鄧立康， 劉佳昕， 劉曉峰， 吳又多， 程 馳， 薛 闖*

(1.國(guó)投生物能源(鐵嶺)有限公司，遼寧 鐵嶺 112700；2.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024)

化石燃料的持續(xù)使用引起了空氣中CO2濃度持續(xù)增加等一系列的環(huán)境問題，嚴(yán)重危害到全球的氣候。因此，尋找和開發(fā)綠色、清潔、低碳、環(huán)保的可再生能源迫在眉睫。習(xí)近平主席在第七十五屆聯(lián)合國(guó)大會(huì)一般性辯論上提出，中國(guó)“力爭(zhēng)于2030年前實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰，努力爭(zhēng)取2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和”的目標(biāo)，對(duì)能源轉(zhuǎn)型提出了迫切的要求。以生物乙醇、丁醇和己醇為代表的液體生物燃料，作為可再生能源及重要的生物基化學(xué)品，具有廣泛的應(yīng)用前景。到目前為止，生物乙醇是全球交通運(yùn)輸中使用最廣泛的生物燃料。丁醇是繼燃料乙醇之后又一個(gè)備受矚目的可再生生物燃料，其與汽油熱值相近(丁醇 29.2 MJ/L，汽油32 MJ/L)[1]，使其成為潛在的優(yōu)良的生物替代能源之一；丁醇在食品領(lǐng)域被廣泛用作溶劑，是有機(jī)合成的重要前體；己醇是一種高附加值中鏈醇，因其具有高能量密度、低水溶性和低揮發(fā)性等特點(diǎn)可與汽油混合作為燃料使用，近些年也越來越受到研究人員的廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥化工領(lǐng)域，己醇也是許多產(chǎn)品的重要前體原料[2]。生物煉制是近年來生產(chǎn)大宗化工產(chǎn)品的首選綠色可持續(xù)工藝。利用生物法生產(chǎn)乙醇、丁醇、己醇等生物基醇類化學(xué)品，其反應(yīng)條件溫和可控，有害副產(chǎn)物遠(yuǎn)低于化學(xué)合成[3]，有助于推動(dòng)能源轉(zhuǎn)型和碳中和目標(biāo)實(shí)現(xiàn)。合成氣是一種供化學(xué)合成用的原料氣，以CO2、CO和H2為主要組分。其原料來源廣泛，既可由化石燃料煤或焦炭等固體燃料氣化產(chǎn)生，也可由農(nóng)林廢棄物等生物質(zhì)通過氣化產(chǎn)生。以農(nóng)林廢棄物等生物質(zhì)為原料生產(chǎn)合成氣進(jìn)行醇類發(fā)酵的一般過程：首先將農(nóng)林廢棄物氣化轉(zhuǎn)化為以CO2、CO和H2為主要組分的合成氣，再通過化學(xué)催化和微生物發(fā)酵將合成氣轉(zhuǎn)化為燃料乙醇等液體燃料以及其他生物基醇類化合物和精細(xì)化學(xué)品等。相較于傳統(tǒng)的生物煉制工藝，以農(nóng)林生物質(zhì)、市政廢棄物為初始原料的合成氣進(jìn)行乙醇發(fā)酵不僅可以避開與糧食供應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)，而且還有效避開纖維原料酸、酶水解的技術(shù)障礙，并且克服了傳統(tǒng)生物轉(zhuǎn)化過程中木質(zhì)素不能被有效利用的缺陷，避免了糖酵解途徑中CO2的釋放，有效提高了碳原子的利用率，降低了原料成本，減少了發(fā)酵過程的CO2排放。與化學(xué)催化合成法相比，合成氣發(fā)酵具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物得率高，副產(chǎn)物少，對(duì)CO和H2比例要求不嚴(yán)格，以及對(duì)硫化物耐受性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。此外，氣化過程可將原料中所有組分轉(zhuǎn)化為以CO2、CO和H2為主要組分的合成氣，可消除原料之間的化學(xué)差異性，一些有毒或難降解的有機(jī)物也可通過氣化、發(fā)酵等過程，轉(zhuǎn)化為乙醇和其他有用化學(xué)品[4]。目前雖然基于合成氣轉(zhuǎn)化的生物基醇類化學(xué)品已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，但是其產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)強(qiáng)度不高，設(shè)備及生產(chǎn)過程成本較高，市場(chǎng)占有率還很低[5]。本文針對(duì)利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學(xué)品的研究現(xiàn)狀，從代謝途徑、菌株改造、發(fā)酵過程、合成氣成分氣液傳質(zhì)幾方面入手，討論了合成氣利用及醇類產(chǎn)物合成的研究現(xiàn)狀，并探討了存在的問題及未來的研究方向。

1 Wood-Ljungdahl途徑與產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機(jī)制

1.1 產(chǎn)乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑

產(chǎn)乙酸菌(Acetogen)，即可以通過Wood-Ljungdahl途徑(也稱為還原性乙酰輔酶A途徑，Reductive Acetyl-CoA Pathway)作為主要能量代謝機(jī)制，利用CO2合成乙酰輔酶A的嚴(yán)格厭氧菌[6]。在Wood-Ljungdahl途徑中，細(xì)胞利用還原力(H2, NAD(P)H, FdH2)將CO2還原成乙酰輔酶A(圖1)。Wood-Ljungdahl途徑可以分為甲基分支(Methyl Branch，也稱為Eastern Branch)和羰基分支(Carbonyl Branch，也稱為Western Branch)。在甲基分支中，CO2首先在甲酸脫氫酶(Formate Dehydrogenase, FDH)的作用下轉(zhuǎn)化為甲酸，然后在甲酰四氫呋喃合酶(Formyl-THF Synthase, FTHFS)、甲酰四氫呋喃環(huán)化水解酶(Formyl-THF Cyclohydrolase, FTC)、亞甲基四氫呋喃脫氫酶(Methylene-THF Dehydrogenase, MTDH)、亞甲基四氫呋喃還原酶(Methylene-THF Reductase, MTHFR)和轉(zhuǎn)甲基酶(Methyltransferase, MTF)的依次作用下，生成甲基-鈷鐵硫蛋白(Methyl-CoFeSP)。在羰基分支中，CO2在一氧化碳脫氫酶(CO Dehydrogenase, CODH)的作用下轉(zhuǎn)化為CO。甲基分支的產(chǎn)物甲基-鈷鐵硫蛋白與羰基分支的產(chǎn)物CO(或來自于合成氣的CO)在一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶(Acetyl-CoA synthase, ACS)復(fù)合體(CODH/ACS)的催化下，生成乙酰輔酶A[7]。乙酰輔酶A可以在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Phosphotransacetylase, PTA)以及乙酸激酶(Acetate Kinase, ACK)的催化下進(jìn)一步生成乙酸，或在醛/醇脫氫酶(Aldehyde/Alcohol Dehydrogenase, AdhE2)的作用下生成乙醇。乙酸也可以在醛:鐵氧還蛋白氧化還原酶(Aldehyde:ferredoxin Oxidoreductase, AOR)及醇脫氫酶(ADH)或AdhE2的催化下轉(zhuǎn)化為乙醇。乙酰輔酶A進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)可生成丁酰輔酶A、己酰輔酶A，繼而生成丁酸、丁醇、己酸、己醇等。合成醇類生物基化學(xué)品常用的產(chǎn)乙酸菌包括可以合成乙醇的楊氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)以及可以合成乙醇、丁醇、己醇的食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、克魯維梭菌(Clostridiumkluyveri)、ClostridiumragsdaleiP11等。

圖1 Wood-Ljungdahl途徑及其下游的乙醇、丁醇合成途徑Fig.1 The Wood-Ljungdahl pathway and ethanol and butanol synthesis pathwaysFDH: formate dehydrogenase(甲酸脫氫酶); FTHFS: formyl-THF synthase(甲酰四氫呋喃合酶); FTC: formyl-THF cyclohydrolase(甲酰四氫呋喃環(huán)水解酶); MTDH: methylene-THF dehydrogenase(亞甲基四氫呋喃脫氫酶); MTHFR: methylene-THF reductase(亞甲基四氫呋喃還原酶); MTF: methyltransferase(轉(zhuǎn)甲基酶); CODH: CO dehydrogenase(一氧化碳脫氫酶); ACS: acetyl-CoA synthase(乙酰輔酶A合酶); PTA: phosphotransacetylase(磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶); ACK: acetate kinase(乙酸激酶); PTB: phosphotransbutyrylase(磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶); BUK: butyrate kinase(丁酸激酶); AdhE2: aldehyde/alcohol dehydrogenase(醛/醇脫氫酶); AOR: aldehyde:ferredoxin oxidoreductase(醛:鐵氧還蛋白氧化還原酶); ADH: alcohol dehydrogenase(醇脫氫酶); HBD: hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase(羥基丁酰輔酶A脫氫酶); CRT: crotonase(烯酰水合酶); BCD: butyryl-CoA dehydrogenase(丁酰輔酶A脫氫酶)

1.2 產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機(jī)制

在Wood-Ljungdahl途徑的甲基分支中，每還原1 mol CO2，需要消耗1 mol ATP。在乙酰輔酶A或丁酰輔酶A合成乙酸或丁酸的過程中，每生成1 mol乙酸或丁酸，可以生成1 mol ATP；乙酰輔酶A或丁酰輔酶A生成乙醇或丁醇的過程中沒有ATP生成。因此，若產(chǎn)乙酸菌只能通過底物磷酸化合成ATP，則每固定CO2生成1 mol乙酸，ATP凈產(chǎn)量為0；每生成1 mol乙醇，ATP凈產(chǎn)量為-1 mol。為了保證細(xì)胞在生成醇類產(chǎn)物時(shí)能夠產(chǎn)生足量的ATP，產(chǎn)乙酸菌進(jìn)化出了特別的能量節(jié)約機(jī)制，一方面利用基于黃素的電子歧化(Flavin-based Electron Bifurcation, FBEB)，將電子傳遞過程中的放熱與吸熱氧化還原反應(yīng)偶聯(lián)[8]；另一方面將放熱反應(yīng)(在產(chǎn)乙酸菌中通常是電子傳遞反應(yīng))與質(zhì)子的跨膜傳遞偶聯(lián)，并利用跨膜質(zhì)子(H+)或鈉離子(Na+)濃度梯度產(chǎn)生ATP[9]。研究發(fā)現(xiàn)，綜合考慮到產(chǎn)乙酸菌通過底物磷酸化、電子歧化及跨膜質(zhì)子或梯度產(chǎn)生的ATP，在野生型自產(chǎn)乙醇梭菌中，生成1 mol乙酸的凈ATP產(chǎn)量為1 mol，生成1分子乙醇的凈ATP產(chǎn)量為0.5 mol(乙醇由乙酰輔酶A在AdhE2催化下生成)或1.2 mol(乙醇由乙酰輔酶A在PTA、ACK、AOR、ADH的依次催化下生成)[10]。目前只有少數(shù)產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機(jī)制被深入研究，主要包括楊氏梭菌、醋酸桿菌(Acetobacteriumwoodii)、熱醋酸莫氏菌(Moorellathermoacetica)、自產(chǎn)乙醇梭菌等[9]。產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機(jī)制可以根據(jù)形成跨膜濃度梯度的離子(H+或Na+)及跨膜離子轉(zhuǎn)移蛋白(Rnf復(fù)合物或Ech復(fù)合物)分為幾類：Rnf復(fù)合物驅(qū)動(dòng)質(zhì)子形成跨膜濃度梯度，Rnf復(fù)合物驅(qū)動(dòng)鈉離子形成跨膜濃度梯度，以及Ech復(fù)合物驅(qū)動(dòng)質(zhì)子形成跨膜濃度梯度。利用Ech復(fù)合物驅(qū)動(dòng)跨膜鈉離子濃度梯度的產(chǎn)乙酸菌尚未發(fā)現(xiàn)[9]。質(zhì)子或鈉離子形成濃度梯度后，可以由細(xì)胞膜上的ATP酶(ATPase)生成ATP。楊氏梭菌可以利用Rnf復(fù)合物形成跨膜質(zhì)子濃度梯度[11]。另外，推測(cè)楊氏梭菌中的氫酶(HydABC)或氫酶-甲酸脫氫酶復(fù)合物具有電子歧化功能；其MTDH的輔因子為NADH，MTHFR的輔因子仍不能確定[9]。醋酸桿菌則是利用Rnf復(fù)合物驅(qū)動(dòng)跨膜鈉離子濃度梯度的形成[12]，其氫酶具有電子歧化功能，可利用1 mol H2還原0.5 mol NAD+及0.5 mol 鐵氧還蛋白(Fd)[13]，它的MTDH及MTHFR的輔因子均為NADH[9]。熱醋酸莫氏菌利用Ech復(fù)合物驅(qū)動(dòng)跨膜質(zhì)子濃度梯度形成，除了具有電子歧化能力的氫酶外，推測(cè)其MTHFR也具有電子歧化能力，而其MTDH消耗的輔因子為NADPH[9,14]。另外，楊氏梭菌與熱醋酸莫氏菌中都發(fā)現(xiàn)了電子歧化型轉(zhuǎn)氫酶(Electron-bifurcating transhydrogenase, Nfn)，可利用1 mol NADH及1 mol 還原型鐵氧還蛋白(FdH2)提供的還原力還原2 mol NADP+[9]。盡管產(chǎn)乙酸菌進(jìn)化出了多種多樣的能量節(jié)約機(jī)制以適應(yīng)在合成氣中的生長(zhǎng)，自養(yǎng)生長(zhǎng)條件下，供能不足依然是限制細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的重要因素，而醇類產(chǎn)物能量密度較高，與利用合成氣生產(chǎn)有機(jī)酸相比，生產(chǎn)醇類產(chǎn)物難度較大，需要對(duì)發(fā)酵菌株及過程進(jìn)行深入的研究。

2 產(chǎn)乙酸菌的遺傳操作工具及代謝改造

2.1 產(chǎn)乙酸菌的遺傳操作工具

產(chǎn)乙酸菌大部分為革蘭陽性菌，細(xì)胞壁較厚，且具有復(fù)雜的限制修飾系統(tǒng)，限制了外源DNA的導(dǎo)入效率；另一方面，常用的遺傳操作技術(shù)如CRISPR/Cas、Red/ET等在產(chǎn)乙酸菌中缺乏深入研究。由于產(chǎn)乙酸菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低、代謝改造工具較匱乏，而開發(fā)產(chǎn)乙酸菌的基因操作工具是對(duì)其進(jìn)行代謝改造的先決條件。2013年，Leang等[15]探究了楊氏梭菌中可用的復(fù)制子，優(yōu)化了將質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入楊氏梭菌的條件，并通過雙交換同源重組(Double-crossover Homologous Recombination)刪除了fliA基因(CLJU_c10410，推測(cè)為與菌毛形成相關(guān)的σ因子)。2016年，Molitor等[16]進(jìn)一步優(yōu)化了楊氏梭菌電轉(zhuǎn)化的條件，探究了帶有不同復(fù)制子(pBP1、pCB102、pWV01ts、pIM13/pIMP1)的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入楊氏梭菌的效率差別，并構(gòu)建了可以在楊氏梭菌中使用的溫敏型質(zhì)粒。該研究還證明了商用的基于黃素單核苷酸的熒光蛋白(Flavin Mononucleotide-based Fluorescent Proteins, FbFPs)可以在楊氏梭菌中作為熒光報(bào)告系統(tǒng)。

近年來，CRISPR/Cas9、位點(diǎn)特異性重組等基因編輯工具也成功應(yīng)用于產(chǎn)乙酸菌。在楊氏梭菌中分別利用啟動(dòng)子Pthl和PAaraE啟動(dòng)Cas9蛋白和sgRNA的表達(dá)，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)pta、adhE1、ctf(編碼脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶Acyl-CoA Transferase)和pyrE(編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶Orotate Phosphoribosyltransferase)基因刪除的效率分別達(dá)到了100%、>75%、100% 和 >50%[17]。在自產(chǎn)乙醇梭菌中，Cas9蛋白的不受控表達(dá)嚴(yán)重降低了轉(zhuǎn)化效率。因此，Nagaraju 等[18]通過篩選和構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子文庫，選用合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控Cas9蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了該菌利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因刪除的效率>50%。Huang等[19]在楊氏梭菌中構(gòu)建了基于噬菌體絲氨酸重組酶的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，可以將來自丙酮丁醇梭菌的長(zhǎng)達(dá)8.5 kb的產(chǎn)丁酸途徑一次性整合到楊氏梭菌染色體上，實(shí)現(xiàn)了大片段DNA的快速整合。在楊氏梭菌中利用四環(huán)素阻遏啟動(dòng)子(Tetracycline Repressor Promoter)tetR-Ptet調(diào)控dCas9的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)CRISPRi介導(dǎo)的pta及aor2基因表達(dá)強(qiáng)度的降低[20]。類似地，F(xiàn)ackler等[21]在自產(chǎn)乙醇梭菌中利用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(IPL-12)啟動(dòng)dCas9的表達(dá)，成功將CRISPRi系統(tǒng)應(yīng)用于自產(chǎn)乙醇梭菌，并利用該系統(tǒng)分別降低了2,3丁二醇及異丙醇合成途徑基因的表達(dá)強(qiáng)度，證明了該系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)的效果。除常用的電轉(zhuǎn)化法外，研究人員還嘗試通過接合法將質(zhì)粒導(dǎo)入楊氏梭菌中，并通過誘導(dǎo)來自角蠅(Haematobiairritans)的轉(zhuǎn)移酶Himar1的表達(dá)，促進(jìn)同源重組。研究人員優(yōu)化了接合條件，包括接合培養(yǎng)基、菌液用量、具有不同甲基化能力的質(zhì)粒供體菌、質(zhì)粒的復(fù)制蛋白等。作為概念證明，研究人員利用木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)Himar1轉(zhuǎn)移酶，將來自丙酮丁醇梭菌的丙酮合成途徑導(dǎo)入楊氏梭菌中[22]。

2.2 產(chǎn)乙酸菌的代謝工程改造

一些研究嘗試通過改造產(chǎn)乙酸菌Wood-Ljungdahl途徑及溶劑合成途徑的相關(guān)基因提高其合成醇類產(chǎn)物的能力。野生的楊氏梭菌只能生產(chǎn)乙醇，無法生產(chǎn)丁醇。在楊氏梭菌中表達(dá)來自丙酮丁醇梭菌中的丁醇合成途徑后，在合成氣發(fā)酵中丁醇濃度最高達(dá)到0.15 g/L，但發(fā)酵后期丁醇被轉(zhuǎn)化為丁酸，發(fā)酵末期時(shí)丁醇質(zhì)量濃度降低到了<0.015 g/L[11]。通過在自產(chǎn)乙醇梭菌中刪除3個(gè)編碼CODH的基因(acsA、cooS1、cooS2)，研究人員發(fā)現(xiàn)cooS1和cooS2對(duì)于自養(yǎng)生長(zhǎng)不是必需的。當(dāng)菌株在含有H2和CO2的環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，刪除cooS1的菌株甚至表現(xiàn)出比野生菌更短的延滯期和更高的生長(zhǎng)速率[23]。同一個(gè)課題組[24]在自產(chǎn)乙醇梭菌中刪除了2個(gè)編碼AOR的基因，以及2個(gè)編碼AdhE2的基因,比較了改造菌株在CO、H2和CO2或果糖作為底物時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物形成的情況，證明了AOR對(duì)于自養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)的必要性，并發(fā)現(xiàn)敲除adhE可以將乙醇濃度提高180%，將副產(chǎn)物乙酸降低38%。另一項(xiàng)研究在食一氧化碳梭菌中過表達(dá)編碼AOR、AdhE2和鐵氧還蛋白:NAD+還原酶(Ferredoxin:NAD+Oxidoreductase, FNR)的基因。在合成氣發(fā)酵中，與野生型相比，過表達(dá)adhE2的菌株乙醇濃度提高約50%，而同時(shí)過表達(dá)adhE2和fnr的菌株丁醇與乙醇濃度分別提高約18%和22%，證明了通過過表達(dá)同源和異源基因在兩種不同途徑中增加醇產(chǎn)量的潛力[25]。除了直接改造產(chǎn)乙酸菌外，研究人員還嘗試了將Wood-Ljungdahl導(dǎo)入產(chǎn)溶劑梭菌中。在丙酮丁醇梭菌中表達(dá)來自于楊氏梭菌的和食一氧化碳梭菌的Wood-Ljungdahl途徑后，發(fā)現(xiàn)改造菌株可以進(jìn)行Wood-Ljungdahl途徑甲基分支和羰基分支的全部反應(yīng)；進(jìn)一步在該菌株中表達(dá)CODH/ACS復(fù)合體后,發(fā)現(xiàn)改造菌表現(xiàn)出了CODH和ACS的活性。但由于ACS或Wood-Ljungdahl途徑中其他蛋白的表達(dá)量較低，改造菌無法在發(fā)酵中將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A[26-27]。

相比于利用糖基及纖維素類底物生產(chǎn)生物基醇類化學(xué)品，目前改造產(chǎn)乙酸菌、提高其利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學(xué)品的研究仍需深入。開發(fā)更多高效的遺傳操作手段，解析其代謝關(guān)鍵酶(如AOR、AdhE2、CODH、FDH等)在自養(yǎng)條件下的表達(dá)強(qiáng)度及協(xié)同作用，深入探究產(chǎn)乙酸菌能量節(jié)約及電子傳遞的機(jī)制，對(duì)于構(gòu)建利用合成氣高效合成生物基醇類化學(xué)品具有重要的意義。

3 利用合成氣生產(chǎn)生物基醇的過程工程調(diào)控

3.1 溫度

大部分產(chǎn)乙酸菌的最適生長(zhǎng)溫度均為37 ℃，然而，研究普遍發(fā)現(xiàn)，37 ℃并不是最適合產(chǎn)乙酸菌合成生物基醇類的溫度。在食一氧化碳梭菌的最適生長(zhǎng)溫度37 ℃培養(yǎng)該菌時(shí)，菌株在對(duì)數(shù)期的快速生長(zhǎng)會(huì)造成大量有機(jī)酸的快速積累，其中，乙酸的大量積累可能會(huì)引起醇類產(chǎn)物合成減少。類似的現(xiàn)象在產(chǎn)溶劑梭菌中也經(jīng)常出現(xiàn)，被稱為“酸崩潰”(Acid Crash)。而在25 ℃時(shí)培養(yǎng)食一氧化碳梭菌可以避免酸崩潰，可顯著提高醇類產(chǎn)物的濃度。在37 ℃時(shí)，菌株利用合成氣生產(chǎn)了0.07 g/L乙醇及微量丁醇、己醇，而在25 ℃時(shí)產(chǎn)生了1.48 g/L乙醇，1.07 g/L丁醇，以及0.84 g/L 己醇[28]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)低溫(25 ℃)促進(jìn)食一氧化碳梭菌產(chǎn)物的碳鏈延長(zhǎng)[29]。Shen等[30-31]在連續(xù)兩項(xiàng)研究中考察了溫度對(duì)食一氧化碳梭菌生物基醇產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化沒有顯著提高長(zhǎng)鏈醇的合成，然而兩段溫度培養(yǎng)方法(37 ℃培養(yǎng)48 h后，25 ℃培養(yǎng)120 h)對(duì)于醇類產(chǎn)物，尤其是長(zhǎng)鏈醇(己醇和丁醇)的合成有顯著提高，且減少了細(xì)胞絮凝。最終醇類產(chǎn)物濃度為6.97 g/L，其中丁醇濃度為1.67 g/L，己醇濃度為1.33 g/L，而在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，丁醇和己醇濃度分別為0.45 g/L和0.02 g/L。

多項(xiàng)研究均表明盡管較低的培養(yǎng)溫度(25～33 ℃)會(huì)降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率，但更有利于醇類產(chǎn)物的合成。醇類產(chǎn)物普遍對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，通過增加細(xì)胞膜流動(dòng)性，引起細(xì)胞成分的泄露，常見的醇類產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的毒害作用從強(qiáng)到弱排序?yàn)榧捍?丁醇>乙醇[32]。低溫下細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，細(xì)胞對(duì)醇類及有機(jī)酸的耐受性增強(qiáng)，且相比于短鏈醇(乙醇)，低溫發(fā)酵對(duì)于丁醇及己醇的合成更為有利。低溫對(duì)于長(zhǎng)鏈醇合成的優(yōu)勢(shì)也與細(xì)胞的基因表達(dá)水平有關(guān)。37 ℃時(shí)，Wood-Ljungdahl途徑基因的表達(dá)較高，促進(jìn)合成氣的利用和細(xì)胞生長(zhǎng)；但25 ℃提高了?；s合反應(yīng)(Acyl-condensation Reaction)相關(guān)基因的表達(dá)，更多的碳原子流向C4、C6產(chǎn)物[31]。

3.2 pH

與溫度對(duì)發(fā)酵的影響類似，最適合產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)的pH通常不是最適合產(chǎn)醇的pH。對(duì)于食一氧化碳梭菌，較高的培養(yǎng)pH(6.2)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但在此條件下細(xì)胞只合成有機(jī)酸，沒有醇類產(chǎn)物生成[33]。另一項(xiàng)研究[34]對(duì)比了5.75及4.75兩種發(fā)酵pH，發(fā)現(xiàn)最大的細(xì)胞生長(zhǎng)速率可以在較高的pH(5.75)條件下獲得(0.072 vs. 0.005 7/h)，最大的醇類比生產(chǎn)速率可以在較低的pH(4.75)時(shí)獲得，然而，低pH條件下的醇類濃度卻低于高pH下的醇類產(chǎn)物濃度。該研究結(jié)果說明，低pH時(shí)單位細(xì)胞合成醇類產(chǎn)物的能力較強(qiáng)，但持續(xù)的低pH培養(yǎng)不利于積累細(xì)胞量，導(dǎo)致最終的醇類產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)強(qiáng)度較低。

多項(xiàng)研究采取了多階段pH控制的方式，利用較高的pH促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，利用較低的pH促進(jìn)醇類產(chǎn)物的合成。例如，Richter等[35]采用兩階段pH控制法進(jìn)行楊氏梭菌的合成氣發(fā)酵，首先在 1 L 的攪拌釜反應(yīng)器中將pH控制在5.5左右，該條件有利于菌株生長(zhǎng)及乙酸合成；然后在4 L的鼓泡式反應(yīng)器中進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，該鼓泡式反應(yīng)器控制較低的pH (4.5～4.7)，并帶有氣體循環(huán)裝置及細(xì)胞循環(huán)模塊，在保留細(xì)胞量的同時(shí)，提高氣液接觸面及氣體的停留時(shí)間，該研究最終獲得了20.7 g/L 乙醇，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.37 g/(L·h)。另一項(xiàng)研究將自產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵在高pH(5.75)與低pH(4.75)之間循環(huán)變化[36]，獲得了7.14 g/L乙醇和1.621 g/L 2,3-丁二醇。類似地，將兩個(gè)攪拌釜反應(yīng)器串聯(lián)，pH分別維持在6(促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)酸)及5(促進(jìn)產(chǎn)溶劑)進(jìn)行食一氧化碳梭菌的合成氣發(fā)酵，最終獲得了1.5 g/L醇類產(chǎn)物[37]。利用含有克魯維梭菌、ClostridiumragsdaleiP11等產(chǎn)乙酸菌的混合菌群進(jìn)行合成氣發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)pH是碳鏈延長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，己醇只在培養(yǎng)pH 4.5～5之間才能被合成。在pH 4.8時(shí)，C6產(chǎn)物(0.8 g/L)及醇類產(chǎn)物(乙醇1.7 g/L、丁醇1.1 g/L、己醇0.6 g/L)達(dá)到最大[38]。

3.3 金屬離子

在利用合成氣生產(chǎn)生物基化學(xué)品的過程中，合成氣是唯一的碳源及能量來源，而固定合成氣的Wood-Ljungdahl途徑中的多種金屬酶的活性受到金屬離子(如Fe2+、WO2-、Ni2+等)的顯著影響，因此，金屬離子的成分及濃度對(duì)利用合成氣生產(chǎn)醇類生物基化學(xué)品有顯著影響。Saxena等[39]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中去除鎳后，細(xì)胞無法生長(zhǎng)。與ATCC (American Type Culture Collection) 1754標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比，優(yōu)化鎳濃度后的培養(yǎng)基使菌株的生長(zhǎng)速率從0.34/d提高到0.49/d，CODH活性及氫化酶(Hydrogenase, H2ase)的特定活性從38.45和0.35 U/mg分別提高到48.5和1.66 U/mg蛋白。在培養(yǎng)基中去除WO4-則使乙醇濃度從35.7 mmol/L降低到1.14 mmol/L，使FDH的活性從45.4 U/mg降低到8.79 U/mg蛋白；相反，采用10倍于ATCC 1754標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的WO4-濃度時(shí)，乙醇濃度提高到了72.29 mmol/L。在培養(yǎng)基中添加10倍濃度的Zn2+，可以使乙醇濃度顯著提高到187.80 mmol/L，然而CODH, FDH, H2ase和ADH的活性沒有受到明顯的影響。培養(yǎng)基中去除Fe2+顯著降低了CODH、FDH、H2ase和ADH的活性，并使乙醇濃度從35.7 mmol/L降低到6.3 mmol/L。另一項(xiàng)研究利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，系統(tǒng)探究了多種金屬離子對(duì)于食一氧化碳梭菌合成醇類產(chǎn)物的影響，并確定最優(yōu)的金屬離子濃度(相對(duì)于ATCC 1754標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)：5倍的Ni2+、Co2+、SeO4-、WO4-；3.48倍的Cu2+；0.55倍的MoO4-；0.5倍的Zn2+與(NH4)2SO4·FeSO4·6H2O；以及額外添加44.32 μmol/L的FeCl3·6H2O。該研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于醇類產(chǎn)物的濃度，MoO4-表現(xiàn)出最明顯的負(fù)面影響，猜測(cè)原因是鉬可以在含鎢蛋白的活性位點(diǎn)中取代鎢并抑制蛋白獲取鎢，降低含鎢蛋白的活性。Wood-Ljungdahl途徑中的關(guān)鍵蛋白FDH，以及有機(jī)酸重吸收的關(guān)鍵蛋白AOR中具有含鎢的活性位點(diǎn)，造成了鉬元素對(duì)于醇類產(chǎn)物濃度的負(fù)面影響[30]。其他研究也發(fā)現(xiàn)鎳和鐵對(duì)于食一氧化碳梭菌在合成氣中的生長(zhǎng)是必需的，而僅僅55 μg/L的鉬就足以對(duì)Wood-Ljungdahl途徑、丁醇合成及有機(jī)酸重吸收途徑產(chǎn)生抑制作用[40]。

3.4 有機(jī)氮源

有機(jī)氮源是影響利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學(xué)品的重要因素。Park等[41]探究了幾種培養(yǎng)基成分(酵母提取物、微量元素溶液、微生物溶液，以及Na2S·9H2O)對(duì)自產(chǎn)乙醇梭菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母提取物是影響最大的成分。將酵母提取物的質(zhì)量濃度從0.5 g/L提高到5 g/L，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)提高2.3倍。Abubackar等[42]通過二水平完全要因?qū)嶒?yàn)(Two-level Full Factorial Design)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于自產(chǎn)乙醇梭菌利用CO的發(fā)酵，將pH從5.75降低到4.75，并將酵母提取物質(zhì)量濃度從1.6 g/L降低到0.6 g/L，可以使乙醇產(chǎn)量提高200%?；贏TCC 2713培養(yǎng)基成分，優(yōu)化可得最適于食一氧化碳梭菌細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基成分，含有胰蛋白胨14 g/L ，酵母提取物9 g/L， L-精氨酸1.4 g/L，以及一種最適于該菌合成醇類產(chǎn)物的培養(yǎng)基，含有胰蛋白胨12 g/L，來自明膠的蛋白胨12 g/L，酵母提取物7 g/L，L-精氨酸1.4 g/L，葡萄糖1 g/L。在72 h的合成氣發(fā)酵中，采用最適合醇類產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，獲得了2.28 g/L乙醇及0.74 g/L丁醇[43]。使用來自生物質(zhì)的廉價(jià)有機(jī)氮源，可以在不顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)降低培養(yǎng)基的成本。采用0.5 g/L玉米浸出液(Corn Steep Liquor)，麥芽提取物(Malt Extract)及蔬菜提取物分別作為自產(chǎn)乙醇梭菌合成氣發(fā)酵的氮源，細(xì)胞的OD600值分別為1.44、1.37、1.71，乙醇質(zhì)量濃度分別為2.24、3.37、3.76 g/L[44]。采用玉米漿(Corn Syrup)或乳清粉(Whey Powder)代替微量元素及酵母提取物培養(yǎng)楊氏梭菌，發(fā)現(xiàn)使用30 g/L乳清粉時(shí)乙醇質(zhì)量濃度最大，達(dá)到2.5 g/L[45]。

3.5 硝酸鹽

3.6 其他培養(yǎng)基成分

由于產(chǎn)乙酸菌中的AOR蛋白可以在CO或H2的存在下將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇，在反應(yīng)體系中添加乙酸可以提高相應(yīng)醇類產(chǎn)物的產(chǎn)量。在不同的乙酸濃度下，食一氧化碳梭菌中差異表達(dá)的基因主要包括顯著下調(diào)的pta和顯著上調(diào)的aor、COdh和adh。其中pta是乙酸合成途徑的關(guān)鍵基因，而aor、COdh與adh則在乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇過程中起到重要的作用[48]。

Kim等[49]嘗試在發(fā)酵體系中加入不同的納米粒，發(fā)現(xiàn)0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的二氧化硅納米粒在促進(jìn)氣液傳遞方面表現(xiàn)出最好的效果，使溶解的CO、CO2和H2濃度分別提高了272.9%、200.2%和156.1%，使細(xì)胞量提高了34.5%，丁醇濃度提高166.1%。

4 合成氣成分及氣液傳質(zhì)效率

由于合成氣是發(fā)酵中唯一的碳源，合成氣與液體的傳質(zhì)速率以及合成氣的組成對(duì)于發(fā)酵有著極其重要的影響。然而，不同研究中經(jīng)常使用不同組成及來源的合成氣，并在發(fā)酵中采用不同的氣體壓力，以及傳質(zhì)系數(shù)迥異的發(fā)酵設(shè)備，導(dǎo)致不同研究間的產(chǎn)物濃度難以進(jìn)行橫向比較。從代謝途徑上來說，1 mol CO可以比1 mol H2提供更多的還原型鐵氧還蛋白，有助于還原性產(chǎn)物的合成；但是實(shí)際發(fā)酵中，由于不同微生物CODH及H2ase的活性不同，有些菌株在H2含量較高的合成氣中反而醇類產(chǎn)物產(chǎn)量更高。例如，Valgepea等[50]，將合成氣中H2/CO比例從0.4提高到3，自產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵的乙醇通量從25%提高到61%，乙酸通量從27%降低到15%。Jack等[51]探究了H2/CO比例從0.5到2.0范圍內(nèi)楊氏梭菌發(fā)酵產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)H2/CO比例為2.0時(shí)乙酸產(chǎn)量最高，為2.11 g/L；H2/CO比例為0.5時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高，為0.35 g/L。另一項(xiàng)研究[52]發(fā)現(xiàn)，楊氏梭菌在pH為6.0、氣壓為0.1 MPa時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，在氣體組成為H2/CO2時(shí)，主要產(chǎn)物為乙酸；而當(dāng)采用CO氣體時(shí)，可以合成乙醇，CODH和AOR在CO利用和乙醇合成中起到重要作用?？傊?，合成氣成分對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物有重要的影響，然而在不同的培養(yǎng)基、不同的氣壓等發(fā)酵條件下，難以斷言合成氣中各組分對(duì)于產(chǎn)物的影響。

在實(shí)際生產(chǎn)中，合成氣的成分通常是確定的，因此實(shí)際生產(chǎn)中更關(guān)鍵的問題是通過優(yōu)化發(fā)酵裝置，提高體積傳質(zhì)系數(shù)(Volumetric Mass Transfer Coefficient, kLa)及氣液傳質(zhì)效率。Xu等[53]提出可以使用氣體采樣袋作為自產(chǎn)乙醇梭菌合成氣發(fā)酵的培養(yǎng)裝置。氣體采樣袋可以在維持密閉的同時(shí)提高氣液接觸面積、提高傳質(zhì)效果，是一種廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便的氣體培養(yǎng)裝置。Shen等[54]設(shè)計(jì)了單片生物膜反應(yīng)器(Monolithic Biofilm Reactor, MBR)，由于MBR通道中形成了彈狀流模式(Slug Flow Pattern)，MBR的體積傳質(zhì)系數(shù)kLa高于作為對(duì)照的鼓泡式反應(yīng)器(Bubble Column Reactor, BCR)。在合成氣流速為300 mL/min，液體流速為500 mL/min，稀釋速率為 0.48/d的條件下，MBR中的食一氧化碳梭菌合成了4.89 g/L乙醇，比BCR反應(yīng)器高52.8%。Shen等[55]進(jìn)一步開發(fā)了中空纖維膜反應(yīng)器(Hollow Fiber Membrane Reactor, HFM Reactor)，在此反應(yīng)器中體積傳質(zhì)系數(shù)進(jìn)一步提升至1 096.2/h，高于大部分已報(bào)道的反應(yīng)器設(shè)計(jì)。在HFM反應(yīng)器中進(jìn)行食一氧化碳梭菌的合成氣發(fā)酵，乙醇質(zhì)量濃度可達(dá)23.93 g/L，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高濃度。由此可見，提高反應(yīng)器的傳質(zhì)系數(shù)、優(yōu)化反應(yīng)器設(shè)計(jì)，對(duì)于提高醇類產(chǎn)物的濃度具有重要意義。

5 展 望

利用合成氣生產(chǎn)乙醇、丁醇、己醇等醇類生物基化學(xué)品，對(duì)于推動(dòng)能源綠色低碳轉(zhuǎn)型、促進(jìn)“碳中和”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)具有重要意義。近年來，在產(chǎn)乙酸菌遺傳轉(zhuǎn)化工具的開發(fā)方面取得了大量進(jìn)展，也有一些研究嘗試了對(duì)產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行代謝工程改造。然而，產(chǎn)乙酸菌中的基因編輯效率仍不夠高，大部分研究只進(jìn)行了產(chǎn)乙酸菌中的單基因或雙基因敲除，所研究的菌株與基因較為零散，菌株生產(chǎn)能力不能滿足工業(yè)化要求。為了深入解析產(chǎn)乙酸菌中利用合成氣生產(chǎn)醇類產(chǎn)物的關(guān)鍵基因、構(gòu)建高效利用合成氣生產(chǎn)醇類生物基化學(xué)品的菌株，需要提高產(chǎn)乙酸菌的基因編輯效率，開發(fā)高通量基因編輯手段，利用多組學(xué)技術(shù)解析產(chǎn)乙酸菌CO2利用、能量節(jié)約、產(chǎn)物合成等相關(guān)途徑的調(diào)控機(jī)制。另外，可以嘗試在模式菌株(如丙酮丁醇梭菌、大腸埃希菌等)中構(gòu)建合成氣利用途徑，表達(dá)Wood-Ljungdahl途徑及能量節(jié)約相關(guān)基因(如Rnf復(fù)合物基因、電子歧化型轉(zhuǎn)氫酶基因等)，優(yōu)化各基因表達(dá)強(qiáng)度及輔因子平衡，使模式菌株具備利用合成氣的能力。

發(fā)酵條件及反應(yīng)器的優(yōu)化對(duì)于提高醇類生物基化學(xué)品的濃度、生產(chǎn)強(qiáng)度與產(chǎn)物選擇性十分有效。某些調(diào)控手段(如加入大量有機(jī)氮源、采用較高的氣體壓力等)在工業(yè)應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)。未來的過程調(diào)控研究應(yīng)集中于實(shí)現(xiàn)低成本、低能耗、較低氣壓下醇類產(chǎn)物的高效合成。一方面，優(yōu)化溫度、pH及反應(yīng)器設(shè)計(jì)是相對(duì)而言簡(jiǎn)單有效、廉價(jià)且低能耗的調(diào)控方案；此外，應(yīng)嘗試?yán)昧畠r(jià)培養(yǎng)基成分代替高價(jià)成分，降低發(fā)酵成本，促進(jìn)該過程的工業(yè)化。