周剛 吳輝 劉滴 李云曌 張棟

(三峽大學(xué)心血管病研究所 宜昌市中心人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

心血管疾病(CVD)是導(dǎo)致死亡的最主要原因，具有發(fā)病率高且預(yù)后不良的特點(diǎn)〔1〕。來自歐洲的一項(xiàng)流行病調(diào)查顯示，CVD的發(fā)病率逐年升高〔2〕。中國心血管健康與疾病報(bào)告2019概要中指出我國CVD死亡率也呈現(xiàn)上升趨勢，并且位居各種疾病死亡原因首位〔3〕。CVD的發(fā)生發(fā)展涉及多種細(xì)胞死亡形式，包括凋亡、自噬及壞死等。既往研究認(rèn)為，細(xì)胞自噬和凋亡是主動(dòng)的可調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞壞死是被動(dòng)的不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)至少有一部分壞死受信號(hào)調(diào)節(jié)，這種壞死細(xì)胞死亡形式同時(shí)具有壞死和凋亡的特點(diǎn)，被稱為程序性壞死〔4〕。在程序性壞死的發(fā)生過程中，受體相互作用激酶(RIPK)1、RIPK3及其底物混合譜系激酶樣蛋白(MLKL)是參與細(xì)胞程序性壞死的關(guān)鍵分子。許多研究發(fā)現(xiàn)RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死參與CVD的多個(gè)病理生理過程，具有潛在的治療價(jià)值〔5〕?，F(xiàn)針對RIPK3分子及其介導(dǎo)的程序性壞死信號(hào)通路在CVD中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以進(jìn)一步了解RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在CVD中的作用，旨在為CVD的防治提供新的靶點(diǎn)及思路。

1 RIPK3及其介導(dǎo)的程序性壞死概述

RIPK3是絲氨酸/蘇氨酸受體相互作用蛋白激酶家族的成員，其結(jié)構(gòu)成分包括N端激酶結(jié)構(gòu)域和不同于其他家族成員的C端同型相互作用模序結(jié)構(gòu)域，而不含死亡結(jié)構(gòu)域。激酶結(jié)構(gòu)域是活性區(qū)，其中N端激酶結(jié)構(gòu)域在程序性壞死過程中具有重要作用，C端同型相互作用模序結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)RIPK3與RIPK1的相互作用形成RIPK1-RIPK3壞死復(fù)合體，隨后分別在T357和S358位點(diǎn)磷酸化MLKL，導(dǎo)致MLKL通過N末端結(jié)構(gòu)域易位至細(xì)胞質(zhì)膜和發(fā)生寡聚化，最終直接或間接破壞細(xì)胞質(zhì)膜從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和免疫復(fù)合物直接釋放至細(xì)胞外，最終招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等聚集激活無菌性炎癥反應(yīng)〔6,7〕。2005年，Degterev等〔4〕發(fā)現(xiàn)RIPK1特異性抑制劑壞死抑制素(Nec)-1對細(xì)胞的壞死過程具有調(diào)控作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壞死過程為一種新的非依賴天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的程序性細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞死亡形式兼具有壞死的形態(tài)學(xué)特征和凋亡的程序性，其突出的形態(tài)和功能改變?yōu)榧?xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)逐漸透明，結(jié)構(gòu)喪失，線粒體廣泛破壞，質(zhì)膜不可逆破裂等，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出，從而引起顯著的炎癥反應(yīng)和鄰近細(xì)胞損傷〔8〕。與常規(guī)細(xì)胞壞死的區(qū)別在于常規(guī)細(xì)胞壞死是不可調(diào)節(jié)的，而這種細(xì)胞死亡形式是可被精密的分子機(jī)制調(diào)節(jié)的，遂將其命名為necroptosis，中文譯為程序性壞死或壞死性凋亡。目前研究最為廣泛的一種細(xì)胞壞死類型即為由RIPK3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死，在調(diào)控程序性壞死的過程中RIPK3與多種蛋白激酶分子相互作用形成不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。除了當(dāng)前研究較為清楚的RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)傳導(dǎo)通路在程序性壞死中發(fā)揮重要作用外，Zhang等〔9〕在小鼠動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控心肌細(xì)胞程序性壞死模式，RIPK3通過磷酸化或氧化鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活，進(jìn)一步觸發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放不僅介導(dǎo)心肌細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，還同時(shí)激活了線粒體途徑凋亡發(fā)生，即RIPK3-CaMKⅡ-mPTP途徑。此外，Zhu等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血再灌注(I/R)模型中I/R損傷可通過RIPK3誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路介導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生，進(jìn)一步研究證實(shí)了RIPK3-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-鈣超載-黃嘌呤氧化酶-活性氧簇-mPTP開放信號(hào)通路為介導(dǎo)程序性壞死發(fā)生的另一條途徑。由此可見，RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死信號(hào)通路復(fù)雜多樣，其上下游信號(hào)通路及靶點(diǎn)尚未完全了解，仍需進(jìn)一步研究。

2 RIPK3在CVD中的主要作用

心血管系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的維持依賴于細(xì)胞的死亡和更新。近年來，越來越多的研究表明RIPK3通過介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞過度丟失與許多CVD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如缺血性心臟病(IHD)、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、心力衰竭(HF)等〔11～13〕。因此深入研究RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死與CVD的關(guān)系，可能會(huì)為預(yù)防和治療CVD提供新的理論依據(jù)。

2.1RIPK3與IHD 全球每年死于IHD的人數(shù)高達(dá)900萬，是全球范圍內(nèi)高發(fā)病率和死亡率的主要原因〔14〕。由于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建治療技術(shù)飛速發(fā)展，極大改善了IHD患者的預(yù)后，導(dǎo)致短期致死率呈下降趨勢，然而由于心肌細(xì)胞損傷的不可逆性，大量IHD患者發(fā)生心肌梗死(MI)后，會(huì)逐漸發(fā)展為HF，最終導(dǎo)致長期致死率居高不下〔15〕。因此尋找新的治療方案以減少M(fèi)I面積，對維持心室功能及預(yù)防HF發(fā)生具有重要作用。有研究表明在離體大鼠心臟模型中，使用RIPK1特異性抑制劑(NEC-1或NEC-5)和一些天然產(chǎn)物蒜氨酸，可以產(chǎn)生心臟保護(hù)作用減少M(fèi)I面積，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其部分機(jī)制是通過抑制RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來減輕缺血誘導(dǎo)的MI面積〔16,17〕。與之一致的是，Luedde等〔18〕探索了RIPK3是否參與MI中的調(diào)控，通過建立基因敲除小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠在MI后30 d的左室射血分?jǐn)?shù)更高，心肌細(xì)胞肥大程度較小，同時(shí)炎癥反應(yīng)減弱，活性氧的生成減少。此外RIPK3基因敲除小鼠與野生型小鼠相比MI面積顯著降低。揭示了RIPK3在MI中具有極其重要的調(diào)控作用，并證實(shí)RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死加重了小鼠缺血誘導(dǎo)MI后的氧化應(yīng)激和心臟不良重構(gòu)。Ghardashi Afousi等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練通過靶向RIPK1-RIPK3-MLKL信號(hào)通路，對小鼠MI后的心臟不良重構(gòu)起到心臟保護(hù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在MI中的重要調(diào)控作用。

MI患者接受開通罪犯血管的再灌注治療后會(huì)引起由快速血流恢復(fù)所導(dǎo)致的心肌I/R損傷，研究發(fā)現(xiàn)，MI患者接受及時(shí)的再灌注治療后，有50%的心梗面積是由心肌細(xì)胞I/R損傷所致〔20〕。因此，積極探索新的干預(yù)手段來減輕心肌I/R對于改善MI患者預(yù)后具有重要臨床意義。一項(xiàng)通過構(gòu)建衰老小鼠I/R動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白P62與RIPK1-RIPK3壞死體形成復(fù)合物介導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生，使衰老小鼠心肌細(xì)胞更易受I/R損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療破壞P62-RIPK1-RIPK3復(fù)合物的形成，從而有效抑制了I/R誘導(dǎo)的衰老小鼠心肌細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，最終降低了該小鼠模型的致死率〔21〕。Zhou等〔22〕探討了RIPK3在心臟微循環(huán)I/R損傷中的作用及其機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)RIPK3主要由I/R損傷激活，從而加劇內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，最終導(dǎo)致微血管屏障功能障礙、毛細(xì)血管通透性增高和微循環(huán)灌注缺陷。在機(jī)制上，得出結(jié)論是I/R損傷經(jīng)RIPK3-磷酸甘油酸變位酶(PGAM)5-親環(huán)素(CypD)-mPTP信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)程序性壞死導(dǎo)致I/R介導(dǎo)的微血管損傷。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褪黑素治療可抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信號(hào)通路，從而阻斷內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，減輕心臟微血管I/R損傷。以上研究表明抑制RIPK3相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的程序性壞死的發(fā)生是減輕I/R損傷的有效方法。因此若能在臨床實(shí)踐中開發(fā)具有抑制RIPK3介導(dǎo)程序性壞死發(fā)生的臨床藥物，則可能為減輕心肌I/R損傷提供新的防治策略。

2.2RIPK3與AS AS是心血管系統(tǒng)中一種常見的慢性血管炎癥疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的流行病學(xué)特點(diǎn)，并以AS斑塊在大中型動(dòng)脈的血管壁集聚為特征，一旦不穩(wěn)定的AS斑塊破裂，將會(huì)導(dǎo)致血栓形成從而閉塞管腔，引起一系列CVD及其并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管藥物及介入治療的飛速發(fā)展使AS的治療取得了一定進(jìn)展，但AS所引起的心腦血管疾病仍未減少，因此積極探索新的治療靶點(diǎn)來治療AS尤為重要。目前越來越多的研究表明RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在AS的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。巨噬細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生被廣泛認(rèn)為是AS斑塊形成的關(guān)鍵因素〔23〕。Lin等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RIPK3基因敲除可以顯著降低易患AS小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，并且RIPK3基因敲除小鼠AS斑塊及壞死中心面積顯著降低。此外，體外研究表明，RIPK3缺失的巨噬細(xì)胞對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的程序性壞死具有抵抗力。該研究證明下調(diào)RIPK3表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的AS斑塊形成。與之一致的是，Meng等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)在載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的AS斑塊中RIPK3被磷酸化修飾，提示該模型小鼠中存在程序性壞死的激活。進(jìn)一步研究構(gòu)建ApoE和RIPK3雙敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該組小鼠AS斑塊中炎癥及程序性壞死水平顯著降低。Tian等〔26〕研究發(fā)現(xiàn)在具有壞死中心的人AS斑塊中，RIPK1和RIPK3的水平顯著升高。另外有一項(xiàng)研究表明，與對照組相比，AS患者的頸動(dòng)脈斑塊中RIPK3的mRNA表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其在不穩(wěn)定斑塊中表達(dá)更加顯著〔12〕。提示RIPK3的表達(dá)上調(diào)參與了AS的斑塊不穩(wěn)定性，提前干預(yù)RIPK3的表達(dá)可能是阻斷AS進(jìn)程的有效策略。肖真真等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，冠狀A(yù)S心臟病患者血漿中RIPK1、RIPK3、MLKL水平均顯著升高，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3者水平可能與冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。然而，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)RIPK3在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中具有AS保護(hù)作用，該研究指出RIPK3在AS中的主要作用不是以往描述的促進(jìn)程序性壞死發(fā)生，而是可能通過抑制巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和內(nèi)皮細(xì)胞中E-選擇素的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，從而在AS中發(fā)揮保護(hù)作用。并指出造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因可能是不同類型的細(xì)胞利用促炎成分的方式不同〔28〕。因此RIPK3在斑塊的各種細(xì)胞類型中的具體作用仍存在爭議。

以上研究提示依賴RIPK3的程序性壞死是AS斑塊形成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，RIPK3的水平與斑塊的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，并且與AS進(jìn)展的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系。這種機(jī)制為AS的治療和診斷提供了一種新的思路，提示RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在AS發(fā)生發(fā)展的過程中扮演了非常重要的角色，通過有效手段降低RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死的發(fā)生可能是治療AS的有效方案，患者血漿中RIPK3的水平檢測可能對AS的診斷及嚴(yán)重程度評(píng)估具有一定的預(yù)測價(jià)值。

2.3RIPK3與HF HF是一種心臟不能泵出足夠的血液來滿足組織、器官需要的綜合征，繼發(fā)于左室收縮和舒張功能障礙。由于人口老齡化和危險(xiǎn)因素控制不力，HF發(fā)病率呈上升趨勢〔29〕。雖然當(dāng)下醫(yī)學(xué)治療取得了一些進(jìn)展，但HF患者的預(yù)后仍然很差。因此，有必要探索更有效的治療策略延緩和防止HF的進(jìn)展。Szobi等〔30〕通過對健康對照組和MI或擴(kuò)張型心肌病所致終末期HF患者的左心室標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HF組中RIPK1和RIPK3的表達(dá)水平均顯著升高。此外，活化的半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，一種負(fù)性調(diào)節(jié)程序性壞死的促凋亡蛋白酶，在HF組中顯著降低。提示在部分HF患者心臟左室中，凋亡的發(fā)生可能被抑制而RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死是心肌損傷、炎癥反應(yīng)及纖維增生的主要原因。Guo等〔31〕研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟特異性腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)2缺失會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞程序性壞死和HF，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3基因缺失在很大程度上挽救了由TRAF2缺失引發(fā)的心臟表型，證明了RIPK3是TRAF2下游的關(guān)鍵靶蛋白，介導(dǎo)了HF中程序性壞死的發(fā)生。既往研究證明了鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)Ⅱ是RIPK3下游靶蛋白，可共同介導(dǎo)mPTP開放。研究發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建的小鼠模型中，RIPK3基因敲除和CaMKⅡ抑制劑可明顯改善I/R或阿霉素治療所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞程序性壞死和HF，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，其部分機(jī)制可能是通過阻斷RIPK3-CaMKⅡ-mPTP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而延緩小鼠HF的進(jìn)程〔9〕。值得注意的是，與心肌細(xì)胞不同，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生可能對心臟具有保護(hù)作用。已有研究表明，可溶性恒定鏈(sCD74)/巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)通路可通過觸發(fā)依賴RIPK1-RIPK3的程序性壞死促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗纖維化作用，最終延緩心臟重構(gòu)和HF的進(jìn)程〔32〕。該研究提示，RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在不同類型細(xì)胞中其功能具有差異性，其中一些功能在HF的發(fā)生發(fā)展過程中可能是有益的。因此，探索不同類型細(xì)胞間RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死的差異作用關(guān)系，將有助于闡明以RIPK3為靶點(diǎn)治療HF的潛在風(fēng)險(xiǎn)和獲益。

綜上，RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死與CVD的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，成為近年來心血管領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)。本文討論了依賴RIPK3的程序性壞死在IHD、AS、HF中的重要作用，因此靶向調(diào)控RIPK3可能是治療多種CVD的有效策略。但目前對RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死在CVD中的具體作用和調(diào)控機(jī)制尚未研究透徹，仍需要更多的相關(guān)研究，以期為開發(fā)相關(guān)分子靶點(diǎn)的藥物提供有價(jià)值的線索和手段，最終將基于細(xì)胞或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。