劉華云，張 磊，徐桂利，張?zhí)旌?，謝遇春，段玲欣，劉錚鑄，鞏元芳

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省特色動物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島066004)

狐貍是中國重要的毛皮動物，分狐屬和北極狐屬2個(gè)屬，銀黑狐是狐屬狐中的一個(gè)種[1]。狐貍毛色不僅是識別狐種的重要表型性狀，也是衡量其毛皮質(zhì)量的重要經(jīng)濟(jì)性狀。黑色素是哺乳動物毛色形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，分為真黑色素和褐黑色素，真黑色素使毛色呈黑色，褐黑色素使毛色呈黃色或紅色，真黑色素和褐黑色素的分布決定哺乳動物毛色的深淺。黑色素的合成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，受多個(gè)基因的調(diào)控[2]。黑素皮質(zhì)激素受體1(melanocortin 1 receptor，MC1R)基因是參與黑色素合成的重要功能基因，該基因編碼區(qū)只有1個(gè)外顯子，通過調(diào)節(jié)cAMP通路促進(jìn)黑色素表達(dá)中真黑色素的合成[3]。

研究表明，MC1R基因主要存在于哺乳動物毛囊和皮膚的黑色素細(xì)胞中，與皮膚或被毛色素的沉積緊密相關(guān)[4-5]。劉玲玲等[6]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)MC1R基因與馬毛色性狀有關(guān)。王曉薇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MC1R基因在黑斑灘羊皮膚組織中表達(dá)量極顯著高于純白灘羊、顯著高于褐斑灘羊，說明MC1R基因的高表達(dá)有利于真黑色素的形成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞中黑色素含量的增加。南瑞鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MC1R基因在羊駝毛囊干細(xì)胞中高效表達(dá)，間接促進(jìn)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)和酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)基因的表達(dá)，說明羊駝毛色形成受多個(gè)基因的調(diào)控。因此，MC1R基因在動物毛色合成過程中有著重要的調(diào)控作用，其通過促進(jìn)真黑色素的合成繼而影響動物深毛色的形成。

基因在真核生物中的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過程，依賴于多層次的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是影響真核生物基因表達(dá)的重要一步。啟動子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，通過對啟動子區(qū)的研究有助于了解基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制[9-11]。目前，MC1R基因啟動子區(qū)在人、小鼠中研究較為成熟[12]，但在狐貍中鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究利用PCR擴(kuò)增、生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等技術(shù)對銀黑狐MC1R基因核心啟動子區(qū)進(jìn)行了鑒定與分析，以期為深入研究該基因?qū)偯恼{(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 銀黑狐來自秦皇島市昌黎金島育種場，隨機(jī)選取1只健康成年銀黑狐，剪去背部被毛，用取膚器采集背部皮膚組織樣品并立即放入液氮中，后轉(zhuǎn)入―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ和Hind Ⅲ均購自TaKaRa公司；pGL3-Basic表達(dá)載體、pRL-TK載體和雙熒光酶檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System均購自Promega公司；皮膚黑色素瘤細(xì)胞株(B16細(xì)胞)購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基(高糖型)購自HyClone公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 基因組DNA提取

參照Sambrook等[11]方法從銀黑狐皮膚組織樣中提取基因組DNA，TE溶解，―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)序列獲取

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中犬MC1R基因5′-UTR區(qū)序列(登錄號：NM_001014282)和銀黑狐MC1R基因編碼區(qū)序列(登錄號：KJ489060)，利用Primer Premier 3.0引物設(shè)計(jì)軟件對銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：5′-GAGCTCTGTTCTCTCAGCCTCCTCAC-3′；R：5′-AAGCTTGAAGTGAGGGGTGGTTGG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為2 781 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系50 μL：銀黑狐基因組DNA 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 37 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取鑒定正確的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后克隆至pMD19-T載體，連接體系10 μL：載體 1 μL，DNA回收產(chǎn)物 4 μL，Solution Ⅰ 5 μL。離心混勻后，16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃搖床培養(yǎng)，將菌液PCR鑒定為陽性的樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 銀黑狐MC1R基因核心啟動子區(qū)預(yù)測分析

利用3個(gè)在線生物學(xué)軟件Neural Network Promoter Prediction(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Promoter 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和TSSW(http:∥www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssw&group=programs&subgroup=promoter)依次對銀黑狐MC1R基因啟動子核心區(qū)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 銀黑狐MC1R基因核心啟動子區(qū)確定

在軟件預(yù)測的基礎(chǔ)上，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)進(jìn)一步確定銀黑狐MC1R基因的核心啟動子區(qū)。

1.5.1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，在起始密碼子上游依次截取10個(gè)片段(圖1)，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1)，在上、下游引物的5′-端分別引入SacⅠ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基以便于克隆。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。缺失片段PCR擴(kuò)增體系與程序同1.3.2，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 銀黑狐MC1R基因啟動子缺失片段示意圖

表1 銀黑狐MC1R基因啟動子區(qū)缺失片段引物

1.5.2 目的片段克隆及鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后連接至pMD19-T載體上，具體方法同1.3.2，將菌液PCR鑒定為陽性的樣品送往華大基因公司進(jìn)行測序。

1.5.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 對于不同長度的重組載體pMD19-T和pGL3-Basic，利用SacⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切。酶切體系50 μL：質(zhì)粒 13 μL，Buffer 5 μL,SacⅠ和Hind Ⅲ各3 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。37 ℃酶切6 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證后選取相應(yīng)擴(kuò)增片段與pGL3-Basic連接，連接體系10 μL：目的片段質(zhì)粒4 μL，pGL3-Basic 1 μL，Solution Ⅰ 5 μL。16 ℃過夜連接。共構(gòu)建10個(gè)熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，分別命名為：pGL3-MC1RP0(-2 708/+73 bp)、pGL3-MC1RP1(-2 214/+73 bp)、pGL3-MC1RP2(-2 062/+73 bp)、pGL3-MC1RP3(-1 960/+73 bp)、pGL3-MC1RP4(-1 529/+73 bp)、pGL3-MC1RP5(-1 207/+73 bp)、pGL3-MC1RP6(-1 028/+73 bp)、pGL3-MC1RP7(-765/+73 bp)、pGL3-MC1RP8(-520/+73 bp)和pGL3-MC1RP9(-268/+73 bp)。菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定后，選取陽性重組質(zhì)粒測序。對陽性菌液提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，并檢測其濃度和純度。

1.5.4 細(xì)胞培養(yǎng)與重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取出B16細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每1～2 d用胰酶消化傳代。復(fù)蘇后的細(xì)胞培養(yǎng)3代后用于重組質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(瞬轉(zhuǎn))試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前12～24 h，將生長狀態(tài)良好的B16細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每孔接種5×104～10×104個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，按照Xfect Transfection Reagent操作步驟進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染時(shí)每孔加入質(zhì)?？偭繛? μg(pGL3相關(guān)重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK質(zhì)量比為100∶1)，轉(zhuǎn)染試劑量為15 μL。對照組為pGL3-Basic與pRL-TK共轉(zhuǎn)染，試驗(yàn)組為pGL3相關(guān)重組質(zhì)粒與pRL-TK共轉(zhuǎn)染。每組進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔的轉(zhuǎn)染，且進(jìn)行3次以上重復(fù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用于雙熒光素酶的活性檢測。

1.5.5 雙熒光素酶活性檢測 根據(jù)雙熒光酶檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書進(jìn)行報(bào)告基因表達(dá)水平的檢測，具體方法為：棄掉24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌細(xì)胞2次；加入150 μL細(xì)胞裂解液(1×PLB)，輕輕吹打完全細(xì)胞；室溫放置15 min后，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物；取20 μL細(xì)胞裂解產(chǎn)物至熒光測定管中，加入100 μL檢測試劑(firefly luciferase，LARⅡ)，混勻后使用GloMax-MultiJr單管型多功能檢測儀檢測螢火蟲螢光素酶活性；迅速加入100 μL Stop&GLO試劑，測定作為內(nèi)標(biāo)的Renilla熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶活性/Renilla熒光素酶活性的比值即為熒光素酶的相對活性(relative luciferase activity，RLA)。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05代表組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)序列獲取

以銀黑狐基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，有一條長約2 781 bp的清晰條帶(圖2)，與目的片段大小相符。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體后送測序，結(jié)果顯示，克隆所獲目的片段與GenBank中犬MC1R基因5′-UTR區(qū)序列(登錄號：NM_001014282)相似性達(dá)93.97%，表明已成功獲得銀黑狐MC1R基因2 781 bp(-2 708/+73 bp)的5′-UTR區(qū)序列。

圖2 銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 銀黑狐MC1R基因啟動子活性區(qū)預(yù)測分析

通過在線軟件對銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)(-2 708/+73 bp)進(jìn)行預(yù)測分析。利用Neural Network Promoter Prediction預(yù)測到4個(gè)啟動子活性區(qū)域：-1 964/-1 915 bp(得分0.93)、-1 834/-1 785 bp(得分0.97)、-1 414/-1 365 bp(得分0.82)和-596/-548 bp(得分0.92)；利用Promoter 2.0軟件預(yù)測啟動子位置為-1 209 bp(得分0.70)和-309 bp(得分0.71)；利用TSSW軟件預(yù)測啟動子位置為-2 323 bp(得分17.88)和-359 bp(得分4.86)。3個(gè)軟件是基于不同算法對啟動子區(qū)的預(yù)測，提示-596/+73 bp可作為參考的候選核心啟動子區(qū)域。

2.3 銀黑狐MC1R基因啟動子缺失序列重組質(zhì)粒酶切鑒定

以2 781 bp(-2 708/+73 bp)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行缺失片段的PCR擴(kuò)增，所得片段大小分別為2 781、2 287、2 135、2 033、1 602、1 280、1 101、838、593和341 bp(圖3)，均與預(yù)期大小相符。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后分別克隆到pGL3-Basic質(zhì)粒中，用SacⅠ與Hind Ⅲ雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定，均獲得與預(yù)期相符的目的片段(圖4)。選出陽性重組質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示，克隆到的不同長度目的片段與所得狐貍MC1R基因序列相似性達(dá)99%。說明成功構(gòu)建了10個(gè)包含銀黑狐MC1R基因不同長度序列的重組質(zhì)粒。

P0～P9，MC1R基因啟動子不同缺失片段;M，DM10000 DNA Marker

M，DM5000 DNA Marker；P0～P9，不同缺失片段重組質(zhì)粒的SacⅠ與Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物

2.4 雙熒光素酶活性檢測

將10個(gè)啟動子缺失片段的重組質(zhì)粒、pGL3-Basic質(zhì)粒分別與phRL-TK質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，計(jì)算RLA，分析各啟動子片段的活性，進(jìn)而確定MC1R基因的啟動子位置，結(jié)果見圖5。由圖5可知，9個(gè)啟動子缺失片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的熒光素酶相對活性均較pGL3-Basic空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著或極顯著增加(P<0.05；P<0.01)，表明報(bào)告基因在B16細(xì)胞中具有啟動活性，啟動子片段可啟動熒光素酶的表達(dá)。通過比較10個(gè)不同長度啟動子片段的活性值發(fā)現(xiàn)，pGL3-MC1RP8(-520/+73 bp)組的熒光素酶活性值最高，說明銀黑狐MC1R基因的核心啟動子區(qū)存在于pGL3-MC1RP8(-520/+73 bp)區(qū)域內(nèi)。

與pGL3-Basic相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

銀黑狐是赤狐在自然條件下產(chǎn)生的毛色突變體，被毛黑白相間，有一層霧狀的針毛，是裘皮服裝的主要飾品。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高以及綠色環(huán)保理念的普及，生產(chǎn)天然優(yōu)質(zhì)彩色狐皮成為養(yǎng)狐業(yè)的終極目標(biāo)，因此對其毛色調(diào)控基因的研究成為熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控狐貍毛色的基因有MC1R、TYRP1、Agouti、TYR、CBD、Extension、SILV、KIT、MITF等，其中MC1R是最早被發(fā)現(xiàn)且證實(shí)可調(diào)控動物毛色的基因之一[13]，前人陸續(xù)在狐貍[14-16]、水貂[17]、家犬[18-19]、兔[20-22]、馬[23]、羊[24-26]、豬[27-29]、牛[30-33]和羊駝[34]等物種中進(jìn)行了相關(guān)研究?；蛟谡婧松镏械谋磉_(dá)調(diào)控可分為多個(gè)水平，其中最主要的就是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而啟動子調(diào)控也是轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的關(guān)鍵，因此針對啟動子功能區(qū)域開展相關(guān)研究對了解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義[2]。

本研究成功獲取了銀黑狐MC1R基因5′-UTR區(qū)2 781 bp的DNA序列，構(gòu)建了10個(gè)不同缺失長度的啟動子熒光素酶表達(dá)載體，活性檢測表明，10個(gè)片段均有一定的啟動子活性。研究表明，克隆片段僅含有TSS上游的區(qū)域很多情況會導(dǎo)致假陰性結(jié)果，若克隆片段包含TSS、ATG及部分編碼區(qū)會使陽性率大大提高[2]。本研究克隆的10個(gè)片段均符合上述要求。利用3種不同算法的在線生物學(xué)軟件對銀黑狐MC1R基因的啟動子區(qū)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，-596/+73 bp可能為該基因的核心啟動子區(qū)。雙熒光素酶活性結(jié)果顯示，pGL3-MC1RP8(-520/+73 bp)的活性值最高，提示-520/+73 bp為銀黑狐MC1R基因的核心啟動子區(qū)，與軟件預(yù)測結(jié)果相符。

研究發(fā)現(xiàn)，在狐貍MC1R基因5′-UTR區(qū)的-36/-41、-100/-105、-123/-128、-278/-283和-507/-512 bp區(qū)域各存在1個(gè)E-box，在-91/-96 bp區(qū)域存在1個(gè)GC-box，在-451/-457 bp區(qū)域存在1個(gè)BRE調(diào)控元件[16]。E-box和GC-box是上游調(diào)控區(qū)重要的順式作用元件，參與促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BRE是基因核心啟動子區(qū)重要的調(diào)控元件，是TFIIB的特異性識別元件，而TFIIB基因的一個(gè)基本轉(zhuǎn)錄起始因子可促進(jìn)RNA聚合酶正確定位，起“定位因子”的作用[35]。研究中E-box、GC-box及BRE調(diào)控元件均位于-520/+73 bp區(qū)域內(nèi)，提示通過雙熒光素酶檢測技術(shù)確定的活性區(qū)域(-520/+73 bp)是銀黑狐MC1R基因的核心啟動子區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，黑腹田鼠MC1R基因編碼區(qū)上游500 bp左右為其核心啟動子區(qū)[36]；人MC1R基因最小啟動子區(qū)域在-517/-282 bp[37]，均與本研究結(jié)果基本吻合。

真核生物的表達(dá)是順式作用元件和反式作用因子共同作用的結(jié)果，此過程復(fù)雜而有序。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)的第一步，是轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的過程[38]。本研究構(gòu)建的10個(gè)缺失報(bào)告基因載體中pGL3-MC1RP8(-520/+73 bp)的活性值最高，提示-520/+73 bp區(qū)域內(nèi)含有重要的調(diào)控元件，可調(diào)控狐貍MC1R基因啟動子的活性，本試驗(yàn)結(jié)果為深入研究該基因奠定了理論基礎(chǔ)，也為其他動物毛色基因的研究提供了參考。下一步應(yīng)利用點(diǎn)突變、染色質(zhì)免疫共沉淀、DNA足紋分析和凝膠阻滯分析等技術(shù)驗(yàn)證啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的真正功能，進(jìn)而深入了解狐貍MC1R基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究利用PCR擴(kuò)增、生物學(xué)軟件預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等技術(shù)成功確定了銀黑狐MC1R基因的核心啟動子區(qū)(-520/+73 bp)。