蔣明星， 易夢(mèng)鐲， 李 翠， 趙云潔， 李 歡， 蔡 胤， 殷根深

(昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

紫皮石斛(DendrobiumdevonianumPaxt.)主產(chǎn)于國家級(jí)貧困縣——云南省龍陵縣，作為國家二級(jí)瀕危植物，經(jīng)保護(hù)和人工繁育，已經(jīng)逐步成為當(dāng)?shù)氐男屡d特色產(chǎn)業(yè)[1]。2018年初云南省衛(wèi)健委發(fā)布了紫皮石斛食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)[2]，使之首次獲得了食品開發(fā)的合法身份，為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。石斛多糖是石斛的主要成分，與多糖相比，寡糖具有分子量小、黏度低、溶解度高等優(yōu)勢(shì)，是理想的新食品原料來源。目前，寡糖在食品保鮮、改善食品品質(zhì)[3]、低脂食品的加工和制作[4]等方面均有較好的應(yīng)用。寡糖還可以作為功能因子改善人體腸道菌群[5]、增強(qiáng)免疫力[6-7]、抗氧化[8]、延緩衰老[9]和抑制肥胖[10]等。雖然寡糖的種類較多，但是功能顯著的寡糖仍然欠缺，市場(chǎng)上也迫切需要天然來源的多功能性寡糖作為食品新原料。目前，獲取寡糖有多種方式，然而從自然界中直接提取的寡糖較為單一，通過化學(xué)合成或者化學(xué)降解法又容易造成污染，而生物酶轉(zhuǎn)化法具有底物特異性強(qiáng)、水解條件溫和、水解過程易于控制、成本低而且環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)[11]。目前，對(duì)于紫皮石斛功能成分的研究大多集中在石斛多糖，而石斛寡糖的研究鮮有報(bào)道，紫皮石斛寡糖的酶法制備還處于初級(jí)階段。與當(dāng)前研究較多的鐵皮石斛相比，紫皮石斛中的石斛多糖平均含量與之相當(dāng)，而甘露糖的平均含量明顯較高[12]。對(duì)紫皮石斛多糖的單糖組成分析表明，其主要由甘露糖和葡萄糖組成，還有少量的半乳糖、果糖、木糖和鼠李糖等[13-15]，表明紫皮石斛多糖可能具有更加豐富的結(jié)構(gòu)類型以及更多的生物活性產(chǎn)物。前期工作中獲取了大量工業(yè)級(jí)的紫皮石斛多糖，由于其黏度大，并且含有30%的酒精，難以進(jìn)行食品添加。本研究擬通過生物酶轉(zhuǎn)化法將其高效制備為紫皮石斛寡糖，通過小試和中試試驗(yàn)驗(yàn)證該方法的可行性，并對(duì)單糖組成進(jìn)行初步分析，為食品新原料的開發(fā)提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 紫皮石斛多糖、魔芋寡糖購自云南與諾生物工程有限責(zé)任公司；粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)由本試驗(yàn)分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL；②發(fā)酵培養(yǎng)基：石斛多糖 5 g，(NH4)2SO44 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏5 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 Takara BCA Protein Assay Kit(Code No. T9300A，寶生物工程(大連)有限公司)；硅膠板、硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)；鼠李糖(分析純)、核糖(分析純)、木糖(分析純)、阿拉伯糖(分析純)、甘露糖(分析純)、半乳糖(分析純)、麥芽二糖(分析純)、麥芽三糖(分析純)、麥芽四糖(分析純)、麥芽六糖(分析純)，德國 Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，上海阿達(dá)瑪斯有限公司。水浴鍋(HW.SY11-KP3，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)；磁力攪拌器(C-MAG HS 7 digital，德國IKA)；小型掌上離心機(jī)(mini G，德國IKA)；旋渦混合器(MS 3 basic，德國IKA)；立式高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-50SII，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(SpectraMAX 190，美國MD公司)； EYELA冷凍干燥機(jī)(FDU-2110，日本東京理化器械株式會(huì)社)；高效液相色譜儀(Agilent1100，美國安捷倫科技有限公司)；色譜柱((250 mm×4.6 mm，5 μm)SVEA C18，瑞典Nanologica公司)； PCR儀(GeneAmp PCR System9700,美國賽默飛世爾科技公司)；掃描電鏡(S-3400N，日本日立公司)；100 L發(fā)酵罐(PV10065，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)；高速離心噴霧干燥機(jī)(LPG-10，常州市超群干燥設(shè)備有限公司)；納濾機(jī)(有機(jī)納濾膜分子量100 Da，有效膜面積37 m2)(4040，江蘇無錫偉爾生化設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化與鑒定 將石斛多糖提取后的石斛渣上分離到的菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線法挑取單克隆進(jìn)行純化培養(yǎng)；CTAB法提取真菌基因組；ITS 擴(kuò)增引物ITS1-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；通過https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)；菌絲體經(jīng)S-3400N掃描電鏡放大300倍進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵酶液提取、蛋白濃度測(cè)定及酶活檢測(cè) 將活化的粗糙脈孢菌斜面菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3～10 d，發(fā)酵液4層紗布過濾，濾液在4 ℃，10 000 r/min條件下離心20 min，上清液即目的酶液。蛋白濃度檢測(cè)參照Takara BCA Protein Assay Kit(Code No. T9300A)說明書；酶活檢測(cè)：①對(duì)照組：粗酶液沸水浴滅活10 min，取滅活后的粗酶液20 μL與0.5%的石斛多糖溶液480 μL，混勻后45 ℃水浴反應(yīng)2 h。②實(shí)驗(yàn)組：取粗酶液20 μL與0.5%的石斛多糖溶液480 μL，混勻后45 ℃水浴反應(yīng)2 h。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取0.1 g麥芽糖，用蒸餾水配制成10 mg/mL的麥芽糖母液，將母液分別稀釋至0.1、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL。分別取7個(gè)濃度的麥芽糖溶液500 μL，各加入500 μL的DNS試劑，混勻后沸水浴加熱7 min。冷卻后取225 μL反應(yīng)液加入微孔板，酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)吸光度值和麥芽糖濃度制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 TLC定性分析 展開劑：V正丁醇∶V冰乙酸∶V水=2∶1∶1；顯色劑：將2 mL苯胺、 2 g二苯胺、10 mL 85%磷酸溶于100 mL丙酮中；展開條件：將點(diǎn)好樣的硅膠薄層板置于展缸中展開20 min后，取出吹干，二次展開。取出吹干，于顯色劑中浸沒后取出，吹風(fēng)機(jī)加熱至顯色。

1.2.4 制備石斛寡糖小試和中試 小試(3 L)：稱取石斛多糖1 kg(含30%的酒精)加入PBS(或ddH2O)1.67 L，再加入0.33 L發(fā)酵粗酶液。中試(75 L)：在發(fā)酵罐中先加入30 L純凈水，預(yù)熱至45 ℃后，緩慢加入石斛多糖25 kg(含30%酒精)，從頂部分批次加入發(fā)酵粗酶液共6 L，再補(bǔ)足剩余的純凈水至總體積75 L，不斷從底物放出石斛多糖溶液再從頂部加入，啟動(dòng)攪拌器，轉(zhuǎn)速120 r/min，邊水解邊混合。

1.2.5 石斛寡糖的濃縮噴干與分離純化 納濾時(shí)納濾膜操作壓力為1.3 MPa，流量為2 L/min進(jìn)行濃縮過濾，以除去無機(jī)鹽、有機(jī)酸、硫化物和溶劑等小分子物質(zhì)，將75 L石斛多糖溶液濃縮至20 L。噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度(130±2) ℃，出風(fēng)溫度(80±2) ℃，進(jìn)料泵速50 mL/min，將紫皮石斛寡糖濃縮液噴霧干燥。分離純化采用硅膠柱層析，干法裝柱，洗脫劑為V正丁醇∶V冰乙酸∶V水=2∶1∶1；流速1 mL/min，洗脫方式為等度洗脫。

1.2.6 紫皮石斛寡糖單糖組成分析 樣品中加入終濃度為1 mol/L HCl，120 ℃水解0.5～1 h (水解液以黃棕色為宜)，調(diào)節(jié)pH值 4～7待用。待測(cè)樣品的衍生化標(biāo)記：取單糖對(duì)照品和樣品水溶液80 μL，分別置于1.5 mL EP 管中。加入0.25 mol/L 的PMP 甲醇溶液80 μL 和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液80 μL(調(diào)pH值為7.0)，渦旋30 s 后70 ℃水浴反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L 的鹽酸溶液80 μL 中和(調(diào)pH值為4.0～5.0)，渦旋30 s 后用0.5 mL 乙酸異戊酯萃取，渦旋3 min，離心，小心棄去上層有機(jī)層，再萃取1 次得下層水層，加0.5 mL 氯仿同法萃取2 次，取上層水層20 μL 進(jìn)行HPLC 分析。HPLC檢測(cè)試劑：① A組分：15%乙腈+85%KH2PO4(0.05 mol/L)pH=6.9;②B組分：40%乙腈+60%KH2PO4(0.05 mol/L)pH=6.9。HPLC檢測(cè)條件：① 0～20 min： A組分80%、B組分20%；② 20～28 min：A組分70%→60%、B組分30%→40%；③ 28～30 min：A組分80%、B組分20%。柱溫：30 ℃；波長(zhǎng)：250 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化與鑒定

石斛多糖提取后的石斛渣在儲(chǔ)藏過程中發(fā)現(xiàn)了一株橙黃色絲狀真菌，長(zhǎng)勢(shì)良好，有可能具有將石斛多糖轉(zhuǎn)化為石斛寡糖的活性。將該菌株接種于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，提取該菌株的基因組(圖1a)，PCR擴(kuò)增ITS(圖1b)后進(jìn)行測(cè)序，通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與粗糙脈孢菌的相似度高達(dá)100%，推測(cè)其為粗糙脈孢菌。電鏡結(jié)果顯示菌絲較長(zhǎng)且疏松，具隔膜、分枝，氣生菌絲頂部形成分枝鏈，著生眾多分生孢子 (圖1c)，與報(bào)道相一致[16]。

圖1 粗糙脈孢菌基因組、ITS擴(kuò)增及掃描電鏡下觀察Fig.1 Neurospora crassa genome, ITS amplification and observation under scanning electron microscopea：1:DL2000 Marker，2:粗糙脈孢菌基因組；b：1:DL2000 Marker,2:粗糙脈孢菌ITS擴(kuò)增；c：掃描電鏡下放大300倍的粗糙脈孢菌菌絲a：1:DL2000 Marker， 2:Neurospora crassa genome;b：1: DL2000 Marker，2: ITS amplification of Neurospora crassa; c：Neurospora crassa hyphae magnified 300 times under scanning electron microscope

2.2 液態(tài)發(fā)酵酶液蛋白濃度及酶活檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中定義酶活單位：1 μL酶液、1 min水解得到1 μg還原糖的酶量為一個(gè)酶活單位(U)，活力單位為1 U/μL或1 000 U/mL。對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白濃度和酶活進(jìn)行檢測(cè)，有助于后續(xù)對(duì)紫皮石斛多糖進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化發(fā)酵酶液的選擇。

根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2a和2b)，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白濃度和相應(yīng)的酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示(圖3a)粗糙脈孢菌液態(tài)發(fā)酵至第7 天蛋白濃度最高，達(dá)到1 542.5 μg/mL，其余時(shí)間段蛋白濃度也并未出現(xiàn)顯著的降低，均維持在1 400 μg/mL左右，可見粗糙脈孢菌從第3天至第10天菌體內(nèi)蛋白處于持續(xù)表達(dá)和分泌的狀態(tài)，這可能跟粗糙脈孢菌中具有豐富的酶系相關(guān)。酶活測(cè)定結(jié)果顯示(圖3b)第4天酶活最高，達(dá)到0.1 U/μL，第3天次之，為0.09 U/μL，5～10 d的酶活相對(duì)較低，均維持在0.06～0.08 U/μL之間。蛋白濃度與酶活并未呈現(xiàn)正相關(guān)，可能由于水解石斛多糖的甘露聚糖酶并未在蛋白濃度最高時(shí)出現(xiàn)最高表達(dá)，而是在第4天出現(xiàn)了最高的表達(dá)量。

圖2 BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 BSA standard curve and maltose standard curve a：BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線；b：麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線a: BSA standard curve; b: maltose standard curve

圖3 不同時(shí)間粗糙脈孢菌液態(tài)發(fā)酵蛋白濃度和酶活Fig.3 Protein concentration and enzyme activity of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times a：不同時(shí)間粗糙脈孢菌液態(tài)發(fā)酵蛋白濃度；b：不同時(shí)間粗糙脈孢菌液態(tài)發(fā)酵酶活a: Protein concentration of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times; b: Enzyme activity of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times

2.3 制備石斛寡糖的小試和中試

工業(yè)提取的紫皮石斛多糖中含有30%的酒精，為了驗(yàn)證酒精的存在是否會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響，首先選取粗糙脈孢菌發(fā)酵至第4天酶活最高的酶液進(jìn)行石斛多糖水解為石斛寡糖的小試，分別用PBS或ddH2O配制石斛多糖底物，觀察緩沖體系是否會(huì)對(duì)紫皮石斛多糖的酶解造成影響。結(jié)果顯示3 h時(shí)石斛多糖轉(zhuǎn)化為石斛寡糖較少(圖4a)，5 h和7 h時(shí)紫皮石斛多糖開始大量被酶解轉(zhuǎn)化(圖4b和4c)，24 h石斛多糖基本被轉(zhuǎn)化為石斛寡糖，與魔芋寡糖對(duì)照相比基本沒有差別(圖4d)，表明粗酶液的酶轉(zhuǎn)化效果較好，并且對(duì)30%的乙醇具有一定的耐受性。PBS和ddH2O分別配制石斛多糖底物對(duì)酶解效果也沒有影響。

圖4 TLC檢測(cè)不同時(shí)間粗糙脈孢菌發(fā)酵酶液水解紫皮石斛多糖Fig.4 TLC detection of hydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides by the fermentation enzyme liquid of Neurospora crassa a、b、c、d：分別為3、5 、7和24 h TLC檢測(cè)粗糙脈孢菌發(fā)酵酶液水解紫皮石斛多糖；1～4：麥芽二糖、三糖、四糖、六糖標(biāo)準(zhǔn)品；5：未水解石斛多糖；6：PBS溶解的石斛多糖；7：ddH2O溶解的石斛多糖；8：魔芋寡糖a, b, c, d: TLC detection of hydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides by the fermentation enzyme liquid of Neurospora crassa at 3, 5, 7 and 24 h; 1-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5: Unhydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides; 6: Dendrobium devonianum polysaccharides dissolved in PBS; 7: Dendrobium devonianum polysaccharides dissolved in ddH2O; 8: Konjac oligosaccharides

隨后對(duì)紫皮石斛多糖的酶轉(zhuǎn)化進(jìn)行中試，驗(yàn)證試驗(yàn)的可行性。在100 L發(fā)酵罐中添加75 L的反應(yīng)體系，酶轉(zhuǎn)化24 h后取樣品進(jìn)行TLC分析(圖5)，結(jié)果顯示與小試樣品相比(Lane 5)，中試的石斛多糖也基本酶解完全(Lane 6)，基本轉(zhuǎn)化為石斛寡糖，與魔芋寡糖(Lane 7)相比，寡糖種類較為豐富。

圖5 TLC分析小試和中試紫皮石斛寡糖樣品Fig.5 TLC analysis of small-scale and pilot-scale Dendrobium devonianum oligosaccharide samples1～4：麥芽二糖、三糖、四糖、六糖標(biāo)準(zhǔn)品；5：小試樣品；6：中試噴干樣品；7：魔芋寡糖1-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5: Small samples; 6: Pilot spray dried samples; 7: Konjac oligosaccharides

2.4 紫皮石斛寡糖的分離

通過硅膠柱層析色譜對(duì)獲得的紫皮石斛寡糖樣品進(jìn)行初步的分離，成功獲得了二糖至六糖的劃段組分，其中組分1得率5.75%，組分2得率5.65%，組分3得率7%，組分4得率4.3%，組分5得率5.6%。通過TLC分析不同組分石斛寡糖的類型，結(jié)果顯示，組分1(Lane 5)主要為麥芽二糖和三糖；組分2(Lane 6)主要為麥芽三糖和四糖；組分3(Lane 7)主要為麥芽四糖和六糖；組分4(Lane 8)主要為六糖，還有少量的五糖；組分5(Lane 9)主要為六糖(圖6)。

圖6 TLC分析紫皮石斛寡糖分離的各個(gè)組分Fig.6 TLC analysis of the individual components isolated from Dendrobium devonianum oligosaccharides1～4：麥芽二糖、三糖、四糖、六糖標(biāo)準(zhǔn)品；5～9：通過柱色譜分離得到的組分1、組分2、組分3、組分4、組分51-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5-9: Component 1, component 2, component 3, component 4, component 5 separated by column chromatography

2.5 石斛寡糖單糖組成分析

為了進(jìn)一步了解各組分中的單糖組成，以利于后續(xù)功能性石斛寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定，首先將樣品進(jìn)行酸水解，隨后進(jìn)行PMP衍生標(biāo)記，通過HPLC鑒定各組分的單糖組成。結(jié)果顯示(圖7)，組分1主要為甘露糖，還有葡萄糖或果糖；組分2至5主要為甘露糖，還有極少量的葡萄糖或果糖。這表明石斛寡糖主要是甘露低聚糖。甘露低聚糖作為新型的寡糖，在調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制肥胖和降低膽固醇等方面[17]均顯示出了較好的效果，預(yù)示著后續(xù)工作中能夠發(fā)現(xiàn)更多的功能性石斛寡糖。

圖7 HPLC分析各個(gè)組分的單糖組成Fig.7 HPLC analysis of the monosaccharide composition of each componenta:組分1；b：組分2；c：組分3；d：組分4；e：組分5a: Component 1; b: Component 2; c: Component 3; d: Component 4; e: Component 5

3 討 論

從石斛多糖提取后的石斛渣上分離得到一株能夠酶解石斛多糖的菌株，通過ITS序列和形態(tài)鑒定為粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)。對(duì)該菌株不同發(fā)酵時(shí)間段的蛋白含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其胞外蛋白含量始終較高，這可能與其具有豐富的酶系相關(guān)，有報(bào)道稱該菌株為天然的纖維素快速降解模式菌株，其蛋白的分泌能力與里氏木霉野生型菌株相仿[18]。通過酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的小試和中試制備了大量的紫皮石斛寡糖，也初步證明了該菌株酶系的豐富性。

單糖組成分析表明，紫皮石斛寡糖主要由甘露糖組成，含有少量的葡萄糖或果糖。在幾種常見的六碳糖當(dāng)中，只有甘露糖能有效的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]，并且甘露寡糖通過重塑腸道菌群，能顯著改善輕中度阿爾茨海默癥患者的認(rèn)知損傷[20]。一系列的證據(jù)表明，甘露寡糖作為一種新型的功能性低聚糖，在食品新原料開發(fā)當(dāng)中具有顯著的優(yōu)勢(shì)[21]。因此，將紫皮石斛多糖制備成功能性的低聚糖，將能有效地提高其利用率及附加值。

但是，暫不清楚粗糙脈孢菌中有哪些甘露聚糖酶參與了紫皮石斛多糖的酶轉(zhuǎn)化，其酶學(xué)性質(zhì)也有待研究。后續(xù)可以通過單一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異基因的表達(dá)，找到關(guān)鍵的甘露聚糖酶基因，異源表達(dá)后研究其酶學(xué)性質(zhì)。分離到的紫皮石斛寡糖有何結(jié)構(gòu)特征以及構(gòu)效關(guān)系都有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。