莫顯紅，岳凱平，孫麗瑤，李 冰，趙 冰，郭 成，徐振軍

(赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，赤峰 024000)

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存對(duì)于保護(hù)動(dòng)物種質(zhì)資源、加快優(yōu)良品種繁育、拯救瀕危動(dòng)物等具有重要意義[1]。然而，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力降低，制約了該項(xiàng)技術(shù)的擴(kuò)大應(yīng)用，提高冷凍效率一直是低溫生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，參與調(diào)控卵母細(xì)胞成熟分裂、激活及早期胚胎發(fā)育等過程[2]。但在脅迫條件下，如卵母細(xì)胞體外操作和體外培養(yǎng)過程中暴露于高氧環(huán)境或使用過氧化氫(H2O2)處理，產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可以引起胞內(nèi)游離Ca2+([Ca2+]i)濃度異常升高，即鈣穩(wěn)態(tài)失衡[3]。研究證實(shí)，玻璃化冷凍作為一種應(yīng)激因素，也會(huì)引起卵母細(xì)胞[Ca2+]i濃度異常增加，使得皮質(zhì)顆粒(CG)提前釋放、透明帶硬化，導(dǎo)致受精率降低[4-6]。然而，玻璃化冷凍引起胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高的具體機(jī)制尚未闡明。

胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高有2個(gè)來(lái)源，一個(gè)是胞外Ca2+的內(nèi)流，另一個(gè)是胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+釋放[7]。胞內(nèi)[Ca2+]i濃度降低也通過這2條途徑實(shí)現(xiàn)[8]。在小鼠、綿羊、牛的卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存中，使用無(wú)Ca2+或低Ca2+冷凍保護(hù)劑均可提高卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育能力[9-11]。研究表明，在玻璃化冷凍液中添加鈣螯合劑1,2-雙(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)[11]、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)[12]可降低胞內(nèi)[Ca2+]i含量，從而顯著提高冷凍卵母細(xì)胞解凍后的發(fā)育能力。研究發(fā)現(xiàn)，2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-APB)作為IP3受體(IP3Rs)抑制劑，降低IP3Rs敏感性，可抑制吲哚美辛[13]、順鉑[14]等藥物誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。薛玉環(huán)[15]使用2-APB預(yù)處理小鼠卵母細(xì)胞后進(jìn)行冷凍，一定程度上降低了胞內(nèi)Ca2+濃度，減少細(xì)胞損傷，提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果表明，在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加10 μmol/L 2-APB可有效阻止卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，提高了綿羊體外成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量[16]。本研究以無(wú)Ca2+玻璃化冷凍液冷凍成熟培養(yǎng)24 h的牛卵母細(xì)胞，冷凍前用10 μmol/L 2-APB預(yù)處理10 min，檢測(cè)其對(duì)冷凍后卵母細(xì)胞成活率和發(fā)育能力的影響，以期為探討冷凍保存導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢 試驗(yàn)所用牛卵巢來(lái)自河北省廊坊市大廠回族自治縣屠宰場(chǎng)，采集的牛卵巢置于含雙抗的35 ℃生理鹽水中，2～4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑及儀器 DPBS和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自Gibco公司；2-APB(D9754)、FITC-PNA(L7381)、聚蔗糖(Ficoll 70000)、SOF液、非必需氨基酸(NEAA)、必需氨基酸(EAA)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自Sigma公司。體視顯微鏡(Z61)、熒光顯微鏡(BX51)均購(gòu)自O(shè)lympus公司；激光共聚焦顯微鏡(EZ-C1)購(gòu)自Nikon公司；CO2培養(yǎng)箱(3110)購(gòu)自Thermo公司。

1.1.3 試劑與溶液配制 ①抽卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L肝素鈉+10 mL/L FBS+0.065 g/L青霉素+0.05 g/L鏈霉素。②成熟培養(yǎng)液：TCM199+10% FBS+0.02 IU/mL FSH+ 0.02 IU/mL LH+1 μg/mL E2+1 mmol/LL-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF。③mPBS液：DPBS(Gibco)100 mL，添加0.0036 g丙酮酸鈉、0.1 g葡糖糖、0.3 g BSA。④FS液：300 g/L聚蔗糖添加0.5 mol/L蔗糖，經(jīng)mPBS溶解后配制而成。⑤玻璃化冷凍液(VS)及解凍液(TS)：VS1：基礎(chǔ)液為mPBS，含7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲基亞砜(DMSO)+20% FBS；VS2：基礎(chǔ)液為FS，含15% EG+15% DMSO+20% FBS；TS1：基礎(chǔ)液為mPBS，含1 mol/L蔗糖；TS2：基礎(chǔ)液為mPBS，含0.5 mol/L蔗糖；TS3：基礎(chǔ)液為mPBS，含0.25 mol/L蔗糖。⑥胚胎發(fā)育液：SOF+1% NEAA+1% EAA+10 ng/mL EGF+1 mmol/LL-谷氨酰胺+8 mg/mL BSA。⑦2-APB濃儲(chǔ)液：取適量2-APB溶解在甲醇中配成1 000倍濃儲(chǔ)，分裝，于―20 ℃儲(chǔ)存，臨用前用成熟培養(yǎng)液稀釋至10 μmol/L。

1.2 卵母細(xì)胞的采集及成熟培養(yǎng)

用帶有18號(hào)針頭的10 mL注射器(先吸取2 mL抽卵液)抽吸卵巢表面3～8 mm的卵泡，于體視顯微鏡下挑選包裹3層及以上卵丘顆粒細(xì)胞、胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)放于體外成熟培養(yǎng)液中，在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-解凍

用0.1%透明質(zhì)酸酶消化體外成熟培養(yǎng)24 h的COCs脫去卵丘顆粒細(xì)胞，得到牛MⅡ卵母細(xì)胞，隨機(jī)分成對(duì)照組(直接進(jìn)行玻璃化冷凍保存)和2-APB組(玻璃化冷凍前用10 μmol/L 2-APB處理10 min)。牛MⅡ卵母細(xì)胞在室溫條件下采用開放式拉長(zhǎng)塑料細(xì)管(OPS)法進(jìn)行玻璃化冷凍。將牛MⅡ卵母細(xì)胞(5枚為宜)在VS1液中平衡30 s，移入VS2液中滲透25 s，將牛MⅡ卵母細(xì)胞及少量VS2液吸入OPS中，并立即投入液氮。2 d后，將OPS從液氮中取出，迅速將牛MⅡ卵母細(xì)胞排至TS1液中。MⅡ卵母細(xì)胞在TS1液中平衡1 min后移入TS2液中保持5 min；移入TS3液中保持5 min；將MⅡ卵母細(xì)胞移入成熟液中，于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)2 h。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 卵母細(xì)胞存活率 統(tǒng)計(jì)1.3解凍后0 h及恢復(fù)培養(yǎng)2 h時(shí)的牛MⅡ卵母細(xì)胞的存活率。卵母細(xì)胞活力的判定標(biāo)準(zhǔn)：卵母細(xì)胞的形態(tài)正常，無(wú)變形；胞質(zhì)均勻，沒有明顯的胞漿溢出與皺縮，透明帶與卵黃膜完整可見，卵周隙清晰。在體視顯微鏡下可見存活卵母細(xì)胞的卵黃膜折光性好，胞質(zhì)呈黑灰色；而死亡卵母細(xì)胞沒有折光性，胞質(zhì)呈均質(zhì)的土黃色。

1.4.2 皮質(zhì)顆粒分布 取1.3冷凍-解凍恢復(fù)培養(yǎng)2 h的對(duì)照組及2-APB組牛MⅡ卵母細(xì)胞，用0.5%鏈酶蛋白酶消化去除透明帶，用3.7%多聚甲醛室溫固定30 min，在封閉液(DPBS+0.3% BSA+ 100 mmol/L 甘氨酸)中洗3次，用0.1% Triton X-100滲透5 min。在封閉液中洗3次，每次5 min，卵母細(xì)胞與10 μmol/L FITC-PNA室溫下共孵育30 min，在mPBS中洗3次，每次5 min。染色壓片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3 卵母細(xì)胞活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量 取1.3冷凍-解凍恢復(fù)培養(yǎng)2 h的對(duì)照組及2-APB組牛MⅡ卵母細(xì)胞，在含有1 mmol/L 2′,7′-DCHFDA的DPBS微滴中孵育20 min，用mPBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)光為460 nm。用10 μmol/L Cell Tracker Blue CMF2HC孵育牛MⅡ卵母細(xì)胞20 min標(biāo)記胞內(nèi)GSH，用mPBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)光為370 nm。用EZ-C1軟件分析ROS和GSH熒光強(qiáng)度值。

1.4.4 卵母細(xì)胞發(fā)育能力 取1.3冷凍-解凍恢復(fù)培養(yǎng)2 h的對(duì)照組及2-APB組牛MⅡ卵母細(xì)胞，用成熟24 h未冷凍的卵母細(xì)胞作為新鮮對(duì)照組(Fresh組)，進(jìn)行孤雌激活，檢測(cè)各組卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。將各組卵母細(xì)胞放入含有7%乙醇的成熟培養(yǎng)液中激活5 min，再放入2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)液中于38.8 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。充分洗滌后放入孤雌胚胎發(fā)育液中繼續(xù)培養(yǎng)。孤雌激活當(dāng)天記為第0天，激活后第2、7 d分別統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 2-APB預(yù)處理對(duì)冷凍-解凍牛卵母細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，2-APB組冷凍-解凍后牛卵母細(xì)胞解凍后(0 h)和恢復(fù)培養(yǎng)2 h的存活率均顯著增加(P<0.05)(圖1)。

*，差異顯著(P<0.05)。圖3同

2.2 2-APB對(duì)冷凍卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布的影響

由表1、圖2可知，與對(duì)照組相比，2-APB組皮質(zhì)顆粒在皮質(zhì)區(qū)的分布比例顯著提高(P<0.05)，皮質(zhì)顆粒在胞質(zhì)內(nèi)彌散分布比例顯著降低(P<0.05)；皮質(zhì)顆粒部分釋放和完全釋放的比例在2組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

A，皮質(zhì)區(qū)分布：皮質(zhì)顆粒在質(zhì)膜下皮質(zhì)外圍呈單層環(huán)形；B，部分釋放：皮質(zhì)顆粒在質(zhì)膜下皮質(zhì)外圍分布，但不連續(xù)；C，彌散分布：皮質(zhì)顆粒聚集成形狀不規(guī)則的小團(tuán)，彌散分布在胞質(zhì)中；D，完全釋放：在皮質(zhì)區(qū)幾乎觀察不到皮質(zhì)顆粒

表1 各組冷凍卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒的分布比例

2.3 2-APB對(duì)冷凍卵母細(xì)胞ROS和GSH含量的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，2-APB組胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)，2-APB組胞質(zhì)內(nèi)GSH含量顯著升高(P<0.05)。

圖3 各組牛卵母細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH的相對(duì)含量

2.4 2-APB對(duì)冷凍后卵母細(xì)胞孤雌激活發(fā)育能力的影響

由表2可知，與Fresh組相比，對(duì)照組卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，2-APB組孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率均顯著提高(P<0.05)，且2-APB組與Fresh組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 各組冷凍卵母細(xì)胞孤雌激活的發(fā)育潛力

3 討 論

Ca2+作為第二信使在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)許多生命過程，因此細(xì)胞內(nèi)嚴(yán)格的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控對(duì)維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)至關(guān)重要。胞內(nèi)持續(xù)的[Ca2+]i濃度升高，可激活磷脂酶、蛋白酶和核酸內(nèi)切酶，造成細(xì)胞生物膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)系統(tǒng)受損，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡[17]。研究報(bào)道，玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育能力，這一現(xiàn)象與冷凍過程中低溫或抗凍保護(hù)劑(如DMSO、EG)引起胞內(nèi)[Ca2+]i異常升高有關(guān)[9]。為了提高冷凍保存效率，研究者去除冷凍液中的Ca2+并加入Ca2+螯合劑BAPTA，降低胞內(nèi)[Ca2+]i濃度，可顯著提高冷凍卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[11,18]，這與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)在不含Ca2+的冷凍液中玻璃化冷凍保存卵母細(xì)胞，冷凍前采用2-APB處理可顯著提高解凍后的存活率和孤雌胚胎的發(fā)育能力。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒的正確分布與卵母細(xì)胞質(zhì)量和后期胚胎發(fā)育能力密切相關(guān)[19]。研究報(bào)道，牛[19]、小鼠[20]、豬[21-22]、綿羊[23]MⅡ期卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒在皮質(zhì)區(qū)呈單層環(huán)形分布。受精時(shí)卵母細(xì)胞激活，皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物從卵母細(xì)胞的皮質(zhì)釋放到卵周隙，使皮質(zhì)顆粒在皮質(zhì)外圍的單層環(huán)形分布消失，透明帶硬化，對(duì)阻止多精入卵具有重要作用[24]。這種使卵母細(xì)胞激活、發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)的機(jī)制與胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高息息相關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍保存MⅡ期卵母細(xì)胞常發(fā)生皮質(zhì)顆粒提前釋放的異?，F(xiàn)象[26]，導(dǎo)致透明帶硬化，影響受精效果[27]。分析其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍液中的DMSO和EG均可引起胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高，并與受精時(shí)[Ca2+]i濃度增加量相當(dāng)，可以引起皮質(zhì)反應(yīng)[28]。研究表明，使用無(wú)Ca2+的玻璃化冷凍液可顯著降低EG引起的胞內(nèi)[Ca2+]i增加，但對(duì)于DMSO引起的[Ca2+]i濃度升高并無(wú)影響[9]，揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)是胞內(nèi)[Ca2+]i增加的主要原因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R是主要的鈣釋放通道，對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)維持起核心作用[29]。2-APB作為IP3R抑制劑，可阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)向胞漿釋放Ca2+，從而阻止胞內(nèi)[Ca2+]i濃度異常升高[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍使卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒損傷型分布比例顯著升高，然而冷凍前用2-APB處理顯著提高皮質(zhì)顆粒的皮質(zhì)區(qū)分布比例。表明2-APB可有效阻斷IP3R鈣通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)向胞漿中釋放Ca2+，與BAPTA螯合效果一致[11]，顯著降低胞內(nèi)[Ca2+]i濃度，阻止皮質(zhì)顆粒提前釋放。

ROS是分子氧在還原過程中的中間產(chǎn)物，具有雙重生物學(xué)效應(yīng)。生理劑量的ROS有利于卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育，而在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中，由于氧濃度、機(jī)械處理及其他因素的影響，產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而損傷生物膜，抑制蛋白質(zhì)和酶類的功能，且出現(xiàn)線粒體功能異常、DNA損傷[31]，從而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育能力[32]。研究發(fā)現(xiàn)，ROS如過氧化氫或過氧化物可通過改變Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)通道的功能調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)[33]。研究表明，用H2O2處理人卵母細(xì)胞可引起胞內(nèi)[Ca2+]i濃度短暫升高[34]。另有研究證明，玻璃化冷凍可引起胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體功能異常，從而產(chǎn)生大量ROS導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[35]。可見，ROS的產(chǎn)生與胞內(nèi)[Ca2+]i濃度異常升高有關(guān)。本試驗(yàn)采用2-APB處理卵母細(xì)胞，顯著降低了ROS水平，說(shuō)明2-APB阻斷了IP3R鈣通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)向胞漿釋放Ca2+。此外，GSH作為清除氧自由基的清道夫，在細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)中起著重要作用，是卵母細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志，對(duì)后期胚胎發(fā)育至關(guān)重要[36]。本研究玻璃化冷凍卵母細(xì)胞前用2-APB處理，阻斷IP3R鈣通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)向胞漿中釋放Ca2+可維持鈣穩(wěn)態(tài)平衡，顯著提高胞內(nèi)GSH含量，從而提高孤雌激活胚胎發(fā)育能力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在無(wú)Ca2+玻璃化冷凍液中，冷凍保存前用2-APB處理卵母細(xì)胞，可提高卵母細(xì)胞的存活率及卵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量，降低卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒損傷型分布比例和胞內(nèi)ROS含量，從而改善冷凍-解凍后卵母細(xì)胞質(zhì)量及后期胚胎發(fā)育能力。