肖 蓉， 胡 展， 羅容珺， 楊 華， 雷 平， 郭照輝， 李詠梅， 付祖姣

(湖南省微生物研究院 湖南省農用微生物應用工程技術研究中心，湖南 長沙 410009)

活體微生物制劑利用微生物在不同環(huán)境中的自我繁殖能力，在改善微生物群落結構、降低污染、提升土壤地力、促進作物生長和抗病能力等方面發(fā)揮著越來越重要的作用[1-4]。截至2019年11月，在農業(yè)部登記的微生物肥料產品達6 617個，其中農用微生物菌劑約3 000個，占比近50%，使用的微生物種類超過170個，涵蓋了細菌、放線菌和真菌各大類別(http://www.biofertilizer95.cn/zhdjcpml)。至2019年11月，登記的微生物農藥產品有468個，主要涉及芽胞桿菌、真菌和病毒等微生物(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)[5]。此外，微生物在飼料、食品、環(huán)保和能源等領域的應用也在逐年增加。雖然微生物在農業(yè)、飼料業(yè)、環(huán)境等領域已經取得了很好的成績，但微生物在環(huán)境中的應用效果嚴重受限于其定殖水平和對環(huán)境的耐受能力[6-8]。耐受能力弱的微生物在產品貨架期或投入環(huán)境后，可能因為存活率過低很難被檢測到[9]，或者即便能檢測到，也因為增殖力弱而難以達到預期效果。因此，對微生物進行包括紫外線、鹽、酸堿度和溫度等環(huán)境條件的耐受水平分析是對于功能微生物的應用具有重要意義。傳統(tǒng)微生物環(huán)境耐受水平分析主要是通過平板分離獲得對單克隆菌落數量的統(tǒng)計，或通過試管、搖瓶進行微生物培養(yǎng)，再根據菌體光密度分析其生長曲線[10-11]。為了摸索簡便可行的操作方法，研究人員采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)微生物，以獲得微生物對不同抗生素的耐受水平[12]，或實現對功能菌株的高通量篩選[13]，證實了96孔培養(yǎng)板對微生物進行微量培養(yǎng)的可行性和便利性。還有學者比較了酶標儀微量法和分光光度法在測定大腸埃希菌發(fā)酵菌液濃度上的差異，結果顯示兩者獲得的菌液吸光度值無顯著性差異，但酶標儀微量法測得的結果準確度和精密度更高[14]。平板分離法是評價微生物環(huán)境耐受水平的最經典方法，但該方法操作繁瑣、耗時長，且因為操作繁瑣會導致結果誤差較大。隨著酶標儀應用的不斷深入[15-17]，其在微生物檢測上的便利性和重要性也日益凸顯。本研究通過比較酶標儀分光光度法和傳統(tǒng)平板分離法檢測微生物對不同環(huán)境條件耐受水平上的差異，期望為微生物的耐性研究提供一種快速、簡便且高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)20-10、嗜線蟲沙雷氏菌(Serratianematodiphila)C7-1、鏈霉菌(Streptomycessp.)Ahn30和TJA4由湖南省微生物研究院植物營養(yǎng)與保護室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基用于細菌的培養(yǎng)。②ISP2培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物10，麥芽提取物4，葡萄糖4，用于放線菌的培養(yǎng)[18]。

1.1.3 主要儀器與設備 微孔板恒溫震蕩器(MB100-4A，杭州奧盛)；全波長酶標儀(Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific)；8通道移液器(1～10 μL 和30～300 μL，Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌懸液的制備 細菌在LB培養(yǎng)基上劃線純化，挑取單菌落接入10 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜，備用。鏈霉菌在ISP2固體培養(yǎng)基上28 ℃劃線純化，挑取單菌落轉接新鮮ISP2培養(yǎng)皿28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待孢子長好，用滅菌不銹鋼稱量勺輕輕刮取孢子于適量的含0.5%吐溫-80的水溶液中懸浮，制成孢子懸浮液。

1.2.2 平板分離法檢測菌株紫外線耐受水平 取1～2 mL菌懸液加入24孔培養(yǎng)板中，置于30 W、254 nm波長紫外線燈正下方30 cm處分別照射2、5、10、30 min，以未經紫外線照射的處理為對照，每個處理重復3次。取1～2 mL鏈霉菌孢子懸浮液加入24孔培養(yǎng)板中，在相同紫外線條件下分別照射10、30、60 min。將紫外線照射后的菌懸液按比例用無菌水稀釋至合適濃度，并分別取100 μL稀釋樣品涂布LB或ISP2平板，每個稀釋樣品重復涂布2個平板，細菌30 ℃培養(yǎng) 48 h，鏈霉菌28 ℃培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計菌落數。

1.2.3 酶標儀分光光度法檢測菌株紫外線耐受水平 菌懸液或孢子懸浮液按1.2.2進行紫外線照射后，按2%(體積分數)的接種量接入預先添加200 μL/孔 LB或ISP2培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，每個樣品重復2次。以2%無菌水接種的培養(yǎng)液做空白對照。接種完成后在96孔板上貼上一層無菌專用封膜，再蓋上96孔板蓋，以避免孔內培養(yǎng)液在振蕩過程中濺出互相污染。將96孔板放入微孔板恒溫振蕩器上，細菌30 ℃、500 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h，鏈霉菌28 ℃、500 r/min培養(yǎng)6、12、18、21、24、27 h，用酶標儀檢測各培養(yǎng)液在600 nm的吸光度(OD600)，以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

1.2.4 酶標儀分光光度法檢測細菌的pH耐受水平 將LB培養(yǎng)液用HCl或NaOH調整pH值分別為4、5、6、7、8、9。在96孔板中加入200 μL不同pH值的LB液體，以2%的接種量接入培養(yǎng)過夜的菌懸液，貼上封膜，并蓋上板蓋，放入微孔板恒溫震蕩器上30 ℃，700 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h。分別以不同pH值的未接菌培養(yǎng)液做空白對照，每個pH重復6次。用酶標儀檢測各培養(yǎng)液的OD600，并繪制菌株生長曲線。

1.2.5 酶標儀分光光度法檢測細菌的鹽耐受水平 配制含1%、3%、5%、7%、9%NaCl的LB培養(yǎng)液。按1.2.4的方法加入培養(yǎng)液和菌懸液并培養(yǎng)，分別以不同鹽濃度的未接菌培養(yǎng)液做空白對照。用酶標儀檢測各培養(yǎng)液的OD600，繪制不同鹽濃度下菌株的生長曲線。

1.2.6 數據處理 采用Excel軟件對數據進行處理和統(tǒng)計，采用SPSS19.0軟件(Duncan法)對不同處理間的差異進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 傳統(tǒng)平板分離法和酶標儀分光光度法在細菌紫外線耐受性能檢測上的差異分析

將解淀粉芽胞桿菌20-10、嗜線蟲沙雷氏菌C7-1分別紫外線照射0～30 min，采用傳統(tǒng)平板分離菌落計數方法統(tǒng)計活菌數，結果如圖1所示。兩種細菌分別經紫外線照射2、5、10和30 min后，活菌數均有所下降。其中，菌株20-10經紫外線照射2～10 min時，活菌濃度下降約一個數量級，菌株存活率為(28.58±2.23)%～(12.04±1.42)%，但當該菌株經紫外線照射30 min時，活菌濃度下降非常顯著，直接下降2個數量級，降至(7.27×107±7.02×106) cfu/mL(表1)，菌株存活率為(0.64±0.06)%。沙雷氏菌C7-1經紫外線照射后的活菌濃度下降趨勢與菌株20-10一致，但活菌下降比例更多，菌株存活率僅為(10.32±0.57)%～(0.26±0.09)%。該結果說明嗜線蟲沙雷氏菌耐紫外線性能比解淀粉芽胞弱。經統(tǒng)計學分析不同處理間的數據差異，發(fā)現無論紫外線照射多長時間，其活菌濃度均在對照基礎上呈顯著性下降(P<0.05)，但照射2～5 min差異不顯著，而照射(2～5)、10、30 min差異顯著(表1)。

表1 細菌經紫外線照射后的活菌濃度

采用酶標儀分光光度法分析菌株20-10、C7-1經紫外線照射后的生長曲線(圖2)。從生長曲線分析，菌株20-10經紫外線照射2、5、10 min后，生長曲線與對照基本一致，4～6 h的平均生長速度比對照分別下降了7.24%、11.96%和12.83%，但該菌株經紫外線照射30 min后的生長曲線與對照有明顯差異，對數期時間延長，4～6 h的平均生長速度比對照下降了24.34%。不同處理間的數據經統(tǒng)計學分析發(fā)現，菌株20-10經紫外線照射不同時間后，生長所至的最高細胞光密度值之間差異不顯著，但均顯著低于對照(P<0.05)。菌株C7-1經紫外線照射2～30 min后，生長曲線基本與對照一致，對數期和穩(wěn)定期時間也基本保持一致。對不同紫外線照射時間后的細胞光密度進行統(tǒng)計學分析發(fā)現，菌株在培養(yǎng)前2 h，紫外線照射后的菌株生長光密度均顯著低于對照，當培養(yǎng)4 h時，除了紫外線照射30 min的處理外，其他處理的光密度與對照無顯著差異，隨后各處理分別達到各自的生長頂峰，但所有紫外線照射后的最高光密度值均顯著低于對照(P<0.05)。

圖1 細菌經紫外線照射后的活菌數(平板分離法)Fig.1 The number of viable bacteria after UV irradiation(Plate separation method)

圖2 菌株20-10和C7-1經紫外線照射后的生長情況(酶標儀分光光度法)Fig.2 The growth of strain 20-10 and C7-1 after UV irradiation(Microplate reader method)

通過比較兩種方法檢測菌株耐紫外線性能的差異(表2)，發(fā)現兩者存在顯著不同。傳統(tǒng)平板分離法獲得存活菌株的數目，一個菌株經紫外照射4個時間，重復3次，稀釋3個濃度，每個濃度2個平行，所需平板數量90個，且每個平板都涉及加樣、涂布，若2個菌株，則需至少0.5 d以上。此外，該方法培養(yǎng)時間較長，約需2 d，最后平板菌落數量統(tǒng)計依然還需要大量時間。而采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，一塊板可以同時檢測2個菌株，即便每個時間段使用單獨培養(yǎng)板進行檢測，平均一個菌株最多使用2塊板。8通道移液器的使用，使96孔培養(yǎng)板加樣時間大大縮減，培養(yǎng)時間只需8 h，酶標儀檢測僅需幾分鐘就能完成檢測，整個實驗可控制在1 d內完成。結果分析表明，兩種檢測方法均能體現菌株對紫外線的耐受水平，均能進行顯著性差異分析，且兩者獲得的顯著性程度基本一致，經紫外線照射后，兩個菌株的活菌濃度及生長所至最高光密度均顯著低于對照。只是兩種方法檢測的結果不同，前者檢測的是存活菌株的濃度，而后者獲得的是存活菌株的生長曲線。

表2 兩種方法檢測細菌紫外線耐受性能的差異

2.2 傳統(tǒng)平板分離法和酶標儀分光光度法分析鏈霉菌紫外線耐受性能的差異分析

考慮到鏈霉菌在實際中的廣泛應用，本研究同樣比較了兩種方法在檢測鏈霉菌紫外線耐受性能上的差異。傳統(tǒng)平板分離法檢測發(fā)現兩株鏈霉菌Ahn30、TJA4的孢子經紫外線照射后，存活趨勢一致(圖3)。兩個菌株的孢子懸浮液在紫外線照射10～60 min時，孢子濃度與對照相比，均顯著下降1～2個數量級，且下降比例與時間呈正相關(表3)。經統(tǒng)計學分析，兩株鏈霉菌經紫外線照射10～60 min后的活菌濃度與對照相比差異均顯著(P<0.05)，但不同紫外線照射時間的處理差異不顯著(P>0.05)。

圖3 鏈霉菌經紫外線照射后的活菌數(平板分離法)Fig.3 The number of viable streptomyces after UV irradiation(Plate separation method)

表3 鏈霉菌經紫外線照射后的活菌濃度

采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)并經紫外線照射不同時間的孢子懸浮液，通過酶標儀檢測不同時間培養(yǎng)物在600 nm處的吸光度，發(fā)現兩株鏈霉菌經紫外線照射后，孢子萌發(fā)和菌絲延伸速度明顯變緩(圖4)。與未經紫外線照射的菌株相比，菌株Ahn30和TJA4在培養(yǎng)的前24 h光密度均顯著低于對照(P<0.05)，但這種差異在隨后的培養(yǎng)中逐漸降低，菌株Ahn30培養(yǎng)至27 h差異已不顯著，但菌株TJA4所需時間可能更長。兩株鏈霉菌經紫外線照射后的孢子培養(yǎng)所至最高光密度的時間隨著紫外線照射時間的延長而延后，但最高值均顯著低于對照。

2.3 酶標儀分光光度法在檢測微生物其他耐受特性上的應用

為了檢測該方法的適用性，本研究分析了其在細菌和放線菌對pH和鹽耐受上的檢測效果(圖5～7)。圖5結果顯示，菌株C7-1比20-10具有更廣泛的pH適應性，前者在pH 5～9的范圍內均能很好地生長，僅在pH 4的條件下生長變緩，而后者在pH 8的條件下生長最佳，其次為pH 6和pH 7，在pH 4下幾乎不生長。從圖6可以看出，菌株20-10能在1%～7%的鹽濃度下生長，但隨著鹽濃度增加，遲緩期延長，當鹽濃度達到7%時生長非常緩慢；而菌株C7-1在低于3%的鹽濃度下能夠生長，而當鹽濃度提高至5%以上時幾乎不生長。圖7為鏈霉菌對鹽的耐受水平，從圖7可看出，菌株Ahn30能在0%～3%的鹽濃度下生長，當鹽濃度高于5%時幾乎不生長；而菌株TJA4在0%～9%的鹽濃度下均能生長，但隨著鹽濃度的升高延滯期延長，生長速度和最高活菌體密度都會降低。與細菌生長曲線相比較，雖然酶標儀分光光度法能檢測放線菌在不同鹽濃度下的生長情況，但鏈霉菌在96孔板中培養(yǎng)的平行差異非常大，這可能是因為隨著培養(yǎng)時間的延長放線菌菌絲成團所致。鑒于此，本研究未分析該方法對鏈霉菌pH耐受的適用性。

圖4 鏈霉菌Ahn30和TJA4經紫外線照射后的生長情況(酶標儀分光光度法)Fig.4 The growth of strain Ahn30 and TJA4 after UV irradiation(Microplate reader method)

圖5 菌株20-10和C7-1在不同pH條件下的生長情況(酶標儀分光光度法)Fig.5 The growth of strain 20-10 and C7-1 at different pH(Microplate reader method)

圖6 菌株20-10和C7-1在不同鹽濃度下的生長情況(酶標儀分光光度法)Fig.6 The growth of strain 20-10 and C7-1 at different salt concentrations(microplate reader method)

圖7 鏈霉菌Ahn30和TJA4在不同鹽濃度下的生長情況Fig.7 The growth of strain Ahn30 and TJA4 at different salt concentrations

3 討 論

本研究采用傳統(tǒng)平板分離法和酶標儀分光光度法分別檢測了細菌和鏈霉菌對紫外線的耐受性能，并比較分析了兩種方法的優(yōu)缺點。兩種方法均能分析微生物的紫外線耐受水平，但傳統(tǒng)平板分離法是通過統(tǒng)計菌株經紫外線照射后的存活量來進行判斷，而酶標儀分光光度法不能獲得菌株的存活量，卻可以根據其生長曲線分析存活菌株的增殖水平，進而判斷該菌株的紫外線耐受性。兩種方法都能獲得菌株的耐受性，其結果也存在一定的互補性。本研究結果顯示，傳統(tǒng)平板分離法檢測嗜線蟲沙雷氏菌C7-1在紫外線照射下存活率要遠低于解淀粉芽胞桿菌20-10，說明菌株C7-1對紫外線更敏感，但這種敏感性在菌株的增殖速度上并沒有相應的體現。酶標儀分光光度法檢測到菌株C7-1即使經紫外線照射后，其菌株增殖速度和水平也依然高于菌株20-10，這可能是因為菌株C7-1的生長速度本來就比菌株20-10快，雖然經過紫外線照射后的生長速度低于未經紫外線照射的對照，但相對于生長速度較低的菌株20-10，其生長速度依然較高，故其在相同時間的OD值也就比菌株20-10要高。兩種方法除了在結果上表現出一定的差異外，在操作上的差異更大。傳統(tǒng)平板分離法工作量大、耗時長，且經常會因為對初始活菌體密度判斷不準，導致稀釋梯度不合理，稀釋平板菌落數過高或過低，而需要重做，后者操作簡便、快速，且受初始活菌體密度影響小，即便初始活菌體密度很低，也僅影響生長曲線的延滯期，通過延長檢測時間即可解決問題并獲得理想的生長曲線。同時，因為酶標儀分光光度法操作簡便，可通過增加平行，在數據分析時去掉人為因素導致的偏差較大的數據，即可減少平行間的誤差，使結果更準確，平板分離法因為操作較復雜，很難再通過增加平行來減少人為誤差。因此，若只需分析微生物在不同環(huán)境下的耐受水平，則可選擇操作簡便快速的酶標儀分光光度法，若需要獲得微生物在不同環(huán)境下的存活量，則可采用傳統(tǒng)平板分離法，若為田間應用參考，則可結合兩種方法進行評估。

在采用酶標儀分光光度法進行微生物耐性分析時，需要批量培養(yǎng)微生物。本研究采用96孔細胞培養(yǎng)板批量培養(yǎng)不同處理的微生物。為了避免不同樣品在高速振蕩下產生孔間交叉感染，采用無菌封口膜對每個孔進行封口。但無菌封口膜的使用同樣限制了每個小孔中的供氧量，使得好氧菌在培養(yǎng)4～8 h后即進入穩(wěn)定期或衰亡期。因此，96孔培養(yǎng)板獲得的微生物生長曲線與搖瓶培養(yǎng)狀態(tài)下的微生物生長曲線不一致，對數期時間變短，且穩(wěn)定期、衰亡期時間提前。這種情況可通過不加封口膜進行緩解。本研究嘗試采用96孔板，但不使用封口膜進行菌株20-10和C7-1在不同鹽濃度下的培養(yǎng)，發(fā)現兩株細菌500 r/min培養(yǎng)8 h，平行間標準差基本都保持在10%以下，未見明顯的相互污染現象，且由于培養(yǎng)過程未密封，保持自然供氧，菌株的對數期延長，生長曲線更趨向于搖瓶狀態(tài)下的生長情況(結果未顯示)。但無論封口與否，從兩株細菌的生長曲線反映其對鹽的耐受水平是一致的。

此外，本研究分析了酶標儀分光光度法在檢測微生物對pH和鹽的耐受水平中的適用性，發(fā)現該方法能很好地檢測細菌對不同pH和鹽濃度的耐受水平，但在進行鏈霉菌鹽耐受試驗時，其結果不如細菌理想：生長曲線不如細菌一樣呈現典型的S型，且標準誤差較大。這可能是因為鏈霉菌在液體培養(yǎng)后期菌絲體易成團，菌體密度與OD值之間很難呈現線性關系，使得平行間誤差較大，且鏈霉菌孢子懸浮液即便添加吐溫-80作分散劑，但其在液體中的分散性依然不如細菌，且接種量少，接種引起的人為和儀器誤差較大。因此，該方法雖然能用于鏈霉菌對不同環(huán)境耐受性的檢測，但僅限于對鏈霉菌培養(yǎng)早期生長狀態(tài)的監(jiān)測。

總之，直接采用96孔培養(yǎng)板對微生物進行批量培養(yǎng)，結合酶標儀對不同時間的96孔培養(yǎng)板進行吸光度測定，可以在短時間內檢測大量菌株的生長性能、增殖活力、生長速率等指標。該方法相對傳統(tǒng)平板分離法，減少了大量樣本的稀釋、涂布和計數，相對于搖瓶培養(yǎng)微生物再進行光密度檢測法，減少了多個搖瓶的接種和頻繁取樣，大大縮減了工作量，且能獲得同樣準確的結果，對于研究微生物在不同環(huán)境因子中的耐受水平、優(yōu)勢菌株的誘變選育、微生物菌株的抗性篩選及活性分析等均是非?？焖偾矣行У姆椒ǎ哂袕V泛的適用性，是高通量操作的好幫手。