金耀建，黃信用，高素華，葉 均，樓宏強(qiáng)，張艷芳，孫義凱

（1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江金華 321007；2.金華市強(qiáng)盛生物科技有限公司，浙江金華 321000）

抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（ACPA）是在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗體，對RA 診斷具有高度特異性，檢測ACPA 已成為診斷RA 的主要指標(biāo)，并且除類風(fēng)濕因子（RF）外，ACPA 也納入了新版RA分類標(biāo)準(zhǔn)[1]。ACPA 在70%～80%的RA病人體內(nèi)都能被檢測到且特異性高達(dá)98%左右[2-3]，且ACPA可以在RA患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前5年～10年出現(xiàn)，能預(yù)測更嚴(yán)重的臨床癥狀[4-7]。

目前，ACPA 的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CIA）、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLIA）、膠體金免疫層析法（GICA）和時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）等，依據(jù)檢測原理的差異各檢測方法具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測ACPA是一種新型的、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、試劑通用型的檢測方法，能早期診斷RA。為此，該檢測試劑盒的制備具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

羧基微球（上海輝質(zhì)生物科技有限公司）、牛血清白蛋白（BSA，鹽城賽寶生物科技有限公司）、環(huán)瓜氨酸肽和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（均為廣東菲鵬生物有限公司）。

1.2 方法

該試劑盒由試劑一、試劑二、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品四部分組成。

1.2.1 試劑一配方

磷酸氫二鈉22.4 g、磷酸二氫鉀5.4 g、PEG6000 20 g、氯化鈉20 g、JX515 0.2 mL、純化水1000 mL，加純水至1068 g，密度為ρ=1.068，pH值為7.50±0.10。

1.2.2 試劑二配方

純化水130 mL、硼酸緩沖液40 mL（硼酸1 g、純化水40 mL，pH 值為10.00±0.10，密度為ρ=1.025）、羧基微球10 g、EDC 溶液5 mL（EDC 0.05 g、純化水5 mL，密度為ρ=1.010）、環(huán)瓜氨酸肽2 g、BSA 溶液15 mL（BSA 1.5 g、純化水15 mL，密度為ρ=1.100），試劑二稀釋液1000 mL（磷酸氫二鈉22.4 g、磷酸二氫鉀5.4 g、JX515 0.2 mL，加水到1028 g，密度為ρ=1.028，pH值為7.50±0.10）。

1.2.3 反應(yīng)體系中主要成分篩選

選擇粒徑分別為70nm、108nm及240nm的羧基微球與抗原，分別按5∶1、4∶1、3∶1、2∶1比例混合，目的是選擇抗原與羧基微球交聯(lián)的合適比例。羧基微球與抗原交聯(lián)時(shí)間分別為30 min、45 min、60 min；BSA 封閉時(shí)間分別為30 min、60 min、120 min。將 約為100 U/mL 的ACPA 樣本進(jìn)行1/2 及1/4 梯 度稀釋。

基本操作：樣本5μL，加試劑一150 μL，混勻，37 ℃孵育300 秒，在波長700 nm 處讀取吸光度A1，然后加試劑二50 μl，37 ℃孵育300 秒，在波長546 nm處讀取吸光度A2，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即能得出樣本中ACPA的含量。

1.2.4 與同行試劑比對

用上述確認(rèn)體系與工藝配制試劑，同時(shí)選擇北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司（北京九強(qiáng)）ACPA試劑及血清樣本40 例（ACPA 含量為1 U/mL-100 U/mL）進(jìn)行含量檢測比對，初步確定試劑盒準(zhǔn)確性。

1.2.5 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水溶液檢測

校準(zhǔn)品及質(zhì)控品主要原料為ACPA，將ACPA按理論值配制成100 U/mL的水溶液，將該水溶液稀釋成1/2及1/4，再用上述確認(rèn)的試劑進(jìn)行檢測。

1.2.6 校準(zhǔn)品溯源

依據(jù)GB/T 21415-2008/ISO 17511：2003“體外診斷醫(yī)療器械，生物樣品中量的測量，校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性”要求對工作校準(zhǔn)品和產(chǎn)品校準(zhǔn)品溯源。

1.2.6 .1工作校準(zhǔn)品溯源

選用研制的ACPA 試劑，批號(hào)為20 180903；待定值工作校準(zhǔn)品，批號(hào)為20 181014；北京九強(qiáng)ACPA試劑及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，批號(hào)為20180807，校準(zhǔn)品標(biāo)示值為100.0 U/mL±11.2 U/mL，質(zhì)控品靶值為30.0 U/mL±6.0 U/mL 或60.0 U/mL±12.0 U/mL；新鮮血清樣本40份，在貝克曼AU480自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測。

建立北京九強(qiáng)參照系統(tǒng)。用北京九強(qiáng)配套校準(zhǔn)品校準(zhǔn)北京九強(qiáng)試劑，檢測北京九強(qiáng)配套高低值質(zhì)控品，建立參照系統(tǒng)（要求質(zhì)控值在范圍內(nèi)且CV≤5.0%）。

工作校準(zhǔn)品初定值。隨機(jī)抽取10 瓶工作校準(zhǔn)品，用以上系統(tǒng)檢測，每瓶檢測3 次，計(jì)算均勻性及均值。若均勻性符合0＜F≤F0.05（vbb，vwb）的要求，則其均值作為初定值。

工作校準(zhǔn)品終定值。在指定檢測儀器上開通兩個(gè)通道，一個(gè)通道為北京九強(qiáng)參照系統(tǒng)，另一個(gè)通道為初定值工作校準(zhǔn)品，用以校準(zhǔn)本研制試劑的定值系統(tǒng)，兩個(gè)系統(tǒng)同時(shí)對40份新鮮臨床樣本進(jìn)行檢測（覆蓋本研制試劑線性范圍），以參照系統(tǒng)檢測結(jié)果為x，以定值系統(tǒng)檢測結(jié)果為y，進(jìn)行線性回歸y=a+bx分析，若滿足以下三個(gè)條件，即斜率b在1.00±0.05 范圍內(nèi)，截距a在0±10 范圍內(nèi)；相關(guān)系數(shù)r≥0.975，則認(rèn)為初定值可靠并作為該工作校準(zhǔn)品最終定值。

工作校準(zhǔn)品不確定度。工作校準(zhǔn)品不確定度包括北京九強(qiáng)校準(zhǔn)品引入，定值精密度引入，均勻性引入。北京九強(qiáng)校準(zhǔn)品引入的相對不確定度（Uwcal）為5.60%，直接引用。定值精密度引入的相對不確定度（Urep）用北京九強(qiáng)檢測系統(tǒng)測試工作校準(zhǔn)品10次，計(jì)算公式為：

其中x為每次測定值，n為測定次數(shù)。均勻性引入的相對不確定度（Ubb）通過隨機(jī)抽取10瓶工作校準(zhǔn)品，用以上系統(tǒng)檢測，每瓶工作校準(zhǔn)品檢測3 次，計(jì)算其均值xˉ、瓶間均方（MSbb）及瓶內(nèi)均方（MSwb），從而得到Ubb：

通過上述計(jì)算，進(jìn)而得到總相對不確定度（Uc）及工作校準(zhǔn)品擴(kuò)展不確定度（U）：

其中k=2（95%）；X為工作校準(zhǔn)品定值。

1.2.6 .2 產(chǎn)品校準(zhǔn)品溯源

本研究ACPA 試劑，批號(hào)為20 181019；工作校準(zhǔn)品，批號(hào)為20170611，定值為100.0 U/mL±11.8 U/mL；待定值產(chǎn)品校準(zhǔn)品，批號(hào)為20 181019；在貝克曼AU480自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品校準(zhǔn)品定值和不確定度。用工作校準(zhǔn)品校準(zhǔn)本試劑建立檢測系統(tǒng)。隨機(jī)抽取規(guī)格為5.0 U/mL及100.0 U/mL的產(chǎn)品校準(zhǔn)品各10瓶，每瓶檢測3次，計(jì)算其均勻性及均值。若均勻性符合為0＜F≤F0.05（vbb，vwb）的要求，則其均值作為定值。不確定度計(jì)算方法同工作校準(zhǔn)品。

1.2.7 質(zhì)控品定值

本研制ACPA 試劑（產(chǎn)品校準(zhǔn)品批號(hào)為20180806，待定值產(chǎn)品質(zhì)控品批號(hào)為20180806，報(bào)告定值質(zhì)控品1 為19.99 U/mL，質(zhì)控品2 為50.02 U/mL），用產(chǎn)品校準(zhǔn)品在貝克曼庫爾特、日立、西門子、羅氏、邁瑞、東芝、雅培、迪瑞等品牌的21 種機(jī)型上定標(biāo)，測試兩水平質(zhì)控品各10 次，分別計(jì)算均值作為該機(jī)型上質(zhì)控品定值。最后將所有機(jī)型定值匯總，取統(tǒng)計(jì)學(xué)平均值作為質(zhì)控品報(bào)告定值，要求質(zhì)控品準(zhǔn)確度指標(biāo)與標(biāo)示值偏差≤20%。

1.2.8 確定參考區(qū)間

收集寧波市開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科新鮮體檢血清標(biāo)本240 例，其中男120 例，女120 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝、膽、胰、肺及心腦血管等相關(guān)指標(biāo)異常標(biāo)本；（2）溶血及脂濁標(biāo)本；（3）放置時(shí)間超過24 小時(shí)標(biāo)本。所有標(biāo)本收集后，在2 ℃～8 ℃下冷藏運(yùn)輸。用本研制的試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品（批號(hào)：20181019）進(jìn)行檢測，用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Dixon 法判斷離群值，采用Z 檢驗(yàn)判斷參考區(qū)間是否需分組，用Kolmogorov-Smirnov 法進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)，P＞0.05 表示數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用95%可信區(qū)間計(jì)算結(jié)果X±1.96SD。

1.2.9 產(chǎn)品校準(zhǔn)品和質(zhì)控品穩(wěn)定性

試劑穩(wěn)定性主要為效期穩(wěn)定性及開瓶穩(wěn)定性。校準(zhǔn)品批號(hào)為20171129，質(zhì)控品批號(hào)為20171129。

1.2.9 .1 效期穩(wěn)定性

校準(zhǔn)品和質(zhì)控品按照規(guī)定條件下2 ℃～8 ℃貯存，各取出2瓶放入對照溫度為-80 ℃的環(huán)境中，直到12 個(gè)月穩(wěn)定期滿后使用同步法進(jìn)行穩(wěn)定性研究。使用該項(xiàng)目常規(guī)試劑盒，在全自動(dòng)生化分析儀上重復(fù)條件下每瓶檢測3 次，記錄結(jié)果并用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9 .2 首次開封后穩(wěn)定性

校準(zhǔn)品和質(zhì)控品首次開封后按照規(guī)定條件下2 ℃～8 ℃貯存，分別在貯存0、4、8、12、16 天取出同一瓶測量，每瓶3 次，記錄結(jié)果并用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.10 干擾物研究

選擇混合血清一份（樣本批號(hào)分別為：20170905、20171017、20171129），分成五份，四份加入干擾物作為干擾標(biāo)本，另一份不加干擾物作為基礎(chǔ)標(biāo)本，各干擾組標(biāo)本組合見表1。每份標(biāo)本重復(fù)測五遍，記錄試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算分析干擾物濃度，每月測1次連續(xù)測3個(gè)月，其中各組干擾值=各組干擾物標(biāo)本測定均值-基礎(chǔ)標(biāo)本測定均值。干擾值落在基礎(chǔ)樣本值±1.96SD 范圍內(nèi)（95%可信區(qū)間內(nèi)）為無顯著干擾。

表1 各干擾組標(biāo)本組合

1.2.11 臨床評價(jià)

收集來自于株洲市中心醫(yī)院的臨床血清標(biāo)本100例，要求排除嚴(yán)重渾濁、脂血、溶血、高膽紅素樣本。參照試劑為浙江夸克生物科技有限公司，批號(hào)為190628。目的是驗(yàn)證考核試劑與已上市的對照系統(tǒng)等效性。對樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行離群值分析、回歸分析、偏倚分析等指標(biāo)的計(jì)算，從而評價(jià)考核試劑在臨床上的安全性和有效性。

1.2.11.1 離均值分析

以浙江夸克生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑和方法作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用其與本文研制的試劑和方法，同時(shí)測定同一份血清標(biāo)本，進(jìn)行結(jié)果的離均值分析，以此來檢驗(yàn)本研制的試劑和方法與參照標(biāo)準(zhǔn)的等效性。若兩種方法測試的絕對差值/相對差值均超出所有樣本均值的4倍，則被判斷為離群值，離群值不超過總數(shù)的2.5%。

1.2.11 .2 回歸分析

以考核試劑作Y軸，對照試劑作X軸，建立直線回歸方程y=a+bx，計(jì)算相關(guān)系數(shù)或決定系數(shù)并計(jì)算斜率及截距的95%可信區(qū)間，相關(guān)系數(shù)要求r≥0.975。將考核試劑測定值與對照試劑測定值按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別進(jìn)行相關(guān)性和一致性分析，以考查考核試劑與對照試劑是否等效。

1.2.11 .3 偏倚分析

計(jì)算醫(yī)學(xué)決定水平的預(yù)期偏倚及95%可信區(qū)間，與可接受偏倚的限值15%進(jìn)行比較，如果預(yù)期偏倚的95%可信區(qū)間未超出可接受偏倚的限值，說明二者等效。偏倚分析用方程式B=Σ（Yi-Xi）/N分別計(jì)算每組的平均偏倚B及考核試劑與對照試劑測定值差值的標(biāo)準(zhǔn)差（其中B是適當(dāng)濃度范圍內(nèi)估計(jì)的預(yù)期（平均）偏倚，X為對照試劑測定值，Y為考核試劑測定值）。計(jì)算醫(yī)學(xué)決定水平（Xc）預(yù)期偏倚估計(jì)值（B^c）及其95%區(qū)間

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系中主要成分篩選結(jié)果

羧基微球粒徑108 nm，微球與抗原比例3∶1，微球與抗原交聯(lián)時(shí)間60分鐘，BSA 封閉時(shí)間60分鐘，這時(shí)方法學(xué)靈敏度最佳。結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)體系中各成分篩選結(jié)果

2.2 與同行試劑比對

結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)r=0.9835（y=0.9533x+2.5397，R2=0.9672）。因此，可以認(rèn)為本試劑與北京九強(qiáng)試劑有很好的相關(guān)性，同時(shí)本試劑可以溯源至北京九強(qiáng)ACPA試劑。

2.3 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水溶液檢測

如表3 所示，表明各濃度點(diǎn)實(shí)測結(jié)果與理論值偏差較小。因此，可以用抗環(huán)瓜氨酸肽抗體配制成合適濃度校準(zhǔn)品及質(zhì)控品以滿足實(shí)際使用。

表3 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水溶液檢測結(jié)果

2.4 校準(zhǔn)品溯源

2.4.1 工作校準(zhǔn)品溯源結(jié)果

以北京九強(qiáng)作為參照系統(tǒng)，溯源結(jié)果如下：北京九強(qiáng)低值質(zhì)控品（30 U/mL）和高值質(zhì)控品（60 U/mL）的均值分別是30.01 U/mL 和60.43 U/mL，偏差分別是0.04%和0.72%，CV分別是1.44%和1.10%，本工作校準(zhǔn)品均值是100.3 U/mL，偏差0.00%，CV為1.73%，Urep=0.379%，Ubb=1.818%，Uc=5.902%，擴(kuò)展不確定度=11.8。本工作校準(zhǔn)品初定值為100.0 U/mL。參照系統(tǒng)和定值系統(tǒng)檢測臨床標(biāo)本，線性回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為y= 1.010x-0.420（r=0.981），初定值符合要求。因此，本工作校準(zhǔn)品最終定值100.0 U/mL，該批工作校準(zhǔn)品定值為100±11.8 U/mL。

2.4.2 產(chǎn)品校準(zhǔn)品溯源結(jié)果

該批產(chǎn)品校準(zhǔn)品（5.0 U/mL）定值為5.0 U/mL±0.7 U/mL，產(chǎn)品校準(zhǔn)品（100.0 U/mL）定值為100.0 U/mL±12.7 U/mL。結(jié)果見表4。

表4 產(chǎn)品校準(zhǔn)品溯源結(jié)果

2.4.3 質(zhì)控品定值

經(jīng)過對8 個(gè)品牌的21 種機(jī)型質(zhì)控品檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)質(zhì)控品準(zhǔn)確度指標(biāo)，該質(zhì)控品定值分別為20.0 U/mL±4.0 U/mL，50.0 U/mL±10.0 U/mL。

2.4.4 參考區(qū)間

對240 名臨床血清標(biāo)本數(shù)據(jù)分析（見表5）結(jié)果表明：（1）Z＜Z*，則無需進(jìn)行男女分組；（2）合并男女分組后進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示符合正態(tài)分布；（3）合并男女分組后計(jì)算參考上限及下限，則參考下限及上限分別為5.0 U/mL及34.3 U/mL。因此，參考區(qū)間確定為0 U/mL～35 U/mL。

表5 血清檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.4.5 產(chǎn)品校準(zhǔn)品和質(zhì)控品穩(wěn)定性

產(chǎn)品校準(zhǔn)品及質(zhì)控品在2 ℃～8 ℃貯存0個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月、9 個(gè)月、12 個(gè)月，效期穩(wěn)定性檢測結(jié)果變化趨勢不顯著（P≥0.05）。

產(chǎn)品校準(zhǔn)品及質(zhì)控品首次開封后穩(wěn)定性檢測，0 天、4 天、8 天、12 天、16 天檢測結(jié)果的變化趨勢不顯著（P≥0.05）。

2.4.6 干擾物研究

膽紅素干擾試驗(yàn)、甘油三酯干擾試驗(yàn)、血紅蛋白干擾試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)膽紅素≤200 mg/L、甘油三酯≤3 g/L、血紅蛋白≤2.5 g/L 時(shí)，對三批試劑結(jié)果均無顯著影響。

2.4.7 臨床評價(jià)

用對照試劑和考核試劑檢測臨床血清標(biāo)本100例，離群點(diǎn)數(shù)量為0 例；兩者回歸分析結(jié)果y=0.9607x-0.3451（P＜0.05），系數(shù)b 95%可信區(qū)間CI=0.9180～1.0034（P＜0.05），截距a 95%可信區(qū)間CI=-2.4020～1.7118（P≥0.05），說明兩種試劑直線關(guān)系成立。

對考核試劑和對照試劑檢測結(jié)果進(jìn)行一致性分析，兩者檢測結(jié)果的Bland-Altam 分析基本數(shù)據(jù)見表6，絕對偏倚和相對偏倚都在允許范圍內(nèi)。

表6 Bland-Altam分析基本數(shù)據(jù)

偏倚分析結(jié)果，當(dāng)Xc=35 U/mL 時(shí)，B^c95%區(qū)間為[-2.639，-0.8022]，而允許限度為[-5.25，5.25]，考核試劑相對于對照試劑檢測結(jié)果，偏倚量在允許誤差范圍內(nèi)。

3 討論

膠乳增強(qiáng)免疫比濁法是近年來快速發(fā)展的一種穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確、能自動(dòng)化、微量化、快速化檢測體液蛋白均相免疫比濁的方法[8-10]，該方法是在羧基微球表面交聯(lián)環(huán)瓜氨酸肽抗原成為致敏顆粒，增加了靈敏度。檢測患者血清中ACPA 時(shí)，當(dāng)抗原致敏的微球和病人血清中的ACPA 結(jié)合并聚集在一起，改變了反應(yīng)體系中液體的透光性，透光性（即吸光度）的變化與反應(yīng)體系中的抗體含量呈線性相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出患者血清中的抗體含量。

通過對本研制的試劑盒反應(yīng)體系中主要成分篩選，確定了最佳方法學(xué)，并將試劑盒與北京九強(qiáng)ACPA 試劑盒比較，結(jié)果為y=0.9533x+2.5397，R2=0.9672，說明兩者具有很好的相關(guān)性。

溯源性是試劑盒能否用于臨床診斷的重要環(huán)節(jié)，本文以北京九強(qiáng)作為參照系統(tǒng)，將參照系統(tǒng)與本工作校準(zhǔn)品定值系統(tǒng)檢測臨床標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，無論均值偏差還是變異度都符合要求，線性回歸y=1.010x-0.420（r=0.981）。

該方法靈敏、穩(wěn)定，適用于臨床常用機(jī)型，最低檢測下限為5.0 U/mL，線性范圍較寬，參考范圍95%可信區(qū)間為＜35 U/mL。產(chǎn)品校準(zhǔn)品和質(zhì)控品穩(wěn)定性好，在2 ℃～8 ℃貯存12 個(gè)月和開封16 天后檢測結(jié)果變化不顯著。干擾物膽紅素≤200 mg/L、甘油三酯≤3 g/L、血紅蛋白≤2.5 g/L 時(shí)，對三批試劑結(jié)果均無顯著影響。在臨床評價(jià)中，對照試劑和考核試劑檢測100例臨床標(biāo)本，線性回歸y=0.9607x-0.3451（r=0.9763），偏倚分析在允許誤差范圍內(nèi)，說明考核試劑完全達(dá)到臨床檢測要求。本研制的試劑盒已取得中華人民共和國醫(yī)療器械注冊證（體外診斷試劑），注冊證編號(hào)：浙械注準(zhǔn)20202400782。