丁麗艷

摘要：牛體外受精技術(shù)是胚胎生物工程技術(shù)研究的基礎(chǔ)，其中牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是體外受精技術(shù)的關(guān)鍵，也是重要環(huán)節(jié)。自上世紀(jì)三十年代以來，國內(nèi)外研究者們都付出了大量的研究工作，并取得了較大研究進(jìn)展。目前，牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系已經(jīng)確立，但其中的卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育阻滯，卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控機(jī)理等問題，還有待研究者們進(jìn)一步深入探討。本文主要從牛卵丘卵母細(xì)胞的獲得方法、體外培養(yǎng)條件、體外培養(yǎng)液及添加物、存在問題等幾方面來綜述其研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：牛；卵丘卵母細(xì)胞；體外培養(yǎng)

牛卵丘母細(xì)胞體外成熟是在牛體外模擬卵泡環(huán)境，進(jìn)而誘發(fā)未成熟卵母細(xì)胞成熟的一項(xiàng)生物技術(shù)。其是牛體外受精（IVF）的基礎(chǔ)，也是重要環(huán)節(jié)之一，牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量直接影響其體外受精效果，甚至是影響出生牛犢的質(zhì)量。本文就牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟研究現(xiàn)狀、研究方法、體外成熟的判定和存在問題等進(jìn)行論述。

1 研究現(xiàn)狀

有關(guān)專家于1935年利用兔卵泡中分離出來的卵丘卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)成功減數(shù)分裂后，完成了兔卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟過程。此后，哺乳動(dòng)物的卵丘卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。目前，卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)生殖工程和畜牧生產(chǎn)中。牛未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，體外成熟率可達(dá)90%以上。然而，體外成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育潛能與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比仍有較大差距，體外成熟的卵母細(xì)胞存在細(xì)胞質(zhì)成熟差或者細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟并不同步等問題。針對(duì)目前牛體外受精研究中出現(xiàn)的問題，有關(guān)專家認(rèn)為，牛卵丘卵母細(xì)胞在成熟過程中退化以及細(xì)胞質(zhì)不完全成熟是造成其體外受精胚胎生產(chǎn)效率低的主要原因。

2 研究方法及進(jìn)展

2.1 牛卵丘卵母細(xì)胞的獲得

2.1.1 從廢棄的牛卵巢中獲得

即運(yùn)用切割法或抽吸法等機(jī)械分離法從屠宰場(chǎng)廢棄的牛卵巢上獲取未成熟的卵母細(xì)胞。將收集卵巢置于25～35℃的生理鹽水中，添加抗生素，3小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將術(shù)者的手和母牛的卵巢消毒后，將卵巢上多余的肉割掉，用裝有18號(hào)針頭的5毫升注射器，從卵巢表面直徑為2～6毫米卵泡中抽取卵母細(xì)胞，也可用消毒的手術(shù)刀片切割卵巢，回收卵母細(xì)胞。

此方法中卵巢保存溫度對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量影響較大，此方法獲得的卵母細(xì)胞成本低，但由于淘汰的牛大多無系譜，難以做到良種化。

2.1.2 應(yīng)用?；铙w采卵技術(shù)采集卵丘卵母細(xì)胞

?；铙w采卵技術(shù)是繼牛體外受精、胚胎移植（ET）技術(shù)之后研究并推出的又一項(xiàng)胚胎工程技術(shù)。牛的活體采卵技術(shù)于90年代后期開始研究，2001年，活體采卵、體外受精的牛胚胎移植后成功獲得犢牛出生。此項(xiàng)新技術(shù)與IVF及ET技術(shù)的配套綜合利用，將更充分地挖掘優(yōu)良母牛的遺傳潛力，縮短牛的世代間隔，擴(kuò)大遺傳背景清楚、價(jià)格低廉的胚胎來源，從而加速養(yǎng)牛業(yè)的遺傳改良。同時(shí)，也可為牛的基因工程研究提供大量的試驗(yàn)材料，以促進(jìn)動(dòng)物基因工程研究迅速發(fā)展。

2.2 活體采卵的方法

活體采卵的方法主要有盲采法、內(nèi)窺鏡法和超聲波法。

盲采法完全依賴操作者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，采集結(jié)果不穩(wěn)定，回收率低，且對(duì)卵巢和陰道組織損傷比較大，延長了采卵間隔，降低了采卵頻率，因此限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

內(nèi)窺鏡法可直觀、準(zhǔn)確地對(duì)卵泡進(jìn)行穿刺，對(duì)卵巢損傷很小，但對(duì)陰道穹隆損傷比較大，且設(shè)備復(fù)雜，操作繁瑣。

超聲波法借助B超采集卵母細(xì)胞，是最主要的活體卵方法之一。

3 牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟首次由某位外國研究者完成， 但這僅限于核的成熟。牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟的胚胎發(fā)育潛能直到1978 年才通過體內(nèi)受精獲得犢牛證實(shí)。1986年，有關(guān)專家報(bào)道了牛卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟及體外受精獲得的試管犢牛，進(jìn)一步確證了體外成熟牛卵母細(xì)胞的可行性。

3.1 成熟培養(yǎng)液

目前，用于牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟的基礎(chǔ)培養(yǎng)液多為TCM199，也有的使用Ham's F-10， MEM， TALP等培養(yǎng)液。

3.2 培養(yǎng)液中的添加物

3.2.1 血清

血清中含有蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、激素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)和多肽類因子，是卵丘卵母細(xì)胞體外成熟與受精所必需的物質(zhì)，能有效提高牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟率。隨著研究的深入，人們了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡體外生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)以外，也存在抑制卵泡生長的因素。因此，近年來研究用牛血清白蛋白或白蛋白來代替血清添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，起到很好的培養(yǎng)效果。

3.2.2 激素

目前，絕大多數(shù)研究者在牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)中添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物，結(jié)果都對(duì)卵母細(xì)胞成熟起到了促進(jìn)作用。培養(yǎng)液中添加激素能夠刺激腔前卵泡的生長及腔的形成，并且抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，而在無激素的培養(yǎng)液中卵母細(xì)胞成熟率顯著降低，且退化量大大增加。

3.2.3 生長因子

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加各種生長因子和細(xì)胞因子，如胰島素、表皮生長因子 、胰島素生長因子 、白血病抑制因子 、轉(zhuǎn)化生長因子 等，對(duì)卵母細(xì)胞的生長、成熟可起到重要的調(diào)節(jié)作用。生產(chǎn)因子是卵母細(xì)胞成熟的誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟。

3.2.4 卵泡液

卵泡液能夠提高成熟卵母細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)量，同時(shí)，控制卵泡液在培養(yǎng)液中的添加濃度，可以消除其對(duì)核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液對(duì)核成熟的抑制作用與所采卵泡的大小有關(guān)。來自小卵泡（ 小于3毫米） 和中卵泡（3～8毫米） 的卵泡液抑制卵母細(xì)胞核成熟，大卵泡液（大于8毫米） 對(duì)核成熟沒有抑制作用。

3.2.5 卵丘細(xì)胞

卵丘細(xì)胞能夠增加卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（ GSH）含量，GSH具有促進(jìn)精子穿卵、雄原核形成及提高組蛋白H1活性等功能。在卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在間隙連接，一些小分子物質(zhì)如離子、核酸、氨基酸等可在兩者之間交換，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，卵丘細(xì)胞能促進(jìn)卵母細(xì)胞體外減數(shù)分裂的恢復(fù)，并且對(duì)發(fā)生GVBD后至排出PB1也起著重要作用。

3.2.6 鈣離子

細(xì)胞內(nèi)Ca2+可以使無活性的促進(jìn)因子，處于激活狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟分裂。

3.3 培養(yǎng)條件

3.3.1 氣相條件

體外培養(yǎng)一般采用含5%CO2的空氣，或5%CO2、5%O2、90%N2的氣體。培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)CO2不僅可以平衡培養(yǎng)基，而且還有助于細(xì)胞代謝中的丙酮酸轉(zhuǎn)換成草酰乙酸，有利于細(xì)胞成熟。

3.3.2 溫度條件

不同的溫度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響很大，過高或過低的溫度均不利于卵母細(xì)胞的體外成熟。牛卵母細(xì)胞一般采用39℃進(jìn)行體外培養(yǎng)。

3.3.3 濕度

對(duì)于濕度的調(diào)節(jié)，一般需在CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)放置調(diào)濕盤，以維持99%～100%的相對(duì)濕度，防止因培養(yǎng)液蒸發(fā)改變培養(yǎng)基成分的濃度，影響pH值和滲透壓。

4 牛卵丘卵母細(xì)胞體外成熟的判定

牛卵丘卵母細(xì)胞的成熟是涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、膜、卵丘細(xì)胞和透明帶等成熟的復(fù)雜生物學(xué)過程。在形態(tài)上表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質(zhì)高度濃縮形成染色體，第一極體釋放，細(xì)胞器重組，以及卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、膨脹、液化和透明帶軟化等。近年來研究者借助光鏡和電鏡逐漸揭示出這一生理生化過程的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。由于僅有核成熟和卵丘細(xì)胞成熟能在光鏡下進(jìn)行判定，而對(duì)卵母細(xì)胞的綜合成熟過程很難做一整體的具有生理學(xué)意義的評(píng)價(jià)，因而現(xiàn)在主要是以卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，并釋放出第一極體作為卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的判定標(biāo)準(zhǔn)。

5 存在問題與展望

經(jīng)過人們大量研究與探討，牛卵丘卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)逐漸被掌握，并得到了不斷提高，同時(shí)也存在諸多問題，如卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育阻滯，體外成熟卵母細(xì)胞的受精率較低，卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控機(jī)理還不完全清楚等，但是，相信隨著研究的不斷深入，存在的問題會(huì)逐步被解決，同時(shí)，隨著牛卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其必將推動(dòng)牛體外受精技術(shù)的深入發(fā)展，并且，進(jìn)一步促進(jìn)核移植、外源基因?qū)牒团咛ジ杉?xì)胞的研究，為促使牛胚胎操作技術(shù)的深入和牛體外受精胚胎商業(yè)化的普及，提供更有利研究和應(yīng)用手段。