孫金霞 馬桂芳 史衛(wèi)紅 黃思怡 楊李 李啟松 吳芹

(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院，江蘇 鹽城 224005)

肝細胞癌(HCC)致死率在腫瘤中居第三位，僅次于肺癌和胃癌〔1〕。目前針對HCC的治療尚無有效辦法，無論靶向藥物或傳統(tǒng)化療方案均無法為HCC患者帶來滿意的治療效果。附子作為“百藥之長”，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效。研究發(fā)現(xiàn)，附子對腫瘤細胞SGC-7901具有抑制生長的作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，附子總生物堿能有效緩解小鼠誘導出現(xiàn)的乳腺癌身體冰冷、血塊淤積等癥狀〔3〕。董蘭鳳等〔4〕發(fā)現(xiàn)，將附子多糖和阿霉素連用，能誘導腫瘤細胞凋亡，且連用能有效激活特異性T細胞免疫，從而起到抗腫瘤的效果。附子中主要化學成分有生物堿、多糖、苷類等〔5，6〕。附子多糖抗腫瘤作用日益被重視，主要成分是葡萄糖，另含有半乳糖、甘露糖等〔7〕，目前國內(nèi)對附子多糖抗HCC作用及機制進行了初步研究〔8，9〕。本研究旨在探討沉默去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)基因對附子多糖靶向治療HCC的機制。

1 材料與方法

1.1細胞株與培養(yǎng) 293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，HepG2細胞購自美國ATCC公司。HepG2細胞和293T細胞均使用DMEM培養(yǎng)基(均含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。

1.2動物與分組 24只雄性SPF級Balb/c裸鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院實驗動物中心；建立HCC模型后將動物按照體重隨機分為4組：HepG2-NC siRNA+生理鹽水(A組)，HepG2-ASGPR siRNA+生理鹽水(B組)，HepG2-NC siRNA+附子多糖(C組)，HepG2-ASGPR siRNA+附子多糖(D組)，每組6只。

1.3附子多糖 采用文獻〔7〕方法提取附子多糖。用于動物灌胃給藥時，附子多糖采用研磨法生理鹽水混懸使用；用于細胞實驗時，附子多糖粉末用磷酸鹽緩沖液(PBS)或無血清培養(yǎng)基配制成相應濃度的多糖溶液，細胞培養(yǎng)時使用0.22 μm無菌濾器過濾即可。

1.4試劑與儀器 慢病毒載體(GFP標簽)購自蘇州瑞昊生物技術有限公司，靶向沉默ASGPR的RNA干擾序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成〔10〕。RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶和連接酶均購自日本TaKaRa公司，質粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，β-actin和ASGPR抗體購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒、真核細胞蛋白提取試劑盒、抗體稀釋液、聚偏氟乙烯(PVDF)/NC膜、ECL顯影試劑和二抗等均購自碧云天生物技術公司，超凈工作臺購自蘇凈公司，CO2培養(yǎng)箱購自三洋公司，流式細胞儀購自美國BD公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Western印跡電轉設備購自美國伯樂公司。

1.5方法

1.5.1重組慢病毒干擾載體與病毒制備 以RNAi序列為正義鏈，以其互補鏈為反義鏈，分別在正、反義鏈之間加入Loop(UUCAAGAGA)，同時在正義鏈5′端和反義鏈3′端加入不同酶切位點，從而形成siRNA發(fā)夾結構shRNA，將該shRNA序列及其互補序列利用連接酶與慢病毒載體進行基因重組，重組載體記為lenti-ASGPR siRNA組；陰性對照RNAi序列處理相同，記為lenti-NC siRNA組。使用質粒提取試劑盒制備重組慢病毒質粒，然后使用293T細胞進行慢病毒包裝，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用熒光顯微鏡觀察熒光強度和細胞生長狀態(tài)，收集病毒上清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2HepG2細胞穩(wěn)定沉默ASGPR細胞株 獲得與鑒定慢病毒顆粒感染HepG2細胞，然后經(jīng)流式細胞儀分選綠色熒光蛋白(GFP)陽性的細胞，擴大培養(yǎng)，流式細胞儀分析細胞GFP表達的陽性率，以確定是否穩(wěn)定轉染。然后提取細胞總蛋白，Western印跡檢測ASGPR表達量，利用抗ASGPR2抗體(1∶1 000)進行一抗孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG二抗(1∶200)孵育，以確定ASGPR的表達是否成功被沉默。

1.5.3體外細胞增殖實驗 分別收集對數(shù)期HepG2-NC siRNA和HepG2-ASGPR siRNA細胞，取少許進行臺盼藍計數(shù)，確定活細胞比例，確定生長良好后調(diào)節(jié)細胞懸液濃度按每孔加3×103個/100 μl細胞鋪至96孔板，各設3個復孔，按照50 μg/ml添加附子多糖，置于37℃，5%CO2孵育48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450 nm時，各孔的吸光度值。

1.5.4裸鼠HCC原位移植瘤模型的建立 按照文獻〔11〕方法，取對數(shù)生長期HepG2-ASGPR siRNA和HepG2-NC siRNA細胞，分別用PBS制成單細胞懸液，濃度為5×105/ml，每只小鼠注射的細胞量為1×106/2 ml PBS，利用高壓水流動力學的注射方法在5～8 s內(nèi)將細胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，注射后次日開始給予附子多糖(500 mg/kg)。4 w后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計數(shù)肝臟腫瘤結節(jié)數(shù)并稱重。

1.6統(tǒng)計學方法 采用GraphPad prism5.0軟件進行方差分析、t檢驗，流式細胞儀分析結果使用FlowJo7.6 軟件處理作圖。

2 結 果

2.1慢病毒包裝GFP陽性細胞 視野下細胞均表達熒光強烈，且細胞生長良好，見圖1，說明病毒包裝成功，收集病毒上清并用0.22 μm的無菌濾器過濾，用于HepG2細胞感染。

2.2HepG2不同轉染組細胞中GFP和ASGPR的表達情況 lenti-NC siRNA組和lenti-ASGPR siRNA組HepG2細胞均成功表達GFP，轉染效率高達99%以上。A組ASGPR蛋白表達水平(0.989±0.008)顯著高于B組(0.473±0.011，P<0.001)。見圖2。

圖1 293T細胞包裝慢病毒后的細胞熒光(×100)

圖2 Western印跡檢測AGSPR2水平

2.3RNA干擾ASGPR表達后，附子多糖對肝癌細胞體外增殖的影響 A組與B組細胞株增殖無明顯差異(P>0.05)。C組OD450值顯著低于A組， D組OD450值顯著低于B組(P<0.05)，表明附子多糖對可顯著抑制肝癌細胞的體外增殖。D組細胞的OD450值顯著高于C組細胞的OD450值(P<0.05)，表明ASGPR表達的缺失，使附子多糖的體外抑制肝癌細胞增殖的能力下降，推測ASGPR可能在附子多糖抗肝癌細胞增殖中發(fā)揮作用。見表1。

2.4RNA干擾ASGPR表達后，附子多糖對裸鼠肝癌成瘤的影響 利用高壓水流動力學建立肝癌原位移植瘤模型，見表1和圖3，模型建立成功。C組與A組相比， D組與B組相比，在腫瘤結節(jié)數(shù)、肝臟重量顯著下降(P<0.05)，表明附子多糖可顯著抑制裸鼠肝癌成瘤。而D組腫瘤結節(jié)個數(shù)和肝臟重量顯著高于C組(P<0.05)，表明干擾ASGPR表達后，附子多糖的體內(nèi)抑癌能力下降，該結果與體外抑瘤趨勢一致，充分表明ASGPR在附子多糖抗肝癌中的重要作用。

表1 各組OD450、腫瘤結節(jié)數(shù)、肝臟重量比較

圖3 附子多糖對各組HCC的影響

3 討 論

溫陽散寒中藥對許多晚期癌癥患者出現(xiàn)的陽虛寒凝臨床表現(xiàn)有較好療效。附子來源于毛茛科多年生草本植物烏頭，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效，臨床用于治療各種亡陽癥、虛寒癥、寒痹癥等。附子多糖是附子的多糖類成分，是附子發(fā)揮作用的主要成分之一。

肝細胞表面存在多種糖鏈識別受體,如甘露糖受體、半乳糖受體等〔12〕。ASGPR是一種跨膜蛋白，是主要表達在肝竇狀隙和基底外側細胞表面的受體。人肝癌細胞系HepG2能高表達ASGPR，其表達的ASGPR約為22.5萬個〔13〕，是研究ASGPR的理想細胞。ASGPR的胞外結構域含有糖識別結構域,能識別和結合半乳糖殘基和 N-乙酰半乳糖胺殘基,當與特異的糖殘基結合后,即發(fā)生受體介導的胞吞作用〔14，15〕。有研究發(fā)現(xiàn)當歸多糖可靶向肝臟富集,且可能通過 ASGPR 介導進入肝臟細胞〔16〕，從而影響肝癌細胞的生物學功能。