周建松 蔣家俊 簡潔 劉小華 李婉宜

·基礎(chǔ)論著·

金黃色葡萄球菌腸毒素與耐藥性分析

周建松1*蔣家俊1簡潔1△劉小華1李婉宜2

（1. 貴陽市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550000；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，四川 成都 610000）

檢測2015年-2021年貴陽市食源性致病菌中的金黃色葡萄球菌腸毒素與耐藥性，為有效防控貴陽市金黃色葡萄球菌食物中毒提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考。將2015年-2021年貴陽市收集并分離出的27株金黃色葡萄球菌采用微孔板酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）來檢測腸毒素，并使用革蘭陽性藥敏板對27株金黃色葡萄球菌進(jìn)行22種抗生素耐藥檢測。本研究發(fā)現(xiàn)27株金黃色葡萄球菌中有17株產(chǎn)生腸毒素，其中13株產(chǎn)腸毒素SEA，3株產(chǎn)腸毒素SEB，1株產(chǎn)腸毒素SED；藥物敏感實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，24株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了耐藥性并且為多重耐藥，占總菌株的85.2%，青霉素與氨芐西林的耐藥率最高，占85.2%。不產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌株對四環(huán)素的耐藥率高于產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌（P＜0.01），而不產(chǎn)腸毒素的菌株及產(chǎn)腸毒素的菌株對其余抗菌藥物的耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2015年-2021年貴陽市爆發(fā)的食源性疾病與食品安全風(fēng)險監(jiān)測中所分離出的金黃色葡萄球菌只有部分產(chǎn)生腸毒素，但是金黃色葡萄球菌的耐藥率較高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，耐藥性與腸毒素的關(guān)系需進(jìn)一步探究。

金黃色葡萄球菌；腸毒素；ELASA；耐藥性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），又名金葡菌，屬于葡萄球菌屬，在自然界中廣泛存在，是一種臨床常見的條件致病菌[1]，是僅次于沙門氏菌和副溶性弧菌的第三大食源性致病菌[2]。

金黃色葡萄球菌可將食品作為繁殖的載體進(jìn)行活動代謝，在適宜的基質(zhì)和環(huán)境條件下產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素，人類食用被金葡菌腸毒素污染的食品后會導(dǎo)致食物中毒[2]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種類型的腸毒素或類腸毒素，95%的金黃色葡萄球菌食物中毒是由腸毒素引起的，大多數(shù)金黃色葡萄球菌食物中毒是由腸毒素A-E引起[3-4]。此外，伴隨金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥金黃色葡萄球菌菌株不斷增加，已經(jīng)廣泛引起了關(guān)注[5]。

在貴陽市細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒排前3位，是引起貴陽市食物中毒的主要細(xì)菌之一。故本研究擬對貴陽市2015年-2021年收集到的27株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了腸毒素檢測及耐藥性實(shí)驗(yàn)，以了解貴州市食源性金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素及耐藥情況，為有效防控金黃色葡萄球菌食物中毒提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考，以進(jìn)一步加強(qiáng)管理和防護(hù)，有效地預(yù)防、控制食源性疾病，亦為臨床指導(dǎo)用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

27株金黃色葡萄球菌來源于2015年-2021年貴陽市爆發(fā)性食源性疾病與食品安全風(fēng)險監(jiān)測，金黃色葡萄球菌的陽性質(zhì)控菌ATCC29213由貴陽市疾病預(yù)防控制中心保存。

1.1.2 試劑與儀器

VITEK 濁度儀（法國 BioMerieux）、全自動藥敏實(shí)驗(yàn)菌液判讀儀（美國賽默飛）、酶標(biāo)儀（RT-6100）、RT-3100全自動洗板機(jī)（雷杜）。金黃色葡萄球菌腸毒素分型ELISA檢測試劑盒（北京美正生物）、Baird-Parker 培養(yǎng)基（北京陸橋）、BHI肉湯培養(yǎng)基（北京陸橋）、GPALL1F（美國賽默飛）。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢測

本研究按照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10-2016）進(jìn)行分離、鑒定。分離純化的金黃色葡萄球菌在革蘭氏染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)紫色葡萄球狀菌落，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性。

1.2.2 酶聯(lián)免疫法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素

本實(shí)驗(yàn)參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10-2016）附錄B和酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒說明書對分離到的菌株進(jìn)行A、B、C、D、E型腸毒素檢測。將27株金黃色葡萄球菌菌株使用BHI肉湯36℃隔夜增菌，使其最大程度地產(chǎn)生腸毒素。取2 mL 液體放入Eppendorf 管中，3500 g離心5 min，取上清液進(jìn)行檢測。

1.2.3 抗生素藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

參照CLSI指南推薦的微量肉湯稀釋法，以金黃色葡萄球菌ATCC29213菌株作為本實(shí)驗(yàn)的陽性質(zhì)控，檢測17種抗生素對試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。檢測的抗生素包括氨芐西林（Ampicillin，AMP）、四環(huán)素（Tetracyclines，TET）、紅霉素（Erythro-mycin，ERY）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、利福平（Rifampin，RD）、左氟沙星（Levofloxacin Tablets，LVX）、鏈霉素（Streptomycin，STR）、克林霉素（Clindamycin，CLI）、利奈唑胺（Linezolid，LNZ）、莫西沙星（Moxifloxacin，MOX）、苯唑西林（Oxacillin，OXA）、氨曲南（Aztreonam，AZT）、頭孢吡肟（Cefepime，F(xiàn)EP）頭孢唑啉（Cefazolin Sodium，CZO）、青霉素（Penicillin，PEN）。

從原始的瓊脂平板上挑取3-5個菌落，在無菌水中乳化培養(yǎng)，調(diào)節(jié)成0.5 McFarland濁度充分混合。取上述配置好的菌懸液10 μL加入含CAMHT肉湯培養(yǎng)基的11 mL試管中。用Sensititre一次性加樣頭替換試管蓋，根據(jù)AIM?使用說明書對藥敏板進(jìn)行加樣，將注入了含金黃色葡萄球菌的濃度適宜的菌懸液的藥敏板放入35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h-24 h，用全自動藥敏實(shí)驗(yàn)菌液判讀儀判讀結(jié)果，結(jié)果判讀S敏感，I中介，R耐藥。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以株數(shù)或率（n（%））表示，組間比較采用檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測結(jié)果

27株金黃色葡萄球菌中有17株產(chǎn)生腸毒素，產(chǎn)毒率為63.0%。其中產(chǎn)腸毒素SEA有13株，產(chǎn)腸毒素SEB 3株，產(chǎn)腸毒素SED 1株。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

27株菌株均對達(dá)托霉素、萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/達(dá)福普丁、利福平、莫西沙星敏感，敏感率為 100% 。所有菌株對甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素有較高敏感率，均為92.6%。對氯霉素（81.5%）、克林霉素（81.5%）、左氧氟沙星（81.5%）、環(huán)丙沙星（88.9%）、紅霉素（77.8%）、苯唑西林較敏感（92.6%）；對氨芐西林、青霉素的耐藥率均為85.2% ，其余依次是四環(huán)素55.6% ，紅霉素22.2% ，克林霉素18.5% ，紅霉素/克林霉素12.0% ，左氟沙星、環(huán)丙沙星均為11.1% ，苯唑西林、頭孢西丁篩選均為7.4% ，氯霉素3.7% 。

本研究檢測的菌株中，有23株呈多重耐藥的現(xiàn)象，占85.2%，兩重耐藥的菌株占18.5%，三重耐藥的菌株占33.3%，四重耐藥的菌株占11.1%，五重及以上的菌株占22.2%。

不產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌株對四環(huán)素耐藥率高于產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌（P＜0.05），而不產(chǎn)腸毒素的菌株及產(chǎn)腸毒素的菌株對其余抗菌藥物的耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 腸毒素陰性菌及腸毒素陽性菌的多藥耐藥性比較

3 討論

食品安全已經(jīng)成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)問題，食源性致病菌造成的食品污染是導(dǎo)致食品安全問題的主要原因[6]。我國每年20%-25%的細(xì)菌性食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌引起的[7]。金黃色葡萄球菌所致的食源性食物中毒主要由腸毒素引起的，腸毒素是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、獨(dú)立相似、抗原性不同的外毒素，一株金黃色葡萄球菌能分泌一型或兩型以上的腸毒素[8]，且金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的腸毒素很穩(wěn)定，不易被破壞，經(jīng) 100℃ 30 min 仍然保持部分活性[9]，一般的烹調(diào)加熱只能殺死金黃色葡萄球菌的菌體，不能滅活其腸毒素，被污染的食品在25℃-30℃環(huán)境下放置5～10 h，就能產(chǎn)生足以引起食物中毒的葡萄球菌腸毒素[10]，因此，一旦食品中產(chǎn)生了金黃色葡萄球菌腸毒素，就極易引發(fā)食源性疾病。近幾年內(nèi)，貴陽市發(fā)生了多次由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，并在每年食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作中，不同種類的食品中致病菌檢出金黃色葡萄球菌腸毒素陽性的比例仍較高，占約60.5%[11]。因此，由金黃色葡萄球菌引起的食物污染問題應(yīng)受到監(jiān)管部門重視。

金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒往往是由金黃色葡萄球菌所產(chǎn)的腸毒素引起的，本次監(jiān)測金黃色葡萄球菌，并做了腸毒素分型研究，對于研究并預(yù)防金黃色葡萄球菌的危害顯得有很大的意義。在本次實(shí)驗(yàn)的27株菌株中，17株腸毒素基因檢測陽性，檢出率為63.0% ，與宋曉紅等[12]山西省食品分離株產(chǎn)毒率63.85％研究結(jié)果相近。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有陽性菌株中均只檢出 1 種腸毒素基因，由表可知，sea 基因型腸毒素攜帶率最高, 這與某篇文獻(xiàn)所報道的一致[13]。

近幾年國內(nèi)外研究表明，由于抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致病原菌的耐藥性越來越強(qiáng)[14]。臨床上抗菌素的不合理及濫用現(xiàn)象非常普遍，不僅導(dǎo)致來自患者分離的金黃色葡萄球菌對耐藥性的增長，特別是耐甲氧西林菌株的大量出現(xiàn)，而且因?yàn)轲B(yǎng)殖業(yè)中不規(guī)范的使用某些抗生素，也使食品類及外環(huán)境中分離的金黃色葡萄球菌的耐藥性日益嚴(yán)重[15]。本研究從27株食源性金黃色葡萄球菌對22抗生素的耐藥情況顯示，對頭孢西丁篩選、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、氨芐西林、氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、苯唑西林、青霉素10種抗生素產(chǎn)生不同程度耐藥，其中對青霉素、氨芐西林的耐藥達(dá)到85.2%，其次是四環(huán)素，耐藥率達(dá)到55.6%，說明由金黃色葡萄球菌引起的耐藥情況已非常普遍，同時也表明這3種藥物已不適于金黃色葡萄球菌感染的治療。而紅霉素的耐藥率為23.5%，明顯低于章海通等[16]紅霉素44.8%的耐藥率。

不產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌株對四環(huán)素的耐藥比例高于產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌，而不產(chǎn)腸毒素的菌株及產(chǎn)腸毒素的菌株對其余抗菌藥物的耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究樣本數(shù)量較少，該對比結(jié)果需要更多的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)一步支撐。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的菌株都是多重耐藥菌，多重耐藥金黃色葡萄球菌的檢出也就意味著食品方面將面臨著更大的食品安全風(fēng)險，也將成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，同時為臨床給藥和治療帶來更大的挑戰(zhàn)。動物飼養(yǎng)過程中使用抗生素會導(dǎo)致食源性耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，且在食物中的藥物殘留可能干擾人腸道內(nèi)的正常菌叢和誘導(dǎo)臨床耐藥病原菌株，而動物排泄物中的抗生素和耐藥菌排入環(huán)境中可以長期保持耐藥性質(zhì)[17]。因此，各級食品安全監(jiān)督管理部門應(yīng)加強(qiáng)對食品市場的監(jiān)管。同時，應(yīng)該加大宣傳力度，減少藥物的濫用，謹(jǐn)慎添加動物飼料的抗菌藥，防止細(xì)菌耐藥性進(jìn)一步加重。

1 周勇, 吳新偉, 胡玉山, 等. 2009-2018年廣州市即食食品中金黃色葡萄球菌污染情況和菌型特征[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2021, 33(4): 444-450.

2 楊慶文, 湯曉召, 楊祖順, 等. 2010-2016年云南省食源性金黃色葡萄球菌腸毒素和mecA基因的檢測及分析[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2021, 28(6): 758-761.

3 林芳明, 張紅見, 朱艷偉, 等. 西寧市食品中金黃色葡萄球菌污染狀況及其腸毒素基因型分布研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2018, 54(10): 101-105.

4 國譯丹, 楊祖順, 古文鵬, 等. 云南省食源性金黃色葡萄球菌脈沖場凝膠電泳分型分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2017, 8(10): 3826-3830.

5 Smith DL, Harris AD, Johnson JA, et al. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(9): 6434-9.

6 Al-Kharousi ZS, Guizani N, Al-Sadi AM, et al. Hiding in fresh fruits and vegetables: opportunistic pathogens may cross geographical barriers[J]. Int J Microbiol, 2016, 2016: 4292417.

7 Paudyal N, Pan H, Liao X, et al. A meta-analysis of major food-borne pathogens in Chinese food commodities between 2006 and 2016[J]. Food-borne Pathog Dis, 2018, 15(4): 187-197.

8 張揚(yáng), 張?zhí)m榮, 周景林, 等. 2009-2011 年通州區(qū)食源性金黃色葡萄球菌的生物學(xué)及流行病學(xué)特征[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 25(2): 214-217.

9 王秀茹. 預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002, 56.

10 王釗, 王克安. 中國疾病預(yù)防與控制指南[M]. 北京: 華夏出版社, 2000, 505-506.

11 周藜, 周倩, 朱玫. 貴州省食源性金黃色葡萄球菌腸毒素及耐藥分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2014, 24(22): 3318-3320.

12 宋曉紅, 劉曄, 喬玫,等. 2010-2016年山西省九種食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的分布及耐藥性分析[J]. 中國藥物與臨床, 2020, 20(09): 1421-1424.

13 Cho SH, Kim JH, Kim JC, et al. Surveillance of bacterial pathogens associated with acute diarrheal disease in the Republic of Korea during one year, 2003[J]. J Microbiol, 2006, 44(3): 327-335.

14 Decimo M, Silvetti T, Brasca M. Antibiotic resistance patterns of gram-negative psychrotrophic bacteria from bulk tank milk[J]. J Food Sci, 2016, 81(4): M944-51.

15 汪永祿, 張萍, 陶勇, 等. 不同來源金黃色葡萄球菌腸毒素及耐藥性檢測分析[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2014, 21(04): 488-491.

16 章海通, 邢家溧, 傅曉, 等. 食源性金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素情況及耐藥性分析[J]. 食品研究與開發(fā), 2019, 40(20): 175-179.

17 徐勤, 巢國祥. 生牛奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15(8): 972-973.

·PROGRESS·

Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan

Yi Zhou, et al.

Immature dentate granule cells (imGCs) arising from adult hippocampal neurogenesis contribute to plasticity and unique brain functions in rodents1,2 and are dysregulated in multiple human neurological disorders3-5. Little is known about the molecular characteristics of adult human hippocampal imGCs, and even their existence is under debate1,6-8. Here we performed single-nucleus RNA sequencing aided by a validated machine learning-based analytic approach to identify imGCs and quantify their abundance in the human hippocampus at different stages across the lifespan. We identified common molecular hallmarks of human imGCs across the lifespan and observed age-dependent transcriptional dynamics in human imGCs that suggest changes in cellular functionality, niche interactions and disease relevance, that differ from those in mice9. We also found a decreased number of imGCs with altered gene expression in Alzheimer's disease. Finally, we demonstrated the capacity for neurogenesis in the adult human hippocampus with the presence of rare dentate granule cell fate-specific proliferating neural progenitors and with cultured surgical specimens. Together, our findings suggest the presence of a substantial number of imGCs in the adult human hippocampus via low-frequency de novo generation and protracted maturation, and our study reveals their molecular properties across the lifespan and in Alzheimer's disease.

Nature . 2022 Jul 6. doi: 10.1038/s41586-022-04912-w.

Analysis of enterotoxins and drug resistance of Staphylococcus aureus

Zhou Jian-song1*, Jiang Jia-jun1, Jian Jie1△, Liu Xiao-hua1, Li Wan-yi2

(1. Laboratory Department, Guiyang Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550000, China; 2. Department of Pathogen Biology, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610000, China)

To detect enterotoxin and drug resistance of foodborne Staphylococcus aureus in Guiyang from 2015 to 2021, so as to provide basic data and reference for effective prevention and control of Staphylococcus aureus food poisoning in Guiyang.Twenty seven strains of Staphylococcus aureus collected in Guiyang from 2015 to 2021 were tested for enterotoxin by microplate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and 27 strains of Staphylococcus aureus were tested for 22 kinds of antibiotic resistance by gram-positive drug sensitive plate.In this study, 17 strains of 27 strains of Staphylococcus aureus producing enterotoxin, among them, 13 strains produced enterotoxins SEA, 3 strains produced enterotoxins SEB, and 1 strain produced enterotoxins SED. The drug susceptibility test found that 24 strains of Staphylococcus aureus developed drug resistance and multi-drug resistance, accounting for 85.2% of the total strains. The drug resistance rates of penicillin and ampicillin were the highest, accounting for 85.2%. The resistance rate of non-enterotoxin-producing Staphylococcus aureus to tetracycline was higher than that of enterotoxin-producing Staphylococcus aureus (P<0.01). There was no significant difference in the drug resistance rate (P>0.05).Staphylococcus aureus isolated from foodborne disease and food safety risk monitoring in Guiyang City from 2015 to 2021 only partially produced enterotoxins, but the drug resistance rate of Staphylococcus aureus was high and multi-drug resistant. The phenomenon is serious, and the relationship between drug resistance and enterotoxin needs to be further explored.

Staphylococcus aureus; Enterotoxin; ELISA; Drug resistance

周建松，男，主管技師，主要從事微生物檢驗(yàn)，Email：85895275@qq.com；

簡潔，女，主管技師，主要從事微生物檢驗(yàn)，Email：jianjie10@163.com。

（2022-5-12）