李晶 莊群川 蔡少麗

(1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101；2福建中醫(yī)藥大學(xué)；3福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心)

肝細(xì)胞癌(HCC)是肝癌中最常見的病理類型，在全球癌癥發(fā)病率中居第5位，其死亡率居第3位〔1〕。中國(guó)每年新發(fā)HCC病例約占全球的55%〔2〕。隨著腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用推廣，中藥資源以其高效低毒的特點(diǎn)日益引起中西方學(xué)者的關(guān)注，通過分子生物學(xué)技術(shù)闡明中藥抑制腫瘤的相關(guān)作用機(jī)制已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)〔3,4〕。中藥田基黃，味甘、性涼，具有清熱利濕、散瘀消腫和解毒等功效。已有研究證實(shí)，田基黃具有抑菌、抗病毒、止血、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等多種藥理功效〔5〕。其注射液在臨床上用于治療急慢性肝炎、闌尾炎、傷寒、副傷寒等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)田基黃的研究主要是在對(duì)其有效化學(xué)成分分析和保肝作用方面，而田基黃抗腫瘤的機(jī)制尚不明確。研究表明，田基黃能有效抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖，推測(cè)其與促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)〔5〕。導(dǎo)致凋亡的途徑主要是外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑。細(xì)胞內(nèi)源性凋亡往往涉及線粒體理化性質(zhì)的改變、線粒體膜上蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的變化等。本研究通過觀察田基黃水提物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 田基黃水煎提取物的制備：中藥田基黃購(gòu)自福建同春藥業(yè)股份有限公司(產(chǎn)地：福建，批號(hào)：080817)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為金絲桃屬植物地耳草的干燥全草。田基黃粉碎后烘干稱重，取500 g，水煎煮3次后合并過濾，60℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮為含生藥2 g/ml的水煎液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫囼?yàn)前稀釋成所需濃度使用。細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化所細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑與儀器 試劑：杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.2)等購(gòu)自Hyclone公司；細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；Trizol和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。儀器：ELX800酶標(biāo)儀(BioTek公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó) Heraeus)；超純水裝置(MILLI-Q 公司)；Ⅺ70熒光倒置相差顯微鏡(日本 OLYMPUS)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理 首先將人肝癌細(xì)胞HepG2放置于含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分為4組，其中，對(duì)照(A)組未加田基黃水提物處理；其余3組分別加入濃度0.5 mg/ml(B組)、1.0 mg/ml(C組)、2.0 mg/ml(D組)的田基黃水提物處理24 h。每組均取傳代數(shù)少于20代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于觀察和檢測(cè)。

1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 分別取4組干預(yù)處理24 h后的人肝癌細(xì)胞HepG2，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率 經(jīng)不同濃度田基黃水煎提取物作用24 h后，收集人肝癌細(xì)胞HepG2，按照試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡情況。膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)雙染法將細(xì)胞分為4種屬性，其中Ⅰ象限(即左上，Annexin V-/PI+)為壞死細(xì)胞；Ⅱ象限(即右上，Annexin V+/PI+)為晚期凋亡細(xì)胞；Ⅲ象限(即左下，Annexin V-/PI-)為正常細(xì)胞；Ⅳ象限(即右下，Annexin V+/PI-)為早期凋亡細(xì)胞。

1.6使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位的改變情況 同上所述，收集不同濃度藥物干預(yù)細(xì)胞，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體上膜電位勢(shì)能的變化。用熒光探針(JC)-1染色，流式細(xì)胞儀通過JC-1熒光強(qiáng)度檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨm)的變化。

1.7逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)線粒體上相關(guān)基因Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá) 按Trizol說明書提取總RNA，所得RNA用核酸分析儀計(jì)量RNA濃度并定量，模板量均取1 μg，采用Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增線粒體上相關(guān)基因，以 GAPDH為內(nèi)參，采用RT-PCR法檢測(cè)不同濃度處理24 h后人肝癌細(xì)胞HepG2 Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài) A組人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)良好，胞質(zhì)均勻，核仁大而清晰，可見多層致密生長(zhǎng)現(xiàn)象，細(xì)胞梭形可貼壁。而B、C、D組經(jīng)不同濃度田基黃水提物干預(yù)24 h后，隨著藥物濃度越高，可見細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞生長(zhǎng)越緩慢，折光性越差。部分或全部細(xì)胞變圓，伸展不良，細(xì)胞脫落、懸浮、貼壁疏松或死亡，見圖1。提示田基黃水提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖有明顯抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用更明顯。

2.2流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同劑量田基黃水提物干預(yù)肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，提示早期細(xì)胞凋亡，與A組〔(3.09±0.28)%〕比較，B、C、D組人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率〔(10.05±1.52)%、(17.30±0.93)%、(39.80±2.55)%、(39.80±2.55)%〕明顯升高(P<0.05)，且隨著田基黃水提物處理濃度的增加，人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率逐漸升高，且呈劑量依賴性。

圖1 各組人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)(×100)

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位的改變情況 與A組〔(4.5±0.6)%〕相比，B、C、D組膜電位改變率〔(31.0±1.8)%、(44.0±2.9)%、(52.0±3.3)%〕明顯升高(P<0.05)，提示人肝癌細(xì)胞HepG2 經(jīng)不同濃度田基黃水提物作用后，紅光強(qiáng)度均有減弱，且處理濃度越高，紅光減弱程度越顯著，說明線粒體膜電位下降越多。

2.4RT-PCR 檢測(cè)線粒體上相關(guān)基因Bax和Bcl-2 mRNA水平變化 經(jīng)過不同濃度田基黃水提物處理規(guī)定時(shí)間后，人肝癌細(xì)胞HepG2 Bax mRNA表達(dá)水平，與A組(568.4±12.9)相比，B、C、D組(856.3±10.8、2 523.9±18.2、4 236.6±12.3)明顯上升(P<0.05)，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；人肝癌細(xì)胞HepG2 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，與A組(6 536.2±23.3)相比，B、C、D組(5 362.8±23.1、1 338.7±23.1、1 369.9±13.2)明顯降低(P<0.05)，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。見圖2。

圖2 各組人肝癌細(xì)胞HepG2 Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是由基因控制的機(jī)體細(xì)胞自發(fā)的程序性死亡過程。許多抗癌藥物就是通過最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡通路從而抑制腫瘤生長(zhǎng)〔6〕。本研究說明田基黃能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

已有研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)〔7,8〕。線粒體跨膜電位的破壞性下降發(fā)生在DNA 斷裂等細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前，被證實(shí)是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的反應(yīng)之一，故被稱為細(xì)胞凋亡的“生死開關(guān)”。本研究表明田基黃可通過破壞線粒體跨膜電位從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體凋亡通路的應(yīng)力信號(hào)均集中于線粒體，并通過Bcl-2家族蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡〔9，10〕。家族成員中的Bcl-2為抗凋亡分子之一，而Bax則是促凋亡分子。如趙忠偉等〔11〕、Xu等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)線粒體凋亡通路中Bax表達(dá)，可促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡，而抗凋亡分子Bcl-2上調(diào)可使 HCC 細(xì)胞拮抗線粒體通路介導(dǎo)的失巢凋亡，進(jìn)而促進(jìn) HCC 發(fā)展〔13〕。本研究表明，田基黃可通過抑制Bcl-2 mRNA表達(dá)、促進(jìn)Bax mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖作用。

綜上，在田基黃的藥物作用下，通過有效降低線粒體的膜電位，改變細(xì)胞膜的通透性，調(diào)控Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔14〕，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮抑制肝癌的功效〔15〕。