郭 玲，楊 芳，郭安良，劉 雯，沈彥軍，李 莉，代彩鳳*，鄧曉惠*

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，濟(jì)南 250012；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012)

隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)方案的不斷改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)室胚胎培育技術(shù)的進(jìn)一步完善，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的成功率不斷提高，其著床率可高達(dá)60%[1]。但是仍有相當(dāng)一部分患者在經(jīng)歷多次優(yōu)質(zhì)胚胎移植后未能獲得臨床妊娠，臨床上稱之為反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)，已成為限制ART發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。目前RIF的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一[2]。2014年Coughlan等[3]提出RIF的診斷標(biāo)準(zhǔn)，40歲以下不孕癥婦女，至少經(jīng)歷3周期新鮮或凍融胚胎移植，累計(jì)移植不少于4枚優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲得臨床妊娠。國(guó)內(nèi)通常參考2018年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查專家共識(shí)》將RIF定義為：經(jīng)歷3次以上胚胎移植，或移植不少于4～6枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或3枚優(yōu)質(zhì)囊胚而未獲得臨床妊娠[4]。RIF的影響因素眾多且復(fù)雜，主要可分為配子及胚胎質(zhì)量異常、子宮內(nèi)膜容受性下降和其他混合因素等[5]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前研究大多聚焦于母-胎界面的分子層面，但關(guān)于患者自身病理因素在胚胎種植中影響的報(bào)道較少。本研究通過(guò)回顧分析不孕癥患者的年齡、不孕類型、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、人工流產(chǎn)次數(shù)、抗繆勒管激素(antimullerian hormone，AMH)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、甲狀腺功能、自身免疫抗體相關(guān)指標(biāo)、染色體核型、宮腔鏡檢查、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度和宮腔深度等因素與RIF的關(guān)系，明確RIF發(fā)生的臨床高危因素，以期為RIF的早期病因篩查及早期治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性研究2018年8月至2020年2月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI治療的不孕癥患者的臨床資料。根據(jù)胚胎移植后的妊娠結(jié)局，分為RIF組(222例)和對(duì)照組(567例)。RIF組納入標(biāo)準(zhǔn)：至少經(jīng)歷3個(gè)周期，新鮮或凍融移植周期累計(jì)至少移植4枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或3枚囊胚仍未獲得臨床妊娠者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：第1次行IVF/ICSI-ET助孕即成功獲得妊娠者。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)可供移植的優(yōu)質(zhì)胚胎；嚴(yán)重生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常；明確精神疾病病史；存在ART及妊娠禁忌證或合并其他對(duì)妊娠有重大影響疾病的患者。本研究已獲得山東大學(xué)齊魯醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 IVF過(guò)程 研究對(duì)象均采用標(biāo)準(zhǔn)化的卵巢刺激方案，主要包括經(jīng)典長(zhǎng)方案、長(zhǎng)方案、短方案、微刺激方案、拮抗劑方案等。根據(jù)患者的年齡、BMI以及卵巢功能等個(gè)體化啟用Gn，通過(guò)超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，并結(jié)合血清性激素水平及時(shí)調(diào)整Gn用法和用量。當(dāng)至少有2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡平均直徑≥18mm時(shí)，應(yīng)用絨毛膜促性腺激素(HCG)(絨毛膜促性腺激素注射液，珠海麗珠醫(yī)藥公司)6000～10000IU肌肉注射，或促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)(達(dá)必佳，德國(guó)輝凌制藥公司)0.2mg皮下注射，或GnRH-a 0.2mg皮下注射及HCG 1000～2000IU肌肉注射誘發(fā)排卵，并于扳機(jī)后34～36h取卵。取卵后4～6h，根據(jù)精子質(zhì)量，采用IVF或ICSI受精。取卵后立即給予黃體支持，根據(jù)胚胎培養(yǎng)情況，于取卵后第3天或第5天選擇最多2枚胚胎進(jìn)行移植，剩余胚胎冷凍保存。

1.2.2 妊娠結(jié)局判斷 結(jié)合患者的個(gè)體情況或其他因素進(jìn)行胚胎移植，包括新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植?；颊哂谠缙谂咛ヒ浦埠?4日或囊胚移植后11～12日測(cè)定血清β-HCG，若β-HCG<10IU/L，則判定為未妊娠；若β-HCG≥10IU/L，且2～3周后經(jīng)超聲檢查可探及宮內(nèi)妊娠囊和胎心搏動(dòng)，則判定為臨床妊娠，否則為生化妊娠。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)一般臨床資料：年齡、不孕類型、不孕年限、BMI、人工流產(chǎn)次數(shù)、AMH、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、甲狀腺功能三項(xiàng)、雙方染色體核型、宮腔鏡檢查、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度和宮腔深度等；(2)自身免疫抗體相關(guān)指標(biāo)：抗甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TG-Ab)、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(anti-thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody，ACA)、抗β2-糖蛋白I抗體(anti-β2 glycoprotein I antibody，β2-GPΙ-Ab)。

2 結(jié) 果

2.1 患者的一般臨床資料 RIF組的年齡、不孕年限、繼發(fā)性不孕比例、人工流產(chǎn)次數(shù)≥2次比例、基礎(chǔ)FSH、宮腔鏡檢查異常比例均高于對(duì)照組，AMH、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 RIF組與對(duì)照組患者的一般臨床資料比較

2.2 自身免疫性抗體比較 RIF組的TG-Ab陽(yáng)性比例、ANA陽(yáng)性比例、β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性比例均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 RIF組與對(duì)照組患者的自身免疫抗體相關(guān)指標(biāo)比較[n(%)]

2.3 多因素logistic回歸分析 將上述具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素分別賦值(表3)，納入多因素logistic回歸模型。多因素分析顯示，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、低AMH水平、宮腔鏡檢查異常、ANA陽(yáng)性、β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性等因素是RIF的危險(xiǎn)因素，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表3 RIF影響因素賦值說(shuō)明

表4 多因素logistic回歸分析RIF的危險(xiǎn)因素

2.4 ROC曲線分析 logistic回歸分析顯示，所得模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=120.104，P<0.001)；Hosmer和Lemeshow檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.227)，提示擬合良好。采用ROC曲線評(píng)價(jià)多因素logistic回歸預(yù)測(cè)模型，AUC=0.737(95%CI為0.697～0.777，P<0.001)，提示所建立的預(yù)測(cè)模型效果較好(圖1)。

圖1 logistic回歸預(yù)測(cè)模型的ROC曲線

3 討 論

胚胎植入是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，其成功的關(guān)鍵在于高質(zhì)量胚胎與良好子宮內(nèi)膜容受性之間的相互作用[6]，主要包括胚泡定位、黏附和侵入等一系列過(guò)程。隨著胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)技術(shù)的發(fā)展，約有70%的胚胎被鑒定為高質(zhì)量胚胎[7]，因此母體自身病理因素與胚胎RIF的發(fā)生密切相關(guān)。臨床實(shí)踐中，部分研究者主張針對(duì)RIF患者進(jìn)行大量臨床病因篩查，包括血栓形成傾向、免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞亞群及多種血清學(xué)和子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞因子譜等檢查[8-11]，但其對(duì)RIF診斷和預(yù)測(cè)的意義仍存在較大爭(zhēng)議。RIF對(duì)不孕癥患者和家庭造成了巨大的身心和經(jīng)濟(jì)壓力，而深入分析和預(yù)測(cè)RIF發(fā)生的臨床相關(guān)高危因素可為患者提供合理的臨床管理策略，對(duì)于其獲得良好的妊娠結(jié)局具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常、ANA陽(yáng)性、β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性等是RIF的危險(xiǎn)因素，AMH是RIF的保護(hù)因素。

3.1 不孕年限及不孕類型對(duì)胚胎種植的影響 研究表明，隨著不孕年限增加，精子可出現(xiàn)頂體蛋白活性下降、核染色質(zhì)不成熟等，使不孕癥夫婦精卵結(jié)合障礙的可能性升高[12]，從而導(dǎo)致胚胎種植失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF組患者的不孕年限高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與既往研究結(jié)果較一致。Devine等[13]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性不孕與IVF助孕失敗相關(guān)。本研究結(jié)果提示，RIF組患者繼發(fā)性不孕比例(69.37% vs 47.62%)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析原因可能與本研究樣本量相對(duì)較少，且RIF組患者平均年齡高于對(duì)照組有關(guān)。隨著年齡升高，卵巢儲(chǔ)備下降，繼發(fā)性不孕比例增加，子宮內(nèi)膜容受性下降使胚胎著床失敗的可能性增加[14]。經(jīng)多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，不孕年限(OR=1.098，95%CI為1.027～1.174，P=0.006)和繼發(fā)性不孕(OR=1.763，95%CI為1.209～2.570，P=0.003)與RIF的發(fā)生密切相關(guān)，但其確切作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.2 血清AMH水平對(duì)胚胎種植的影響 AMH是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的成員之一，可由卵巢顆粒細(xì)胞分泌[15]。研究表明，AMH在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和組織修復(fù)再生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。目前在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，血清AMH測(cè)定被廣泛用于卵巢功能、COH、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的評(píng)估和預(yù)測(cè)[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMH表達(dá)水平過(guò)低，可抑制蛻膜化進(jìn)程，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致RIF發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者的血清AMH水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，AMH是RIF發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.932，95%CI為0.882～0.984，P=0.011)，與既往研究結(jié)果較一致。

3.3 宮腔鏡檢查對(duì)胚胎種植的影響 宮腔鏡檢查被認(rèn)為是宮腔內(nèi)病變?cè)u(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)，目前在RIF的診斷和治療中也被廣泛應(yīng)用[20]。研究表明，RIF患者中宮腔鏡檢查異常發(fā)生率高達(dá)30%～40%[21]，其中與胚胎種植密切相關(guān)的最常見(jiàn)的宮腔內(nèi)病變主要包括宮腔粘連、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉和黏膜下肌瘤等[22]。多項(xiàng)研究表明，RIF患者在胚胎移植前行宮腔鏡檢查可顯著提高新鮮和冷凍周期的胚胎種植率[23-25]。部分研究發(fā)現(xiàn)，即使在宮腔鏡檢查正常的患者中，通過(guò)宮腔鏡檢查也可提高RIF患者的臨床妊娠率[26]。然而，El-Toukhy等[27]研究發(fā)現(xiàn)，行宮腔鏡檢查的RIF患者中宮腔異常比例高達(dá)26%，但其中超過(guò)20%的宮腔病變無(wú)法通過(guò)常規(guī)治療加以糾正，且RIF患者是否行宮腔鏡檢查對(duì)移植后活產(chǎn)率并無(wú)影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，RIF患者宮腔鏡檢查異常比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，宮腔鏡檢查異常是RIF發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=1.648，95%CI為1.129～2.407，P=0.010)，與既往研究結(jié)果較一致。本研究為回顧性分析，關(guān)于RIF患者ART周期前行宮腔鏡檢查可否改善臨床妊娠率仍有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

3.4 自身免疫抗體對(duì)胚胎種植的影響 多項(xiàng)研究表明，先天性免疫、適應(yīng)性免疫及外周免疫系統(tǒng)之間的協(xié)調(diào)平衡是妊娠成功的基礎(chǔ)條件[28-29]。近年來(lái)隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，自身免疫性抗體異常導(dǎo)致的胚胎種植失敗受到越來(lái)越多的關(guān)注，但對(duì)于多種自身免疫性抗體與IVF-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的關(guān)系，目前尚未達(dá)成共識(shí)[30]。研究認(rèn)為，ACA可通過(guò)引起局部微血栓形成，影響子宮內(nèi)膜容受性[31]。ANA可通過(guò)損傷卵母細(xì)胞并干擾胚胎細(xì)胞分裂導(dǎo)致胚胎種植失敗[32]。β2-GPΙ-Ab可通過(guò)損傷滋養(yǎng)細(xì)胞，誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，形成血栓，從而對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響[33-34]。有研究發(fā)現(xiàn)，外周血中ACA、ANA和β2-GPΙ-Ab高表達(dá)是RIF發(fā)生的高危因素[35]。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺自身免疫性疾病(thyroid autoimmunity，TAI)與RIF的發(fā)生密切相關(guān)[31]。TAI不僅可通過(guò)甲狀腺功能障礙影響胚胎種植，同時(shí)甲狀腺自身免疫抗體可引起機(jī)體免疫紊亂，從而導(dǎo)致胚胎著床失敗。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者的TG-Ab陽(yáng)性比例、ANA陽(yáng)性比例和β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性比例均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，ANA陽(yáng)性(OR=2.176，95%CI為1.249～3.791，P=0.006)和β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性(OR=2.682，95%CI為1.862～3.862，P<0.001)與RIF的發(fā)生密切相關(guān)。但本研究?jī)H納入了ANA、ACA、β2-GPΙ-Ab、TG-Ab和TPO-Ab五項(xiàng)自身免疫性抗體指標(biāo)，未來(lái)仍有待于進(jìn)一步完善其他多種自身免疫抗體對(duì)胚胎種植的影響。

綜上所述，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常、ANA陽(yáng)性、β2-GPΙ-Ab陽(yáng)性等因素是RIF的危險(xiǎn)因素，AMH是RIF的保護(hù)因素。針對(duì)相關(guān)危險(xiǎn)因素建立logistic回歸預(yù)測(cè)模型，對(duì)RIF病因篩查、診斷及針對(duì)性干預(yù)高危人群具有重要的臨床指導(dǎo)意義。但由于本研究為單一中心的回顧性研究，且研究納入樣本量相對(duì)較小，未來(lái)仍需大樣本前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)加以評(píng)估和驗(yàn)證。