董芝芝 劉蓉 趙秋霞 陳悅

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院超聲科，湖北 宜昌 443003)

腦卒中是我國死亡損失壽命年和傷殘調整壽命年的首要原因〔1〕，部分腦卒中歸因于頸動脈粥樣硬化易損斑塊破裂〔2〕。動脈粥樣硬化是慢性炎癥性疾病〔3〕，多基因和環(huán)境因素共同影響其發(fā)展〔4〕。早期檢測頸動脈斑塊易損性有助于識別高風險腦卒中患者〔5〕。研究表明微型核糖核酸(miRNAs)在動脈粥樣硬化斑塊的形成進展中起一定作用〔4，5〕，通過檢測miRNAs表達水平，有可能預測頸動脈斑塊易損性及腦卒中風險。

1 斑塊易損性

1844年，丹麥藝術家Bertel Thorvaldsen的尸檢結果首次報告了斑塊破裂的概念。隨后Davies描述了斑塊破裂的特征及炎癥在斑塊易損性發(fā)展中的作用〔6〕。1989年，Muller等將血流動力學改變不明顯、易破裂的斑塊命名為易損斑塊。易損斑塊為具有破裂傾向、易于發(fā)生血栓形成和(或)進展迅速的危險斑塊，主要標準為：活動性炎癥(大量單核/巨噬細胞浸潤)、薄纖維帽(厚度<100 μm)伴較大的脂核(成分>40%)、內皮細胞剝脫伴表面血小板聚集、有損傷或破裂傾向的斑塊、重度狹窄；次要標準為：表面鈣化結節(jié)、黃色反光、斑塊內出血、內皮功能障礙、正性重塑〔7〕。

2 miRNAs

近年來，miRNAs(由18～25個核苷酸組成的短RNA)作為生物標志物和潛在的治療靶點，在其作為疾病診療的關鍵介質作用備受關注。miRNAs與mRNA的3′非編碼區(qū)(UTR)位點直接和(或)互補結合抑制基因表達，導致翻譯抑制和(或)降解〔8〕，調節(jié)超過三分之一的人類基因〔9〕，是動脈粥樣硬化斑塊易損性的潛在調節(jié)因子〔3〕。miRNAs與細胞凋亡、細胞成熟、氧化應激、細胞外基質降解、血管生成和炎癥反應、脂質代謝等有關〔10〕，可通過其表達水平調節(jié)平滑肌細胞、巨噬細胞和內皮細胞的功能，影響動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的不同階段。

3 miRNAs與斑塊易損性的分子機制

3.1miRNAs調控血管平滑肌細胞增殖、遷移及表型變化 平滑肌細胞是動脈粥樣硬化斑塊的主要成分之一〔3〕，在斑塊發(fā)展過程中，易損斑塊常顯示為平滑肌細胞凋亡和(或)纖維帽中平滑肌細胞數量減少〔11〕，常見原因為血管平滑肌細胞的增殖、遷移和表型發(fā)生了變化〔4〕。

平滑肌細胞增殖、遷移可增加斑塊纖維帽的穩(wěn)定性。研究表明，細胞增殖和遷移可能是通過miRNAs調節(jié)細胞周期相關蛋白〔包括細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及其抑制劑〕、靶向轉化生長因子(TGF)-β信號通路(如miR-26a、miR-599)、激活胰島素樣生長因子(如miR-133)等引起的〔4〕。miR-221/miR-222通過抑制細胞CDK抑制劑p27kip1的表達促進血管平滑肌細胞增殖和內膜增厚，miR-221/miR-222的缺失可能是細胞增殖減少導致纖維帽變薄和斑塊破裂的基礎〔12〕。miR-181b過表達可升高細胞周期蛋白(cyclin)-CDK復合物，導致細胞S和G2/M周期激活，促進血管平滑肌細胞增殖和遷移。miR-638通過靶向孤核受體(NOR)1/cyclinD途徑抑制血小板衍生生長因子(PDGF)-BB-誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移〔13〕。miR-210通過降低結腸腺瘤樣息肉基因(APC一種多蛋白復合物)的表達，促進β-連環(huán)蛋白易位進入細胞核，激活無翅型MMTV整合位點家族成員(Wnt)靶基因轉錄，可能是血管平滑肌細胞增殖的潛在機制之一〔14〕。

促進平滑肌細胞表型轉換可能影響纖維帽完整性。正常情況下，平滑肌細胞為收縮表型，為了應答血管損傷和(或)炎癥信號，平滑肌細胞去分化為合成表型(促動脈粥樣硬化)〔11〕，有可能增加斑塊易損性。miRNAs是平滑肌細胞表型轉換的調節(jié)因子之一。miR-143/miR-145通過調節(jié)血管緊張素轉換酶基因促進血管平滑肌細胞表型從收縮狀態(tài)到增殖、遷移狀態(tài)的轉換〔15，16〕。研究發(fā)現miR-143/miR-145缺陷小鼠顯示為收縮-合成表型轉換的平滑肌細胞，其收縮能力降低〔4〕，增加斑塊易損性。miR-21抑制血管平滑肌細胞中張力蛋白同源物基因(PTEN)、程序性細胞死亡蛋白(PDCD)4和Sprouty蛋白同源物(SPRY)1的翻譯及其他mRNA靶點〔如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-α和原肌球蛋白(TPM)1〕，有助于細胞從收縮表型向合成表型的轉換〔16〕。miR-663通過增加血管平滑肌細胞分化標記的表達，如平滑肌α-肌動蛋白(SMA)、鈣調素和平滑肌肌球蛋白重鏈(MYH11)等促進平滑肌細胞從收縮表型向合成表型的轉換〔4〕。

因此，miRNAs有可能作為一種新型的生物標記物評估纖維帽厚度及斑塊形態(tài)，從而評估斑塊易損性，預測腦卒中風險。

3.2miRNAs調控巨噬細胞介導的炎癥、凋亡 巨噬細胞是形成易損斑塊的重要炎癥細胞〔10〕，可介導免疫細胞、炎癥因子的聚集〔17〕，miRNAs通過調節(jié)巨噬細胞分化及炎癥，參與巨噬細胞生物學行為〔11〕，在斑塊進展中產生影響。TOLL樣受體(TLR)4配體刺激巨噬細胞，使其極化為M1炎癥型(經典激活細胞)，白細胞介素(IL)-4刺激時巨噬細胞極化為M2抗炎型(交替激活)；M1炎癥型激活后，小分子miRNAs上調，如miR-155等〔18〕。miR-155通過靶向轉錄抑制因子B細胞淋巴瘤因子(Bcl)6、髓樣分化蛋白(MyD)88-和(TRIF)-依賴的信號通路誘導M1炎癥型極化等調控巨噬細胞功能的多個方面，如炎癥反應、細胞凋亡等。研究發(fā)現在低密度脂蛋白(LDL)受體敲除小鼠中，骨髓造血細胞缺乏miR-155通過巨噬細胞極化為M1炎癥型增加斑塊易損性，強調了miR-155在調節(jié)巨噬細胞譜系的炎癥信號通路中的重要性〔11〕。miR-342-5p通過靶向絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)1增加巨噬細胞中miR-155的表達，促進促炎介質如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6的表達〔18〕。miR-181b通過靶向Notch1信號(Notch信號的異常激活與巨噬細胞功能失調有關)調節(jié)巨噬細胞極化，影響動脈粥樣硬化斑塊易損性〔19〕。

動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，miRNAs通過調節(jié)巨噬細胞自噬及線粒體功能增加膽固醇外流〔20〕，誘導內質網應激，促進巨噬細胞凋亡，使斑塊內脂質壞死核心增加、纖維帽變薄，擴大斑塊面積〔21，22〕。Canfrán-Duque等〔21〕在小鼠模型實驗中發(fā)現miR-21在巨噬細胞中高度表達，miR-21缺失促進巨噬細胞在動脈壁中的浸潤、增加巨噬細胞炎性細胞因子的誘導、加速誘導細胞凋亡，增加泡沫細胞形成，降低巨噬細胞吞噬能力。巨噬細胞自噬將脂滴運送到溶酶體內，溶酶體酸脂肪酶水解并清除膽固醇，miR-33過表達可通過自噬通路反向轉運膽固醇、降低血清高密度脂蛋白(HDL)水平，加速游離膽固醇誘導的巨噬細胞凋亡和促炎癥表型轉化〔23，24〕，增加斑塊易損性。綜上，了解miRNAs調控巨噬細胞的潛在機制，通過阻斷不需要的途徑或將巨噬細胞分化調控為M2抗炎型，可成為臨床易損斑塊治療的新靶點。

3.3miRNAs調控內皮細胞增殖、遷移、凋亡及炎癥反應 內皮細胞在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展中起一定作用。內皮細胞受損可致血管收縮異常，增加血小板聚集、白細胞黏附和血栓形成。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，miRNAs通過調節(jié)內皮細胞的增殖和遷移影響內皮功能，影響斑塊易損性。miR-21、miR-126-3p、miR-24、miR-221、miR-222及miR-17-92簇的成員是內皮細胞中表達較豐富的miRNAs。miR-21在多種生理和病理過程中起重要作用，通過直接靶向WW結構域蛋白1、激活TGF-β信號通路，抑制內皮細胞增殖、遷移〔4〕。在內皮細胞中，miR-126表達上調通過靶向基質細胞衍生因子(SDF)-1(也稱為CXCL12)〔25〕、Dlk1〔神經源位點缺口同源蛋白(Notch)1抑制劑，負性細胞周期調節(jié)因子〕〔4〕，促進內皮細胞增殖、遷移，以抵抗血流紊亂和高脂血癥的促動脈粥樣硬化作用，降低斑塊易損性。

內皮細胞凋亡通過表現為內皮細胞功能障礙、破壞內皮的完整性、促進脂質沉積加速動脈粥樣硬化〔26〕，可能增加斑塊易損性。miRNAs參與了動脈粥樣硬化的病理過程，可調控內皮細胞凋亡。let-7g過表達通過靶向抑制半胱氨酸蛋白酶(CASP)3(細胞凋亡的執(zhí)行者)降低ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡〔10〕。miR-495通過抑制趨化因子(CCL)2促進單核細胞進入動脈粥樣硬化斑塊并誘導內皮細胞凋亡促進動脈粥樣硬化，增加斑塊易損性。PTEN是腫瘤抑制基因，通過負性介導胞內磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路、負性介導中性粒細胞趨化和減少組織損傷發(fā)揮抗炎作用，而miRNA-26a-5p通過靶向PTEN激活PI3K/Akt通路，抑制內皮細胞凋亡〔27〕和炎癥反應。

在生物化學和生物力學刺激的共同作用下，動脈粥樣硬化疾病的早期特征是內皮細胞激活，表達一組黏附分子，如血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1和E-選擇素〔11〕，促進炎癥反應及動脈粥樣硬化斑塊形成，增加斑塊易損性〔28〕。miRNAs可調節(jié)內皮細胞炎癥反應。如在動脈粥樣硬化的早期階段，miR-21通過激活VCAM-1增加黏附分子及促炎細胞因子表達，增加內皮細胞炎癥反應〔16〕。miR-92a通過靶向G蛋白信號調節(jié)因子(RGS)3、Krüppel樣轉錄因子(KLF)2、KLF4分別抑制TGF-β/母親信號蛋白同源物(Smad)信號傳導、NF-κB途徑、IL-1β，抑制內皮細胞增殖和炎癥反應，減緩動脈粥樣硬化進展〔9〕，降低斑塊易損性。miR-155 和miR-221/miR-222通過靶向轉錄因子Ets-1及其下游基因(包括VCAM-1和單核細胞趨化蛋白-1)抑制血管緊張素Ⅱ誘導的內皮細胞炎癥反應〔11〕，有可能降低斑塊易損性。

目前研究結果只能表明miRNAs與內皮細胞功能、斑塊易損性有一定相關性，但調控功能的主要miRNAs尚未說明，其具體類別及影響機制還需更多實驗闡明。

4 miRNAs與脂質代謝

血液循環(huán)中過量的LDL及膽固醇在血管內皮下積聚，誘導局部氧化和酶修飾引起免疫應答，形成斑塊進展的慢性炎癥環(huán)境〔11〕。膽固醇流出能力(維持膽固醇內穩(wěn)態(tài))是動脈粥樣硬化的預測因子之一。三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)A1是調節(jié)膽固醇代謝的關鍵分子，通過向載脂蛋白受體輸出膽固醇和磷脂調節(jié)HDL生成〔29〕。miR-33家族在膽固醇流出和HDL代謝(ABCA1和ABCG1)、脂肪酸氧化、膽汁酸合成和分泌等相關基因的調控中具有重要作用〔24〕。研究發(fā)現，抑制miR-33可降低血漿極低密度脂蛋白(VLDL)含量，而增加血漿HDL含量〔30〕。Nishino等〔23〕用miR-33b敲入人化小鼠模型證明膽固醇調節(jié)元件結合蛋白-1(SREBF)1-miR-33b軸促進動脈粥樣硬化、斑塊核心壞死區(qū)域和巨噬細胞浸潤增加、纖維化成分減少，表明miR-33b通過調節(jié)膽固醇量增加斑塊易損性。miR-126-5P通過抑制Dlk1、Notch1使細胞通透性增加，導致LDL大量進入血管壁促進動脈粥樣硬化斑塊進展〔31〕，增加斑塊易損性。miR-494表達上調通過HDL將膽固醇從血管壁轉移到肝臟，減少動脈粥樣硬化斑塊中壞死核心的大小〔30〕。miR-27、miR-144、miR-145、miR-223 和 miR-758在轉錄后通過抑制ABCA1表達調節(jié)細胞膽固醇流出至載脂蛋白〔11〕，影響斑塊易損性。由此可見，通過抑制或激活相應的miRNAs，可在一定程度下減輕血管壁的脂質沉積，降低循環(huán)血脂水平，從而降低臨床心血管事件的風險。

5 miRNAs與斑塊內新生血管

新生血管是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展早期的一個顯著特征，因新生血管脆弱且易塌陷，導致斑塊內出血、血栓形成、釋放化學介質、產生炎癥細胞，增加斑塊易損性〔31，32〕。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，不同的miRNAs可能與血管生成有關。let-7、miR-126、miR-143/145、miR-155、miR-17-92簇和miR-221/ miR-222可以調節(jié)斑塊內新生血管生成。let-7通過敲除小鼠體內的內切核糖核酸酶(Dicer)和核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)，使let-7a、let-7b、let-7c、let-7f和let-7g降低30%以上，影響血管生成。let-7a、let-7b和let-7f的減少有助于新生微血管的形成〔10〕。miR-126可通過維持血管內皮生長因子(VEGF)表達水平、下調表皮生長因子樣結構域(EGFL)-7(與VEGF協同促血管生成)，促進新生血管生成〔25〕。因此，通過檢測循環(huán)中miRNAs表達水平，有可能評價新生血管密度，成為評估斑塊內新生血管的方法之一。

綜上，頸動脈粥樣硬化易損斑塊破裂可導致腦卒中。miRNAs在動脈粥樣硬化斑塊進展過程中起重要作用，通過檢測血液循環(huán)和斑塊內miRNAs表達水平為參考依據，有可能預測斑塊易損性及腦卒中風險，對頸動脈易損斑塊提供診療策略，從而尋找頸動脈易損斑塊miRNAs治療的新靶點。