內(nèi)，供試品(貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒無(wú)糖型、貞芪扶正顆粒含糖型)溶液中黃芪甲苷峰面積穩(wěn)定，RSD分別為3.03%、3.62%、1.03%、2.29%。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(貞芪扶正片批號(hào)：20190405；貞芪扶正膠囊批號(hào)：J20170309；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)批號(hào)：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號(hào)：K20200201)供試品按擬定的含量測(cè)定方法依法測(cè)定黃芪甲苷含量，獨(dú)立測(cè)定6次，RSD分別為2.07%、1.27%、1.56%、1.94%。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量[貞芪扶正片含黃芪甲苷1.213 3 mg/g、貞芪扶正膠囊含黃芪甲苷 2.414 4 mg/g、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)含黃芪甲苷 0.546 5 mg/g、貞芪扶正顆粒(含糖型)含黃芪甲苷0.277 6 mg/g]的供試品適量[貞芪扶正片約0.75 g、貞芪扶正膠囊約0.5 g、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)約1 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約2～3 g]6份，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品溶液(濃度0.089 9 mg/mL、0.443 8 mg/mL、0.395 7 mg/mL、0.277 6 mg/mL)，按供試品含量測(cè)定方法依次測(cè)定，結(jié)果測(cè)得黃芪甲苷的平均回收率分別為99.08%、97.06%、98.92%、97.06%，RSD分別為2.76%、2.74%、2.55%、2.74%(n=6)。見(jiàn)表1。

表1 貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)片中黃芪甲苷的加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相以乙腈-0.2%甲酸溶液(17∶83)為流動(dòng)相；理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算>3 000[13]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品11.00 mg(含量以97.6%計(jì))置100 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容至刻度。[此濃度適用于貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)]。再精密吸取3 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，作為對(duì)照品溶液[此濃度適用于貞芪扶正顆粒(含糖型)]，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取貞芪扶正片樣品20片，精密稱定，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定；取貞芪扶正膠囊樣品10粒，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型) 樣品10袋，精密稱定，研細(xì)，取約2 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(含糖型)樣品10袋，精密稱定，研細(xì)，取約5 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含黃芪的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖2。結(jié)果樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷達(dá)到基線分離，且陰性無(wú)干擾。

注：A．對(duì)照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；.供試品(貞芪扶正顆粒無(wú)糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對(duì)照(1.毛蕊異黃酮葡萄萄苷)。圖2 黃芪HPLC圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 (1)貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)線性關(guān)系考察：精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(0.107 4 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.010 7 mg/mL、0.021 5 mg/mL、0.042 9 mg/mL、0.064 4 mg/mL、0.085 9 mg/mL、0.107 4 mg/mL)，各濃度進(jìn)樣體積為10 μL。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(0.107 4 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.064 416 mg/mL)，進(jìn)樣體積為20 μL。以上得到系列進(jìn)樣量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，測(cè)得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(A)，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為

橫坐標(biāo)(C)，作圖，得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的一條直線，回歸方程：A=3.430 4×106C+5.322 0×104，r=0.999 7。結(jié)果表明，貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.214 7～1.288 3 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

(2)貞芪扶正顆粒(含糖型)線性關(guān)系考察：精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(0.032 2 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.006 4 mg/mL、0.012 9 mg/mL、0.019 3 mg/mL、0.025 8 mg/mL、0.322 1 mg/mL)，各濃度進(jìn)樣體積為10 μL。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(0.032 2 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.019 32 mg/mL)，進(jìn)樣體積為20 μL。以上得到系列進(jìn)樣量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，測(cè)得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(A)，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(C)，作圖，得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的一條直線，回歸方程：A=3.424 2×106C+1.875 4×104，r=0.999 7。結(jié)果表明，貞芪扶正顆粒(含糖型)中毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.064 4～0.386 5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一濃度毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(濃度為0.042 9 mg/mL)，進(jìn)樣量：10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，RSD為0.21%，表明此方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(貞芪扶正片批號(hào)：20190405；貞芪扶正膠囊批號(hào)：J20191004；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)批號(hào)：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號(hào)：K20170311)，每隔2h進(jìn)樣1次，結(jié)果在12 h內(nèi)，供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.33%、0.26%、0.61%、0.54%。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)[貞芪扶正片批號(hào)：20190405；貞芪扶正膠囊批號(hào)：J20191004；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)批號(hào)：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號(hào)：K20170311]供試品按擬定的含量測(cè)定方法依法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，獨(dú)立測(cè)定6次，RSD分別為0.76%、1.30%、0.78%、0.87%。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品適量[貞芪扶正片約0.5 g、貞芪扶正膠囊約0.2～0.3 g、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)約0.4 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約0.4～0.6 g]6份，分別精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(濃度0.107 4 mg/mL)，按供試品含量測(cè)定方法依次測(cè)定，結(jié)果測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為97.83%、98.27%、98.78%、98.71%；RSD為3.08%、2.74%、2.12%、2.57%(n=6)。見(jiàn)表2。

表2 貞芪扶正系列產(chǎn)品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.3 特女貞苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：以甲醇-水(40∶60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm。理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)算>4 000[13]。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取特女貞苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.079 9 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 貞芪扶正片：取20片，精密稱定，研細(xì)，取約1 g；貞芪扶正膠囊：取本品10粒，精密稱定，研細(xì)，取約1 g；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)取本品10袋，精密稱定，研細(xì)，取約2 g，貞芪扶正顆粒(含糖型)取約5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含女貞子的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖3。結(jié)果樣品中特女貞苷達(dá)到基線分離，且陰性無(wú)干擾。

注：A.對(duì)照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；D.供試品(貞芪扶正顆粒無(wú)糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對(duì)照(1.特女貞苷)。圖3 女貞子 HPLC圖譜

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取特女貞苷對(duì)照品(0.082 8 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(特女貞苷的濃度為0.016 556 mg/mL、0.033 1 mg/mL、0.049 7 mg/mL、0.066 2 mg/mL、0.082 8 mg/mL)，各濃度進(jìn)樣體積為10 μL。精密吸取特女貞苷對(duì)照品(0.082 8 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(特女貞苷的濃度為0.049 7 mg/mL)，進(jìn)樣體積為20 μL。以上得到系列進(jìn)樣量的特女貞苷對(duì)照品，測(cè)得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(A)，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(C)，作圖，得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的一條直線，回歸方程：A=1.323 2×106C+1.403×103，r=0.999 8。結(jié)果表明，貞芪扶正系列產(chǎn)品中含特女貞苷在0.165 5～0.993 3 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取同一濃度特女貞苷對(duì)照品溶液(濃度為0.082 8 mg/mL)，進(jìn)樣量：5 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定特女貞苷峰面積，RSD為0.25%，表明此方法精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液[貞芪扶正片批號(hào)：20190405；貞芪扶正膠囊批號(hào)：J20190619；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)批號(hào)：K20170222；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號(hào)：K20170355]，每隔2 h進(jìn)樣1次，結(jié)果在12 h內(nèi)，供試品溶液中特女貞苷峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.35%、1.81%、0.26%、0.35%。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)[貞芪扶正片批號(hào)：20190405；貞芪扶正膠囊批號(hào)：J20191004；貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)批號(hào)：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號(hào)：K20170311]供試品按擬定的含量測(cè)定方法依法測(cè)定特女貞苷含量，獨(dú)立測(cè)定6次，RSD分別為0.48%、1.55%、1.16%、1.03%。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品適量[貞芪扶正片約0.1～0.2 g、貞芪扶正膠囊約0.1 g、貞芪扶正顆粒(無(wú)糖型)約0.2～0.4 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約0.5～0.7 g]6份，分別精密加入一定量的特女貞苷對(duì)照品溶液，按供試品含量測(cè)定方法依次測(cè)定，結(jié)果測(cè)得特女貞苷的平均回收率分別為99.62%、98.28%、97.01%、101.37%，RSD分別為2.13%、2.61%、1.67%、3.03%(n=6)。見(jiàn)表3。

表3 貞芪扶正系列產(chǎn)品中特女貞苷的加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.3.11 樣品的測(cè)定 按“2.1.3”“2.2.3”“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算貞芪扶正系列產(chǎn)品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量。見(jiàn)表4。

表4 貞芪扶正系列產(chǎn)品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

(1)樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取方法的選擇。采用甲醇超聲和加熱回流提取樣品、稀乙醇加熱回流和甲醇加熱回流提取樣品，采用甲醇分別測(cè)定不同提取時(shí)間：超聲1 h、1.5 h以及加熱回流1 h、2 h、4 h、5 h樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，結(jié)果采用甲醇加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較高。采用稀乙醇和甲醇分別加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷，結(jié)果采用甲醇加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較高，故本研究采用甲醇溶液加熱回流4 h的提取方法。

(2)樣品中黃芪甲苷的提取時(shí)間的確定。采用含4%氨試液的80%甲醇溶液超聲和加熱回流提取樣品，分別測(cè)定不同提取時(shí)間：超聲30 min、40 min、60 min、90 min以及加熱回流1 h、2 h樣品中黃芪甲苷的含量，結(jié)果加熱回流1 h樣品中黃芪甲苷的含量較高，故本研究采用含4%氨試液的80%甲醇溶液加熱回流1 h的提取方法。

(3)色譜柱的選擇。選用Capcell pak C18色譜柱、Diamonsil C18色譜柱、Phenomenex C18色譜柱3 個(gè)不同品牌色譜柱測(cè)定樣品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量基本一致，結(jié)果3個(gè)品牌色譜柱均能使樣品中3種成分達(dá)到基線分離，且重現(xiàn)性較好，能夠滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。