張文燕，王亞文，袁 晨，馮亞文，滕召劍，商佳亮，逯紀(jì)成，宋勤葉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071000；2.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050051；3.保定市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，保定 071001)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，病死率高達(dá)100%，以體溫升高、全身各組織和器官?gòu)V泛性出血、脾臟異常腫大為主要特征[1-2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病之一，中國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。2018年8月3日，中國(guó)確診首例ASF，隨后該病在中國(guó)各個(gè)地區(qū)暴發(fā)和流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。2021年國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)出現(xiàn)基因突變或缺失的低毒力毒株[5-6]。該突變毒株感染豬的潛伏期和病程延長(zhǎng)，感染豬排毒不規(guī)律，且排毒時(shí)間延長(zhǎng)，致使ASF的防控難度加大。由于目前尚無(wú)預(yù)防和治療ASF的有效疫苗和藥物，故應(yīng)用特異、敏感的病原和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)、排查和清除感染豬是控制本病的重要措施之一[4]。

ASFV是目前已知的唯一DNA蟲(chóng)媒病毒，也是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的唯一成員。目前，已知的不同毒力的ASFV毒株分為8個(gè)血清群、24種基因型[7]。24種基因型在非洲均有流行，中國(guó)流行的主要為基因Ⅱ型，與格魯吉亞毒株為同一個(gè)分支。2021年在河南和山東有流行基因Ⅰ型的報(bào)道[8]。ASFV基因組長(zhǎng)170～193 kb，包含151～167個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白質(zhì)(68個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和100多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白)[9-10]。這些蛋白與病毒的復(fù)制、結(jié)構(gòu)形態(tài)、入侵感染及誘導(dǎo)宿主抗感染免疫等有關(guān)。p72是ASFV二十面體的主要組成部分，對(duì)病毒衣殼的形成起著重要作用。該蛋白由B646L基因編碼，大小為73.2 ku，在病毒感染晚期表達(dá)，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體，并且在不同分離株之間高度保守，故p72是ASFV感染檢測(cè)與診斷的重要靶標(biāo)[10-11]。ELISA是OIE推薦的ASF臨床血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)雖然有基于p72蛋白的ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)告[12-14]，但目前尚缺乏理想的ASFV抗體檢測(cè)試劑盒。故本研究以p72為靶標(biāo)，建立了ELISA抗體檢測(cè)方法，旨在為ASF的血清學(xué)檢測(cè)與臨床診斷提供重要技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。pET28a-p72s表達(dá)菌種[12]，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存。

1.2 材料和主要試劑

ASFV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性豬血清以及臨床采集的無(wú)疾病癥狀的豬的血清樣本，由保定市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供；HRP-羊抗豬IgG購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；ASFV多抗原(p32、p62和p72)間接ELISA試劑盒購(gòu)自IDVET公司；豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗血清均購(gòu)自IDEXX公司；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室制備與保存。

1.3 重組p72s的制備

復(fù)蘇pET28a-p72s表達(dá)菌種，按照 1∶100的比例接種到新鮮Kana+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(D600 nm值達(dá)到約0.6～0.8)時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，26 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h；8 000 r/min離心7 min收集菌體沉淀，于4 ℃超聲裂解菌體35 min(超聲2 s、間歇2 s、振幅30%)；10 000 r/min離心15 min后，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，下同)，檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。進(jìn)而用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化p72s蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的純化結(jié)果。同時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定，即取p72s蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上；將膜置入5%脫脂奶粉的封閉液中，于4 ℃下孵育過(guò)夜；洗膜，加入1∶200倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗血清，室溫孵育2 h，同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)ASFV陰性血清對(duì)照；洗膜，加入1∶4 000稀釋的HRP-羊抗豬IgG，室溫孵育1.5 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中顯色至條帶清晰。

1.4 ELISA方法的建立

1.4.1 抗原包被濃度與待檢血清稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法同時(shí)確定抗原包被濃度和待檢血清稀釋倍數(shù)。即將重組p72s稀釋為0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，每個(gè)濃度重復(fù)2孔；將酶標(biāo)板置37 ℃孵育1 h，4 ℃過(guò)夜；次日棄去包被液，用PBST(含0.05% Tween-20的0.01 moL/L PBS，pH 7.4)洗滌3次，3 min/次；加入封閉液(含5%犢牛血清的PBST)于37 ℃封閉1 h；分別將1∶50～1∶1 600倍比稀釋的陽(yáng)性、陰性血清加入到不同濃度抗原包被的相應(yīng)孔內(nèi)，組成方陣，每孔100 μL，于37 ℃條件下反應(yīng)1 h；洗板3次(洗滌方法同前)，每孔加入100 μL HRP-羊抗豬 IgG(1∶2 500稀釋)，于37 ℃反應(yīng)45 min；洗板，加入底物(TMB)顯色液，100 μL/孔，室溫避光顯色15 min；每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定樣本D450 nm值，并計(jì)算陽(yáng)性血清(P)與陰性血清(N)D450 nm值的比值(P/N值)，以確定抗原最佳包被濃度和待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.2 封閉液與酶標(biāo)抗體工作濃度的確定 將4種封閉液(含5%犢牛血清、5%脫脂奶粉、1%明膠和2%BSA的PBST)分別與1∶500、1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000倍比稀釋的HRP-羊抗豬IgG組成方陣，進(jìn)行ELISA，每個(gè)組合重復(fù)2孔。操作過(guò)程同1.4.1。根據(jù)P/N值的大小，確立最佳封閉液和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.3 反應(yīng)條件的確定 通過(guò)單一變量法優(yōu)化ELISA的反應(yīng)條件，即將一定濃度的重組p72s加入到酶標(biāo)板的相應(yīng)孔內(nèi)后，分別于37 ℃孵育2 h后4 ℃過(guò)夜、37 ℃孵育1 h后4 ℃過(guò)夜及4 ℃過(guò)夜等條件下包被抗原，然后按照1.4.1所述的操作過(guò)程進(jìn)行ELISA，根據(jù)P/N值確定最佳抗原包被條件。隨后依次對(duì)封閉條件(分別于37 ℃和室溫條件下封閉1和2 h)、待檢血清反應(yīng)條件(37 ℃或室溫下反應(yīng)30或60 min)、酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件(37 ℃或室溫下反應(yīng)30、45或60 min)及顯色條件(室溫避光顯色10、15、20、25和30 min)進(jìn)行優(yōu)化，確定ELISA的最佳反應(yīng)條件。每個(gè)反應(yīng)條件均重復(fù)1次。

1.4.4 陰陽(yáng)性臨界值的確定 通過(guò)ELISA檢測(cè)ASFV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清各100份，每份血清重復(fù)1孔。用GraphPad Prism5.0軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計(jì)算判定特異抗體陰、陽(yáng)性臨界值，并應(yīng)用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)100份陰性血清D450 nm值進(jìn)行正態(tài)分布分析，評(píng)價(jià)陰陽(yáng)性臨界值劃分的準(zhǔn)確性。

1.4.5 特異性試驗(yàn) 以建立的ELISA檢測(cè)PRV-gE、PRV-gB、PCV2、CSFV、PRRSV抗體陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)立ASFV陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，每份血清重復(fù)2孔。檢驗(yàn)其他病毒抗體血清與p72s的交叉反應(yīng)情況，評(píng)價(jià)建立方法的特異性。

1.4.6 敏感性檢測(cè) 分別用建立的ELISA和商品試劑盒檢測(cè)5份(1#～5#)1∶100～1∶12 800倍比稀釋的ASFV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(每個(gè)稀釋度重復(fù)2孔)，分析建立方法與試劑盒檢測(cè)的血清抗體效價(jià)。同時(shí)用分光光度計(jì)(NanoDrop2000)測(cè)定所建立的ELISA方法和試劑盒可檢測(cè)的血清中的最低蛋白含量。根據(jù)上述結(jié)果綜合評(píng)價(jià)建立方法的檢測(cè)靈敏度。

1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批次或3個(gè)批次的p72s蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)9份臨床血清樣品，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算ELISA的變異系數(shù)，評(píng)價(jià)ELISA的批內(nèi)與批間重復(fù)性。

1.5 初步應(yīng)用、符合率檢驗(yàn)及Western blotting驗(yàn)證

同時(shí)用建立的方法和試劑盒檢測(cè)124份血清樣本，比較兩者檢測(cè)結(jié)果的符合率。隨機(jī)選擇p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清5份，試劑盒檢測(cè)為陰性而p72s-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的血清5份，以及p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)均為陰性的血清5份，進(jìn)一步用Western blotting驗(yàn)證。Western blotting的主要步驟：將SDS-PAGE后的p72s蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，于4 ℃下封閉過(guò)夜；洗膜，加入待檢豬血清(1∶100稀釋)，室溫孵育2 h；洗膜，加入HRP-羊抗豬IgG(1∶4 000稀釋)，室溫孵育1.5 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中于暗處顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 重組p72s蛋白的制備

收集IPTG誘導(dǎo)5 h后的pET28a-p72s表達(dá)菌，超聲波裂解后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，可見(jiàn)以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白條帶，蛋白分子質(zhì)量約42 ku(圖1A)，與預(yù)期大小相符。蛋白經(jīng)鎳柱純化后，電泳無(wú)肉眼可見(jiàn)雜蛋白(圖1B)。Western blotting鑒定結(jié)果顯示，重組p72s蛋白能夠與標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗血清反應(yīng)，在42 ku處顯示目的條帶，而與ASFV抗體陰性血清不發(fā)生反應(yīng)(圖1C)。

A，重組p72s的表達(dá)及其表達(dá)形式：M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2，分別為細(xì)菌誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的產(chǎn)物；3、4，分別為菌體裂解后的上清液與沉淀。B，重組p72s的純化：M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，蛋白洗脫液；2～5，純化蛋白樣品。C，重組p72s的Western blotting鑒定：M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，重組p72s與ASFV陽(yáng)性血清反應(yīng)；2，重組p72s與ASFV陰性血清反應(yīng)

2.2 最佳抗原包被濃度和待檢血清的稀釋倍數(shù)

當(dāng)重組p72s以0.5～4.0 μg/mL包被、待檢血清1∶50～1∶100稀釋時(shí)，陽(yáng)性血清的D450 nm值在1.108～2.612之間，陰性血清的D450 nm值在0.166～0.366之間，此時(shí)的P/N值為5.363～8.448，高于其他組合的P/N值(表1)。但當(dāng)血清1∶100稀釋?zhuān)鞍装粷舛葹?.0 μg/mL時(shí)，陰性血清的D450 nm值高于0.5 μg/mL包被時(shí)的D450 nm值，故本試驗(yàn)確定ELISA的最適抗原包被濃度為0.5 μg/mL，待檢血清的稀釋度為1∶100。

表1 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定(D450 nm值)

2.3 最佳封閉液和酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)

由表2可知，以1%明膠和2%BSA作為封閉液時(shí)，陰性血清的D450 nm值在0.188～1.242之間，特異性不好，故首先排除這兩種封閉液。比較5%犢牛血清和5%脫脂奶粉作為封閉液時(shí)的P/N值時(shí)發(fā)現(xiàn)，后者的P/N值明顯高于前者，且用5%脫脂奶粉作為封閉液、酶標(biāo)抗體作1∶5 000稀釋時(shí)，陰性血清的D450 nm值最低，且P/N值(15.019)較高。故確定ELISA的封閉液為5%脫脂奶粉，酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶5 000。

表2 最佳封閉液和酶標(biāo)抗體稀釋度的確定(D450 nm值)

2.4 最佳反應(yīng)條件

通過(guò)比較不同反應(yīng)條件下的P/N值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗原包被酶標(biāo)板后于37 ℃孵育1 h，再于4 ℃吸附過(guò)夜，加入封閉液于37 ℃封閉1 h或者于室溫下封閉2 h，抗原與待檢血清在37 ℃反應(yīng)60 min，待檢血清與酶標(biāo)抗體在37 ℃反應(yīng)45 min，底物于室溫避光顯色20 min時(shí)，ELISA的P/N值最大，分別為22.523、16.232或16.788、12.297、9.916和17.413，故確定上述條件為所建立的ELISA(p72s-ELISA)方法的最佳反應(yīng)條件。

2.5 陰陽(yáng)性臨界值測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用ROC曲線分析p72s-ELISA檢測(cè)的100份抗ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和100份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的D450 nm值，結(jié)果顯示曲線下面積(AUC)為0.999(95%CI=0.9954～1.0000)，以0.365為臨界值，約登指數(shù)(0.99)最大，靈敏度為0.99(95%CI=0.9455～0.9997)，特異性為1(95%CI=0.9638～1.0000)，故當(dāng)D450 nm值≥0.365時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)D450 nm值<0.365時(shí)，判定為陰性(圖2A)。進(jìn)一步對(duì)上述100份陰性血清的D450 nm值進(jìn)行的正態(tài)分布分析，結(jié)果顯示p72s-ELISA偏度系數(shù)為0.156，峰度系數(shù)—0.487，均<1，單樣本K-S檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.200(圖2B)。表明p72s-ELISA的檢測(cè)結(jié)果服從正態(tài)分布。

A，臨界值；B，正態(tài)分布分析

2.6 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用p72s-ELISA方法檢測(cè)PRV-gE、PRV-gB、PCV2、CSFV和PRRSV抗血清時(shí)，D450 nm值均低于臨界值(0.365)(圖3)，表明p72s-ELISA方法具有良好的特異性。

圖3 p72s-ELISA的特異性檢測(cè)

2.7 敏感性檢測(cè)結(jié)果

用p72s-ELISA和商品試劑盒同時(shí)檢測(cè)5份ASFV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，結(jié)果p72s-ELISA檢測(cè)的血清抗體效價(jià)分別為1∶800、1∶1 600、1∶800、1∶800和1∶800，試劑盒檢測(cè)的抗體效價(jià)分別為：1∶200、1∶200、陰性、1∶800和1∶800(圖4)。p72s-ELISA和試劑盒可檢測(cè)到相應(yīng)血清的總蛋白含量分別在0.091～0.153和0.110～0.554 mg/mL之間。上述結(jié)果表明，建立的p72s-ELISA方法具有很高的敏感性。

圖4 p72s-ELISA(A)與商品試劑盒(B)的敏感性比較

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

分別用同一批次和不同批次的p72s-ELISA檢測(cè)9份血清，結(jié)果如表3與表4所示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)(CV)為0.736%～9.158%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.944%～8.205%，均低于10%。該結(jié)果表明，建立的ELISA方法均具有良好的重復(fù)性。

表3 p72s-ELISA批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(D450 nm值)

表4 p72s-ELISA批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(D450 nm值)

2.9 初步臨床應(yīng)用、符合率及驗(yàn)證

分別用建立的p72s-ELISA和商品試劑盒檢測(cè)124份血清樣本，結(jié)果如表5所示，p72s-ELISA和商品試劑盒的ASF抗體陽(yáng)性檢出率分別為75.81%(94/124)和32.26%(40/124)，ASF抗體陰性檢出率分別為24.19%(30/124)和67.74%(84/124)。p72s-ELISA與商品試劑盒的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為35.71%，總符合率均為56.45%。進(jìn)一步用Western blotting對(duì)p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)結(jié)果相符和不符的15份血清進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)結(jié)果同為陽(yáng)性、試劑盒檢測(cè)為陰性而ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的血清，Western blotting檢測(cè)均出現(xiàn)目的條帶；試劑盒和ELISA檢測(cè)均為陰性的血清無(wú)目的條帶出現(xiàn)(圖5)。上述結(jié)果表明，p72s-ELISA的檢測(cè)結(jié)果與Western blotting檢測(cè)結(jié)果完全一致，其ASFV抗體陽(yáng)性檢出率高于商品試劑盒。

表5 p72s-ELISA與ELISA試劑盒的符合率

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5，p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)均為抗體陽(yáng)性的血清；6～10，p72s-ELISA檢測(cè)抗體陽(yáng)性、試劑盒檢測(cè)為抗體陰性的血清；11～15，p72s-ELISA與試劑盒檢測(cè)均為陰性的血清；16，陽(yáng)性對(duì)照；17，陰性對(duì)照

3 討 論

ASF在全球的流行區(qū)域不斷增加，快速檢測(cè)和及時(shí)確診感染豬或發(fā)病豬是有效控制該病的主要措施。已知隨著ASFV毒株的毒力、感染途徑、感染劑量及宿主的抵抗力不同，ASF的臨床經(jīng)過(guò)表現(xiàn)為最急性、急性、亞急性和慢性型等多種形式，致使該病的臨床癥狀與病理變化復(fù)雜多樣[1-2]，尤其是ASFV變異減毒株在中國(guó)豬場(chǎng)的出現(xiàn)，增加了非洲豬瘟流行的隱蔽性，同時(shí)給該病的臨床診斷和防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)[5-6]。應(yīng)用PCR檢測(cè)唾液和血液樣本中的病毒核酸是篩查ASFV感染豬的重要手段[1-2]，但由于ASFV慢性和亞臨床感染豬的排毒沒(méi)有規(guī)律，僅僅依靠PCR檢測(cè)，常出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，故需要結(jié)合抗體檢測(cè)結(jié)果，以保證篩檢的準(zhǔn)確性[1-2]。鑒于此，不斷改進(jìn)和完善診斷與監(jiān)測(cè)手段對(duì)于ASF的有效防控至關(guān)重要。

ELISA是廣泛用于快速檢測(cè)特異性抗體的常用檢測(cè)技術(shù)，其不僅敏感性和特異性高，而且適于樣本的批量檢測(cè)和商品化。用于ELISA的檢測(cè)抗原可以是完整的病原微生物，也可以是來(lái)自病原微生物或體外表達(dá)的蛋白。由于ASF是中國(guó)規(guī)定的一類(lèi)動(dòng)物疫病，培養(yǎng)和純化ASFV需要生物安全防護(hù)3級(jí)(P3)實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)與純化病毒成本高，并且在操作過(guò)程中存在散毒的安全隱患，而應(yīng)用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白作為檢測(cè)抗原，具有特異、敏感、成本低、安全等優(yōu)勢(shì)。因此，現(xiàn)在常通過(guò)體外表達(dá)手段，制備目標(biāo)蛋白作為ELISA用抗原[13-16]。相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、成本低，所以本試驗(yàn)采用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)p72s蛋白。

ELISA結(jié)果的臨界值確定直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，臨界值過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性。為了保證建立方法結(jié)果判定的客觀性，本研究采用ROC曲線分析方法確定陰陽(yáng)性臨界值，同時(shí)對(duì)已知陰性樣本進(jìn)行正態(tài)分布分析。已知進(jìn)行ROC曲線分析時(shí)，常用約登指數(shù)來(lái)評(píng)判方法的準(zhǔn)確性，約登指數(shù)越大說(shuō)明所建立方法的靈敏度越高、特異性越強(qiáng)[17-18]。本試驗(yàn)中約登指數(shù)的最大值為0.99，AUC為0.999，并且樣本檢測(cè)結(jié)果服從正態(tài)分布，說(shuō)明所建立方法同時(shí)具有很高的靈敏度、特異性與客觀性。建立的p72s-ELISA方法與常見(jiàn)的CSFV、PRRSV、PRV等病毒無(wú)交叉反應(yīng)，批內(nèi)與批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均低于10%，說(shuō)明所建立的方法的特異性高、重復(fù)性好，這些特征與文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道的相似。但本研究不僅與商品試劑盒進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)建立方法的敏感性和對(duì)血清樣本的陽(yáng)性檢出率更高，而且為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還應(yīng)用Western blotting對(duì)ELISA的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與ELISA的檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明建立的ELISA方法具有更高的檢測(cè)敏感性與準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究建立了基于ASFV截短p72蛋白的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，該方法的抗原最佳包被濃度為0.5 μg/mL，待檢血清的稀釋度為1∶100；與PRV、PCV2、CSFV和PRRSV等病毒抗血清均無(wú)交叉反應(yīng)；能檢測(cè)到ASFV抗血清中的總蛋白量為0.091～0.153 mg/mL，具有良好批內(nèi)與批間重復(fù)性；對(duì)血清樣本的陽(yáng)性檢出率高于商品試劑盒。建立的間接ELISA方法可以為ASF的血清學(xué)調(diào)查、臨床診斷及其綜合防控提供重要技術(shù)支撐，具有顯著的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力。