周立濤 陶善東 史文婷 鄧媛 朱家斌

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院血液科，江蘇 淮安 223300)

白血病是一種侵襲性血液惡性腫瘤，其特征是未成熟髓樣細(xì)胞的異常增殖和分化〔1〕。盡管治療方法不斷增加，但大多數(shù)患者仍會復(fù)發(fā)并在緩解后死亡，預(yù)后仍然不理想〔2〕。探索新的生物標(biāo)志物用于白血病的診斷、預(yù)后和治療靶標(biāo)十分必要，以便制定更有效的監(jiān)測和治療方案。近年來，非編碼(nc)RNA，包括長鏈(l)ncRNA和微小RNA(miR)，因其在白血病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用而受到越來越多的關(guān)注〔3〕。lncRNA是一組進(jìn)化保守的ncRNA，長于200個核苷酸，可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔4〕。lncRNA常在人類惡性腫瘤中異常表達(dá)，并參與廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和癌變〔5〕。既往研究表明，lncRNA ENST00000415964在急性髓細(xì)胞性白血病患者中表達(dá)下調(diào)〔6〕，但其在白血病中的生物學(xué)功能與機(jī)制尚不清楚。miR是另一類短的單鏈ncRNA，長度約為20個核苷酸，miR通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，在基因表達(dá)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用〔7〕。在這些miR中，miR-214已被證明在白血病患者中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)有助于增強(qiáng)耐藥的慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對氟達(dá)拉濱的敏感性〔8〕，表明miR-214可能成為白血病潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。資料顯示，lncRNA可充當(dāng)競爭性內(nèi)源(ce)RNA調(diào)控miR的表達(dá)，隨后在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控miR靶基因的表達(dá)，從而影響癌癥進(jìn)展〔9〕。但ENST00000415964是否可作為miR-214海綿調(diào)節(jié)白血病的發(fā)生發(fā)展過程仍然未知。DKK3是一種抑癌基因，DKK3基因mRNA的相對表達(dá)在急性髓性白血病患者中顯著下調(diào)，其甲基化水平是患者預(yù)后的重要影響因素〔10〕。本研究探討ENST00000415964調(diào)控在miR-214/DKK3對急性白血病細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本 在2015～2018年南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院血液科的32例急性白血病患者和17例健康者(對照組)中獲取臨床標(biāo)本。本研究獲得患者及其家屬知情同意，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。急性白血病患者是根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的造血和淋巴組織腫瘤分類(2016年)〔11〕進(jìn)行初步診斷。使用Ficoll溶液進(jìn)行單核細(xì)胞的分離，用于實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測。

1.2細(xì)胞與主要試劑 白血病細(xì)胞K562購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco，Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen，PrimeScriptTMRT試劑盒、Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa，細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自日本Dojindo，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、DKK3抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自英國Abcam，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore，碘化丙啶(PI)細(xì)胞周期分析試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海Beyotime。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 細(xì)胞K562在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2、飽和濕潤條件下孵育。pcDNA3.1-ENST00000415964及其陰性對照pcDNA3.1、miR-214及其陰性對照miR-NC、anti-miR-214及其陰性對照anti-miR-NC、si-DKK3及其陰性對照si-NC均獲自上海GenePharma。將對數(shù)生長期的細(xì)胞K562分為pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-ENST00000415964組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00000415964)，pcDNA3.1-ENST0-0000415964+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST-00000415964和miR-NC)，pcDNA3.1-ENST00000-415964+miR-214組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00-000415964和miR-214)，pcDNA3.1-ENST00000415-964+si-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-NC)，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-DKK3)，miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)，miR-214組(轉(zhuǎn)染miR-214)，anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)，anti-miR-214組(轉(zhuǎn)染anti-miR-214)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，將細(xì)胞K562接種于6孔板，每孔1×105個細(xì)胞，細(xì)胞匯合至70%密度時，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說明書指示，按照上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4qRT-PCR檢測ENST00000415964、miR-214表達(dá) 使用TRIZOL試劑提取急性白血病患者樣品和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞K562的總RNA，采用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，利用Premix Ex Taq試劑盒于ABI 7500系統(tǒng)中進(jìn)行qRT-PCR。引物序列如下：ENST00000415964正向5′-CTCCAAGCATGACACAGACA-3′，反向5′-CCTTTAAGTCCCCAATTCCA-3′；GAPDH正向5′-CGCTCTC-TGCTCCTCCTGTTC-3′，反向5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-214正向5′-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3′，反向5′-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3′；U6正向5′-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。ENST00000415964的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，miR-214的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為U6，并通過2-△△Ct法進(jìn)行計算。

1.5CCK-8法分析細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞K562以5×103個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，48 h加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育，2 h后于酶標(biāo)儀測定450 nm處的細(xì)胞吸光度，計算細(xì)胞存活率(%)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞周期和凋亡 PI細(xì)胞周期分析試劑盒用于評估K562細(xì)胞的周期。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒用于檢測K562細(xì)胞的凋亡。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞K562以1×105個細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)48 h后，用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗并離心以除去上清液。根據(jù)試劑盒說明書的步驟，通過FACScan流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞的周期和凋亡。

1.7Western印跡測定P21、Caspase-3、DKK3蛋白表達(dá) 向細(xì)胞K562中加入RIPA裂解液以提取蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒的步驟估算蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉2 h，與稀釋度為1∶1 000的P21、Caspase-3、DKK3一抗孵育過夜，與HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，然后使用增強(qiáng)的化學(xué)液顯影曝光。GAPDH被用作對照，以分析P21、Caspase-3、DKK3蛋白表達(dá)。

1.8生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實驗驗證ENST00000415964對miR-214、miR-214對DKK3的靶向調(diào)控 在線預(yù)測工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ENST00000415964的3′UTR含有miR-214的互補(bǔ)序列，DKK3的3′UTR含有miR-214的互補(bǔ)序列。分別合成包含miR-214互補(bǔ)位點的ENST00000415964或DKK3的3′UTR野生型(WT)結(jié)合序列，并將其克隆到pmirGLO熒光素酶載體，以生成WT-ENST00000415964或WT-DKK3。構(gòu)建相應(yīng)的突變型(MUT)序列，并將其克隆到相同的載體中，即MUT-ENST00000-415964或MUT-DKK3。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞K562接種于24孔板，使用Lipofectamine 2000試劑分別將WT-ENST00000415964或MUT-ENST00000415964與miR-NC或miR-214共轉(zhuǎn)染，WT-DKK3或MUT-DKK3與miR-NC或miR-214共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，并使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、組間多重比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1ENST00000415964在急性白血病患者和對照組骨髓細(xì)胞中的表達(dá) 急性白血病患者ENST00000415964表達(dá)量(0.29±0.03)明顯少于對照組(1.00±0.05；t=62.241，P=0.000)。

2.2過表達(dá)ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964組細(xì)胞K562的G0期細(xì)胞百分比顯著增加，S期顯著減少，細(xì)胞存活率顯著降低，P21蛋白表達(dá)量顯著提高(P<0.001)，而G1期細(xì)胞百分比無顯著變化(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 過表達(dá)ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖的影響

圖1 P21蛋白表達(dá)

2.3過表達(dá)ENST00000415964對細(xì)胞K562凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1ENST-00000415964組細(xì)胞K562中ENST0-0000415964表達(dá)量、細(xì)胞的凋亡率及Caspase-3蛋白水平顯著提高(P<0.001)。見表2、圖2。

表2 過表達(dá)ENST00000415964對細(xì)胞K562凋亡的影響

1，2：pcDNA3.1組，pcDNA3.1-ENST00000415964組

2.4ENST00000415964靶向調(diào)控miR-214 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-214是ENST000-00415964的候選靶基因。見圖3。與miR-NC和WT-ENST00000415964共轉(zhuǎn)染(1.00±0.05)相比，miR-214和WT-ENST00000415964共轉(zhuǎn)染明顯降低細(xì)胞K562的熒光素酶相對活性(0.36±0.03；t=32.928，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-ENST00000415964共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞K562的熒光素酶相對活性無顯著變化〔(0.99±0.06)vs(0.97±0.05)；t=0.768，P=0.454〕。與pcDNA3.1組(1.01±0.05)相比，pcDNA3.1-ENST00000415964組明顯減少細(xì)胞K562內(nèi)miR-214表達(dá)量(0.23±0.03；t=40.131,P=0.000)。

2.5過表達(dá)miR-214能減輕ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214組細(xì)胞K562的G0期細(xì)胞百分比明顯減少，S期明顯增加(P<0.001)，而G1期細(xì)胞百分比無明顯變化(P>0.05)，細(xì)胞存活率明顯提高，凋亡率明顯降低(P<0.001)，miR-214表達(dá)量明顯增加，P21和Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.001)。見表3、圖4。

圖3 ENST00000415964靶向miR-214

表3 過表達(dá)miR-214能減輕ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖、凋亡及相關(guān)蛋白的影響

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC組，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214組

2.6抑制DKK3能減輕ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1-ENST00000-415964+si-NC組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組細(xì)胞K562的G0期細(xì)胞百分比明顯減少，S期明顯增加(P<0.001)，而G1期無明顯變化(P>0.05)，細(xì)胞存活率明顯提高，凋亡率明顯降低(P<0.001)，DKK3、P21和Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.001)。見圖5、表4、表5。

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+si-NC組，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組

表4 抑制DKK3能減輕ENST00000415964對細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響

表5 P21、Caspase-3、DKK3蛋白的表達(dá)

2.7miR-214靶向調(diào)控DKK3 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，DKK3的3′UTR含有miR-214的互補(bǔ)序列。見圖6。與miR-NC和WT-DKK3共轉(zhuǎn)染(0.96±0.06)相比，miR-214和WT-DKK3共轉(zhuǎn)染明顯減少細(xì)胞K562的熒光素酶活性(0.20±0.03；t=33.988，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-DKK3共轉(zhuǎn)染細(xì)胞K562的熒光素酶活性無顯著變化〔(0.97±0.06)vs(0.98±0.06)；t=0.354，P=0.728〕。與miR-NC組(0.28±0.03)相比，miR-214組明顯減少細(xì)胞K562的DKK3蛋白表達(dá)量(0.09±0.01；P<0.05)，與anti-miR-NC組(0.30±0.03)相比，anti-miR-214組顯著提高DKK3蛋白水平(0.63±0.04；P<0.05)。見圖7。

圖6 DKK3的3′UTR含有miR-214的互補(bǔ)序列

1～4:miR-NC組,miR-214組，anti-miR-NC組，anti-miR-214組圖7 DKK3蛋白的表達(dá)

3 討 論

隨著高通量分析的發(fā)展，已經(jīng)鑒定出越來越多與腫瘤相關(guān)的ncRNA，特別是lncRNA、miR和mRNA已被證明通過各種生物學(xué)過程發(fā)揮著多種功能，它們的失調(diào)可能觸發(fā)和(或)促進(jìn)病理改變〔12〕。本研究證明了lncRNA ENST00000415964在白血病患者中的表達(dá)顯著下調(diào)，而ENST00000415964的過表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，同時誘導(dǎo)其凋亡。ENST00000415964充當(dāng)ceRNA，通過競爭性的結(jié)合miR-214來調(diào)控DKK3的表達(dá)，影響白血病細(xì)胞的增殖、周期和凋亡過程。

據(jù)報道，lncRNA在癌細(xì)胞的惡性表型中起重要作用，lncRNA在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，其失調(diào)會產(chǎn)生致癌或腫瘤抑制功能，與包括白血病在內(nèi)的疾病密切相關(guān)〔13，14〕。如lncRNA HAND2-AS1在慢性粒細(xì)胞白血病中被下調(diào)，通過上調(diào)miR-1275表達(dá)，抑制白血病細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡〔15〕。SNHG16在急性淋巴細(xì)胞白血病中被上調(diào)，其下調(diào)通過對hsa-miR-124-3p的相互作用，可能在白血病中發(fā)揮腫瘤抑制作用〔16〕。Cao等〔17〕分析了兒童急性髓細(xì)胞性白血病患者骨髓樣本中l(wèi)ncRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，兒童急性髓細(xì)胞性白血病中ENST00000415964下調(diào)了10倍以上。然而，對于ENST00000415964在白血病細(xì)胞增殖、周期和凋亡中作用知之甚少。本研究中32例急性白血病患者骨髓樣品中的ENST00000415964被下調(diào)，與Cao等〔17〕研究一致。本研究結(jié)果表明ENST00000415964可抑制白血病細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示出一定的抗癌活性。

lncRNA通常通過充當(dāng)miR的海綿，來抵消miR介導(dǎo)的下游靶標(biāo)mRNA或信號通路的阻遏作用，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用〔18〕。miR已被證明與白血病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，可作為診斷和預(yù)后的新生物標(biāo)志物，并成為白血病的潛在治療靶標(biāo)〔19〕。據(jù)報道，miR-214在白血病患者中表達(dá)上調(diào)〔8〕，轉(zhuǎn)染miR-214抑制劑顯著上調(diào)第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡〔20〕。miR-214通過靶向ABCB1基因表達(dá)，調(diào)節(jié)慢性髓性白血病患者的甲磺酸伊馬替尼耐藥〔21〕。本研究發(fā)現(xiàn)miR-214與ENST00000415964存在靶向結(jié)合位點，提示ENST00000415964負(fù)調(diào)控miR-214的表達(dá)。功能實驗分析說明，lncRNA ENST00000415964通過靶向miR-214來調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的增殖、周期和凋亡。

miRNA參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔22〕。miRNA通過結(jié)合靶mRNA的3′UTR，在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。生物信息學(xué)軟件分析表明，DKK3的3′UTR部分核苷酸序列可與miR-214形成互補(bǔ)配對。進(jìn)一步使用熒光素酶報告試驗，證明DKK3是miR-214的潛在靶基因。據(jù)報道，DKK3位于染色體11p5.1，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，DKK3高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)〔23〕。并且，在急性白血病患者中，DKK3表現(xiàn)出高甲基化，這可能是白血病重要的發(fā)病機(jī)制〔24〕。本研究結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)miR-214/DKK3途徑，ENST00000415964可以抑制白血病的發(fā)生發(fā)展。

綜上，lncRNA ENST00000415964在急性白血病患者中表達(dá)下調(diào)，具有抑制白血病細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并且其機(jī)制與靶向miR-214調(diào)控DKK3的表達(dá)有關(guān)。