向雄，廖林鋒，王敏，高立，任嬌艷

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

腸道菌群與機(jī)體免疫功能和健康密切相關(guān)，其能夠通過與腸黏膜緊密結(jié)合構(gòu)成腸道的生物屏障，從而有效抵御病原菌、病毒等的入侵[1]。腸道菌群還具有為機(jī)體提供營養(yǎng)、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)控腸道上皮發(fā)育和誘導(dǎo)先天性免疫等作用[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)包括消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)在內(nèi)的許多疾病與腸道菌群失調(diào)相關(guān)。因此，維持腸道微生態(tài)平衡對于維持機(jī)體健康具有非常重要的意義[3]。近年來，已有許多研究者在積極尋找可調(diào)節(jié)腸道菌群的“益生元”。益生元是一類在腸道中能夠選擇性地刺激腸道益生菌生長的活性物質(zhì)，可對宿主健康產(chǎn)生有益的影響。目前益生元的種類很多，例如功能性低聚糖類、多糖類、多元醇及蛋白質(zhì)水解物等[4]。與其他益生元物質(zhì)相比，蛋白水解物除了可為腸道菌群提供氨基酸類必需營養(yǎng)物質(zhì)，其中的多肽類活性物質(zhì)還可直接作用于腸道菌群，對其生理活性產(chǎn)生影響[5]。有研究指出，以昆蟲蛋白經(jīng)水解后形成的小分子肽和氨基酸作為氮源，對于微生物而言，是極具價值的營養(yǎng)源[6]，尤其是對于依賴外源性氨基酸的細(xì)菌比如雙歧桿菌等起著重要的生長促進(jìn)作用。

竹蟲（Chilo frusciden-talis Hampson）是螟蛾科（Pyralidae）禾草螟屬（Chilo）的一類昆蟲，主要寄生在巨竹屬的竹筒內(nèi)，其作為可食用昆蟲在我國有著悠久的歷史。竹蟲是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白質(zhì)來源，經(jīng)分析，竹蟲的粗蛋白含量為30%～40%，氨基酸含量為29%，其含有的8種必需氨基酸，占氨基酸總量的35.4%[7]，且其必需氨基酸與非必需氨基酸的比值達(dá)到世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出的理想蛋白質(zhì)的要求[8]。目前，竹蟲蛋白的益生活性尚未見報道。這表明竹蟲作為一種高蛋白質(zhì)、高氨基酸含量的昆蟲，探究其蛋白質(zhì)水解物的益生活性對開發(fā)利用竹蟲資源具有非常重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)酶解物的活性易受到酶解條件變化的影響。不同的蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，使酶解后得到的多肽以及氨基酸比例不同，從而導(dǎo)致水解產(chǎn)物的作用也存在差異。因此，需要考慮到竹蟲蛋白的酶解條件，例如蛋白酶種類以及酶解時間等，對其益生活性的影響。因此，本研究考察了堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶3種常用的水解酶在不同酶解時間下制備的竹蟲酶解液對植物乳桿菌LP45（Lactobacillus plantarum LP45，LP45）、鼠李糖乳桿菌 GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）、乳雙歧桿菌 Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8，M8） 及兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidobacteria）4株腸道益生菌的促增殖作用，以期為竹蟲的開發(fā)利用及潛在的益生活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益生菌植物乳桿菌LP45（LP45，編號YMC1005）、乳雙歧桿菌 Probio-M8（M8）、鼠李糖乳桿菌 GG（LGG）及兩歧雙歧桿菌：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；竹蟲：市售；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶：浙江中牧藥業(yè)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

打漿機(jī)（JYL-C022E）：九陽電器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：常州澳華儀器有限公司；八孔消化爐（型號 HYP-308）、自動定氮儀（KND-103F）：上海纖檢儀器有限公司；冷凍離心機(jī)（SCIENTZ-12N）：寧波

1.3.3 竹蟲蛋白酶解液對益生菌生長增殖的影響

1.3.3.1 益生菌的培養(yǎng)

將益生菌LP45、M8、LGG及兩歧雙歧桿菌菌種凍干粉接入到無菌的乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基MRS的液體培養(yǎng)基中，于37℃活化24 h，繼代培養(yǎng)3代，菌種活力恢復(fù)后用于后續(xù)試驗(yàn)。對菌液進(jìn)行梯度稀釋，得到10-1～10-7稀釋梯度，分別吸取 200 μL 的 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液，均勻涂布于MRS固體平板中，并在37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38 h～72 h。挑取形態(tài)、大小、顏色不同的單克隆接種于液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，作為種子液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3.2 竹蟲蛋白酶解液促益生菌生長增殖的試驗(yàn)

采用凱氏定氮法測定蛋白胨中的蛋白質(zhì)含量，以竹蟲蛋白酶解液中蛋白質(zhì)等量替換原MRS培養(yǎng)基中蛋白胨的蛋白質(zhì)為原則，配制含竹蟲蛋白酶解液的益生菌培養(yǎng)基。同時，設(shè)置兩種對照培養(yǎng)基（空白對照組：無蛋白胨的MRS培養(yǎng)基；MRS對照組：含蛋白胨的MRS培養(yǎng)基），以無菌水等量代替竹蟲酶解液做空白對照。培養(yǎng)基均經(jīng)0.22 μm的水系無菌濾頭過濾，置于4℃冷藏備用，試驗(yàn)前于37℃預(yù)熱10 min。

竹蟲蛋白酶解液對益生菌的增殖試驗(yàn)參考文新芝生物科技股份有限公司；全功能微孔板檢測酶標(biāo)儀（Synergy H1）：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 竹蟲蛋白酶解液的制備

新鮮的竹蟲原料打漿成肉糜，在50℃烘箱中烘干。再利用蒸餾水配制0.1 g/mL的竹蟲肉糜水溶液，超聲預(yù)處理10 min，50℃水浴30 min。酶解條件為酶與底物質(zhì)量比1∶100、pH7.0、溫度55℃，分別添加堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶并分別酶解2 h和4 h。其中，各種蛋白酶預(yù)先于50℃水浴中活化5 min，添加為竹蟲肉糜底物蛋白含量的1%，在酶解過程中監(jiān)測pH值的變化。酶解結(jié)束后，樣品在100℃下沸水浴滅酶10 min。將樣品在4℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，除去油層收集上清酶解液，獲得6種不同酶解條件下的竹蟲蛋白酶解液（堿性蛋白酶2-h、胰蛋白酶2-h、木瓜蛋白酶2-h、堿性蛋白酶4-h、胰蛋白酶4-h、木瓜蛋白酶4-h），于4℃冷藏備用。

1.3.2 竹蟲蛋白酶解液的蛋白回收率測定

采用凱氏定氮法[9]測定竹蟲在不同酶解條件下制備的酶解液中蛋白質(zhì)含量。并按照以下公式計(jì)算蛋白回收率。獻(xiàn)[10]的方法，并稍作修改。37℃過夜培養(yǎng)的4種益生菌種子液以1%的比例接種于上述培養(yǎng)基中，充分混合均勻后以150 μL/孔的量轉(zhuǎn)移至無菌的96孔板中，每個樣品設(shè)置4個復(fù)孔，轉(zhuǎn)移完畢后加蓋并用封口膜密封蓋板連接處，放置于酶標(biāo)儀中，在37℃、208 r/min條件下以雙軌道連續(xù)振板方式，動力學(xué)監(jiān)測20 h各培養(yǎng)基益生菌的生長情況，每15 min讀數(shù)菌懸液在600 nm處的吸光度（OD600）。檢測完畢后，作出益生菌在各個培養(yǎng)基中的生長曲線，依次選取起始時間點(diǎn)與終止時間點(diǎn)，以lnOD600與時間T擬合直線，取所擬合R2值最接近于1的時間段作為益生菌的對數(shù)期，按照公式計(jì)算代時（generation time，GT），即益生菌數(shù)量倍增所需的時間。

式中：K為lnOD600與時間T擬合直線的斜率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用IBM SPSS Statistics（Version 20）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素（One way-ANOVA）方差分析，并以不同字母代表數(shù)據(jù)之間有顯著性差異（p＜0.05）。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖，并用Adobe Illustrator CC2019軟件進(jìn)行排版展示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶解工藝對竹蟲蛋白酶解液pH值的變化及蛋白回收率的影響

竹蟲原料經(jīng)凱氏定氮法測得其蛋白質(zhì)含量為（30±1.42）%，該結(jié)果與文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果一致，表明其可作為食源性活性多肽的良好來源。已有研究表明pH值對蛋白酶的酶解活性影響較大[12]。因此，在本研究的酶解過程中，每隔1 h測定酶解液的pH值，其變化如圖1所示。

圖1 不同酶解工藝制備竹蟲蛋白酶解液過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH value of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson under different preparation conditions

在不同的酶解工藝條件下，隨著酶解反應(yīng)的有序進(jìn)行，酶解液的pH值在酶解過程中隨著酶解時間的增加而逐漸下降。酶解過程中pH值下降的原因之一在于：在蛋白酶的作用下，竹蟲蛋白的肽鍵斷裂，分解形成—COOH及—NH2，而—COOH在溶液中發(fā)生解離產(chǎn)生H+。由圖1可知，酶解過程中pH值的下降幅度不大，對蛋白酶活性影響較小。因此，在酶解過程中可不調(diào)節(jié)各組酶解液的pH值。

不同工藝條件下的竹蟲蛋白酶解液蛋白質(zhì)回收率如圖2所示。

圖2 不同酶解工藝制備竹蟲蛋白酶解液過程中的蛋白回收率Fig.2 Protein recovery rates of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson under different preparation conditions

由圖2可知，經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備的酶解液蛋白回收率顯著高于其余兩種蛋白酶，而且經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備的酶解液竹蟲蛋白回收率隨酶解時間的延長顯著增加（p＜0.05）；經(jīng)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備的酶解液蛋白回收率無顯著性差異（p＞0.05），且與酶解時間無關(guān)。

2.2 竹蟲蛋白酶解液對益生菌體外促增殖作用的研究

2.2.1 竹蟲蛋白酶解液對LGG的促增殖作用

竹蟲蛋白酶解液對LGG的促增殖作用如圖3所示。

圖3 竹蟲蛋白酶解液對LGG的促增殖作用Fig.3 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Lactobacillus rhamnosus

由圖3A、B可知，在培養(yǎng)過程中，MRS對照組菌懸液OD600值與空白對照組之間無顯著性差異，但各試驗(yàn)組的OD600值顯著高于MRS對照組和空白對照組，其中胰蛋白酶-2h試驗(yàn)組OD600值最高，表示LGG數(shù)量最多。竹蟲蛋白酶解液的促LGG增殖作用，可能與竹蟲中高谷氨酸含量密切相關(guān)。此外，經(jīng)3種蛋白酶酶解的竹蟲蛋白酶解液試驗(yàn)組隨著酶解時間的增加其菌懸液OD600值無顯著性變化。上述結(jié)果表明，竹蟲蛋白酶解液促LGG增殖作用與酶種類密切相關(guān)，而酶解時間對其影響不大。由圖3C可知，各試驗(yàn)組的竹蟲蛋白酶解液可顯著地縮短LGG增殖一倍所需要的時間，其中竹蟲蛋白胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液效果較好。

2.2.2 竹蟲蛋白酶解液對LP45的促增殖作用

竹蟲蛋白酶解液對LP45的促增殖作用見圖4。

圖4 竹蟲蛋白酶解液對LP45的促增殖作用Fig.4 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Lactobacillus plantarum LP45

從圖4A的生長曲線可看出，從培養(yǎng)2 h開始，各試驗(yàn)組菌懸液的OD600值明顯高于對照組；進(jìn)一步分析培養(yǎng)20 h后（圖4B），各試驗(yàn)組的OD600值顯著高于MRS對照組和空白對照組，其中相同酶解時間竹蟲蛋白的堿性蛋白酶水解液組的OD600值最高，表示LP45的數(shù)量最多。這是由于竹蟲蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，酶解液中的氮含量最高，可為LP45生長提供豐富的氮源。由圖4C可知，與對照組相比，各竹蟲蛋白酶解液試驗(yàn)組益生菌的代時顯著減小。上述結(jié)果表明，與蛋白胨相比，竹蟲蛋白酶解液可顯著促進(jìn)LP45增殖，其中竹蟲蛋白堿性蛋白酶水解液效果最佳。

2.2.3 竹蟲蛋白酶解液對M8的促增殖作用

竹蟲蛋白酶解液對M8的促增殖作用結(jié)果如圖5所示。

圖5 竹蟲蛋白酶解液對M8的促增殖作用Fig.5 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Bifidobacterium lactis Probio-M8

由圖5A、5B可知，與空白對照組和MRS對照組相比，各試驗(yàn)組無明顯促進(jìn)M8增殖的作用。但是，根據(jù)代時計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5C），各試驗(yàn)組可顯著縮短M8復(fù)制一代所需要的時間。上述結(jié)果表明，竹蟲蛋白酶解液可縮短M8的增殖時間，但未增加其數(shù)量。由圖5A可看出，4 h～12 h，試驗(yàn)組M8數(shù)量明顯高于MRS對照組，但在20 h時結(jié)果顯示其數(shù)量未增加，推測是由于菌落密度較大以及培養(yǎng)皿環(huán)境導(dǎo)致后期菌落生長受限造成。代時減小促進(jìn)增殖的機(jī)理可能與竹蟲中含有豐富的維生素以及鉀、鈣、鐵、錳等礦物元素相關(guān)[7]，其中錳等金屬離子不僅可促進(jìn)雙歧桿菌細(xì)胞壁的合成，還是激活雙歧桿菌糖苷酶的主要成分[13]。

2.2.4 竹蟲蛋白酶解液對兩歧雙歧桿菌的促增殖作用

竹蟲蛋白酶解液對兩歧雙歧桿菌的促增殖作用結(jié)果見圖6。

圖6 竹蟲蛋白酶解液對兩歧雙歧桿菌的促增殖作用Fig.6 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Bifidobacterium bifidum

從圖6A的兩歧雙歧桿菌生長曲線可看出，在兩歧雙歧桿菌生長過程中各試驗(yàn)組的菌懸液OD600值明顯高于MRS對照組和空白對照組，表明其可促進(jìn)兩歧雙歧桿菌快速增殖。在替代培養(yǎng)20 h后，各試驗(yàn)組的益生菌數(shù)量（OD600值）顯著高于MRS對照組和空白對照組。根據(jù)代時的結(jié)果（圖5C）可發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組可顯著縮短兩歧雙歧桿菌增殖一代所需的時間，但各試驗(yàn)組之間無顯著性差異。綜上，竹蟲蛋白各酶解液均可顯著促進(jìn)兩歧雙歧桿菌的增殖（包括增殖速度和數(shù)量）。雙歧桿菌最適宜的氮源是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物如氨基酸、多肽等，其生長還需要多種礦物元素以及維生素等促生長因子[14]，竹蟲中豐富的氮源、碳源提供了大量的營養(yǎng)成分，同時竹蟲中部分礦物元素等促生長因子，可促進(jìn)雙歧桿菌的新陳代謝[15]，這可能是竹蟲酶解液促進(jìn)兩歧雙歧桿菌增殖的原因之一。

2.2.5 竹蟲蛋白酶解液對4種腸道菌群代時增加率的影響

代時作為菌增殖速度的一個指標(biāo)，其數(shù)值越小代表增殖速度越快，而代時增加率越小表示對該菌增殖效果越明顯。竹蟲蛋白酶解液對腸道菌群的代時增加率是由4種試驗(yàn)組益生菌代時比各組對應(yīng)MRS對照組所得值，結(jié)果見圖7。

圖7 竹蟲蛋白酶解液對腸道菌群代時的影響Fig.7 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on generation time of intestinal flora

如圖7所示，LP45代時增加率普遍很小，而兩歧雙歧桿菌相對較高，表明竹蟲酶解液對LP45促增殖作用最明顯，對兩歧雙歧桿菌的促增殖作用相對較差。由圖7還可發(fā)現(xiàn)，酶解時間對增殖效果無影響，但酶的種類對增殖效果產(chǎn)生了明顯的差異。竹蟲的堿性蛋白酶水解液試驗(yàn)組益生菌代時增加率高于其胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液試驗(yàn)組，表明竹蟲的堿性蛋白酶水解液促增殖效果相對較差，而另外兩種酶相對更好。研究發(fā)現(xiàn)，動物蛋白經(jīng)酶解后會形成一些多肽類活性物質(zhì)，例如鹿茸多肽就是一類促增殖的多肽類活性物質(zhì)[16]。相比于胰蛋白酶（酶解位點(diǎn)為Lys和Arg[17]）和木瓜蛋白酶（酶解位點(diǎn)為L-lys、L-Arg、Gly和L-瓜氨酸[18]），堿性蛋白酶（酶解位點(diǎn)為Arg、His、Lys、Ala、Phe、Leu、Val和Tyr等[19]）是一種位點(diǎn)特異性較弱的蛋白酶，其酶切位點(diǎn)較多[20]，因此在竹蟲的堿性蛋白酶水解液中，部分多肽類活性物質(zhì)可能被堿性蛋白酶酶解從而失去特定的生物活性，這可能是竹蟲的堿性蛋白酶水解液對菌的增殖效果略弱于竹蟲胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的原因之一。但這些多肽物質(zhì)對益生菌的生理功能，以及益生菌的具體吸收利用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究考察了3種不同蛋白酶（堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）在一定工藝條件下制備的竹蟲蛋白酶解液對 4種腸道益生菌（LGG、LP45、M8、兩歧雙歧桿菌）的促增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，竹蟲蛋白酶解液對4種益生菌均有顯著的促增殖作用，其活性與所用酶的種類密切相關(guān)，而酶解時間對其活性影響較小。竹蟲蛋白酶解液增加了LGG、LP45、兩歧雙歧桿菌的數(shù)量、提升了其生長速度，而僅減小了M8代時，促進(jìn)M8的快速復(fù)制。同時，研究還發(fā)現(xiàn)竹蟲蛋白酶解液對LP45的促增殖效果最明顯，而經(jīng)堿性蛋白酶水解制備的竹蟲酶解液對腸道益生菌的促增殖效果相對較差。本研究結(jié)果為竹蟲的開發(fā)利用及其益生活性研究提供了一定的參考依據(jù)。