尹滿群,黃守國,張 靜,符建桃

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，?？?570000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrical carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病年齡逐步年輕化，發(fā)病人數(shù)也明顯增多。盡管子宮內(nèi)膜癌的診斷和傳統(tǒng)治療的進展都在加快，但子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的生物學(xué)和分子機制研究相對匱乏。因此，識別新的生物標(biāo)志物和探索治療靶點可能對子宮內(nèi)膜癌患者的個體化治療策略有一定的指導(dǎo)意義。近年來關(guān)于T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(tlymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，TIAM1)與干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19,GRIM19)和多種實體腫瘤的關(guān)系也日益得到證實。TIAM1可增強細(xì)胞遷移、黏附與侵入，促進細(xì)胞骨架重組、改變細(xì)胞形態(tài)等，還可參與蛋白質(zhì)相互作用，以及抑制轉(zhuǎn)錄因子c-myc表達(dá),從而影響細(xì)胞增殖、凋亡、黏附與遷移,發(fā)揮促癌作用[1-2]。GRIM19主要通過與STAT3發(fā)生特異性相互作用，從而抑制其轉(zhuǎn)錄激活活性和靶基因表達(dá),干擾STST3激活的下游抗凋亡通路中各個基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-xl、cyclin、c-myc、c-Jun，還可參與線粒體氧化呼吸過程,從而影響細(xì)胞的生長和增殖[3]。多項研究證實，TIAM1和GRIM19在多種婦科惡性腫瘤及腺癌中均有特異表達(dá)，并與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，有望成為監(jiān)測腫瘤疾病進展及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。但TIAM1和GRIM19與I型子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系尚不明確。本研究采用免疫組化檢測TIAM1、GRIM19在I型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)進而分析其臨床意義及預(yù)后影響，以期為I型子宮內(nèi)膜癌的診治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2014年6月至2018年6月在?？谑腥嗣襻t(yī)院行手術(shù)切除治療且術(shù)后病理結(jié)果明確為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌患者70例，年齡32～77歲(54.2±9.69)歲?；颊呔腥訉m切除術(shù)+雙側(cè)附件切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。選取同期子宮內(nèi)膜不典型增生組24例，年齡35～65歲(50.10±5.23)歲；子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生組20例，年齡36～59歲(49.5±6.85)歲，正常子宮內(nèi)膜組(因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且排除內(nèi)膜病變)28例，年齡45～69歲(52.4±4.58)歲。4組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入對象臨床資料完整，不合并其他系統(tǒng)腫瘤，術(shù)前未行任何放化療、生物治療等抗腫瘤治療。子宮內(nèi)膜癌患者中，<50歲23例,≥50歲47例；高分化18例,中、低分化52例；手術(shù)病理分期:早期病變(Ⅰ期46例和Ⅱ期6例)52例,晚期病變(Ⅲ期和Ⅳ期)18例；<1/2肌層浸潤深度38例，≥1/2肌層浸潤深度32例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54例。所有存檔蠟塊均重新做常規(guī)HE染色且由2名副高病理醫(yī)生復(fù)查篩選后入組。

1.2 隨訪 截至2021年6月，通過電話或門診對子宮內(nèi)膜癌患者進行隨訪，以影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移癌灶為無瘤生存終點，隨訪率100%，隨訪時間3～82個月，中位隨訪時間58個月。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑 兔單克隆抗體TIAM1購自ABclonal公司,兔單克隆抗體[EPR14515(2)]GRIM19購自Abcam公司，SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新，圖像采集采用顯微鏡及多功能圖像分析工作站(OLYMPUS，CX21，日本)。

1.3.2 免疫組化檢測TIAM1、GRIM19蛋白表達(dá) 將組織蠟塊進行石蠟切片，厚約4μm。經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水，EDTA液與蒸餾水的比例為1∶50加壓修復(fù)，PBS沖洗3遍，滴加TIAM1及GRIM19一抗，37℃暖箱孵育1h，再用PBS沖洗3遍，滴加二抗15min，PBS沖洗3遍，DAB工作液顯色5min，水洗，蘇木素染色，水洗，分化1s，水洗，返藍(lán)，流水沖洗，脫水，吹干，封片。陰性對照為未加一抗的PBS緩沖液，陽性對照為正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜非不典型增生組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織，每批染色均設(shè)置陰性和陽性對照。隨機選取10個高倍視野，每個高倍視野觀察100個細(xì)胞，計數(shù)著色細(xì)胞數(shù)及著色程度，著色細(xì)胞數(shù)計分分為5個等級：≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%，分別計為0、1、2、3、4分；著色強度計分:無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別計為0、1、2、3分。兩種分值相乘，0分為陰性(-),1～3分為弱陽性(+),4～8分為中等陽性(++),9～12分為強陽性(+++)。按免疫組化結(jié)果分為兩組，總積分0～4分為低表達(dá)，≥5分為高表達(dá)。所有切片均由2名病理科副高職稱醫(yī)生采用雙盲法單獨閱片，取兩人計分平均值。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜組織中TIAM1和GRIM19表達(dá)水平比較 TIAM1蛋白在正常子宮內(nèi)膜中呈低表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)且主要定位在細(xì)胞內(nèi)(膜、漿)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒彌漫性分布。見圖1。TIAM1在正常子宮內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生組、子宮內(nèi)膜不典型增生組、Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組中高表達(dá)率分別為28.57%(8/28)，45.00%(7/20)，62.50%(15/24)，70.00%(49/70)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；子宮內(nèi)膜癌高于正常組和增生不伴不典型增生組，不典型增生組高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；而Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組與子宮內(nèi)膜不典型增生組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 子宮內(nèi)膜組織中TIAM1及GRIM19蛋白表達(dá)水平

表2 子宮內(nèi)膜組織中TIAM1、GRIM19表達(dá)陽性率比較[n(%)]

GRIM19在正常子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)且主要定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒彌漫分布。見圖1。GRIM19在正常子宮內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生組、子宮內(nèi)膜不典型增生組、I型子宮內(nèi)膜癌組中高表達(dá)率分別為96.43%(27/28)，80.00%(16/20)，62.50%(15/24)，45.70%(32/70)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；子宮內(nèi)膜癌組GRIM19高表達(dá)率低于正常組和增生不伴不典型增生組，不典型增生組低于正常組(P均<0.05)；而I型子宮內(nèi)膜癌組與子宮內(nèi)膜不典型增生組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

圖1 免疫組化檢測TIAM1、GRIM19蛋白表達(dá)(×100)

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1及GRIM19蛋白表達(dá)相關(guān)性 子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1及GRIM19蛋白表達(dá)明顯相關(guān)(r=-0.373，P<0.05)。見表3。

表3 子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1及GRIM19蛋白表達(dá)相關(guān)性

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1和GRIM19表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1蛋白表達(dá)與分化程度、肌層浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、手術(shù)病理分期、脈管轉(zhuǎn)移、絕經(jīng)、合并高血壓、合并輸卵管堵塞無明顯相關(guān)(P>0.05)。GRIM19蛋白表達(dá)與分化程度、手術(shù)病理分期、肌層浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否合并高血壓組、是否發(fā)生脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),而與年齡、有無合并輸卵管堵塞、是否絕經(jīng)、產(chǎn)次無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4 研究組患者子宮內(nèi)膜腺癌組織中TIAM1、GRIM19表達(dá)與臨床病理參數(shù)

2.4 子宮內(nèi)膜癌患者生存率的單因素分析 隨訪子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后近3年生存情況，其中存活57例，死亡13例，3年存活率81.43%?；颊叩纳媛逝c手術(shù)病理分期、肌層浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管浸潤及GRIM19表達(dá)水平有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、分化程度、是否絕經(jīng)、是否合并高血壓、TIAM1表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05),見表5。

表5 影響研究組子宮內(nèi)膜癌患者生存率因素

2.4.1 Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗 子宮內(nèi)膜癌患者中GRIM19蛋白高表達(dá)者的總生存期和無瘤生存期均明顯高于GRIM19蛋白低表達(dá)者。GRIM19蛋白高表達(dá)和低表達(dá)組的總生存期分別為(90.665±2.291)月、(67.706±3.668)月,無瘤生存期分別為(89.688±2.954)月、(62.342±5.016)月。Log-rank檢驗結(jié)果顯示,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank分別為6.682和6.251,P分別為0.010和0.012),見圖2A、B。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

2.4.2 術(shù)后輔助放化療與I型子宮內(nèi)膜癌患者的Kaplan-Meier生存曲線 子宮內(nèi)膜癌患者中未放療組和放療組的總生存期分別為(59.541±6.650)月、(78.611±2.779)月,無瘤生存期分別為(50.667±8.995)月、(76.073±3.756)月。Log-rank檢驗結(jié)果顯示，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank分別為6.501和7.473，P分別為0.011和0.006)，見圖2C、D。子宮內(nèi)膜癌患者中未化療組和化療組的總生存期分別為(63.568±7.751)月、(83.301±2.795)月,無瘤生存期分別為(54.625±9.927)月、(80.825±3.844)月。Log-rank檢驗結(jié)果顯示,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank分別為9.936和9.956，P分別為0.002和0.002)，見圖2E、F。

3 討 論

TIAM1定位于21q22.11，含1591個氨基酸殘基，分子量為177kD[4]。多項研究表明,TIAM1在癌癥中充當(dāng)啟動子的角色，TIAM1在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌組織中的表達(dá)水平逐漸升高，并與分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),TIAM1上調(diào)可促進癌癥進展，常預(yù)示生存結(jié)局不良[5]。TIAM1在卵巢癌組織中呈高表達(dá)，明顯高于正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤，TIAM1高表達(dá)與卵巢癌的高組織學(xué)分級、臨床分期晚、轉(zhuǎn)移和低生存期發(fā)生率密切相關(guān)，TIAM1高表達(dá)者的總生存期和無瘤生存期均明顯低于TIAM1低表達(dá)者；此外，miR-1271-5p可直接抑制TIAM1使Notch信號通路失活，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，可見miR-1271-5p/TIAM1可能成為一個新型卵巢癌治療方案[6-8]。TIAM1在肺癌組織中呈高表達(dá)，并與組織類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),TIAM1缺失降低了肺癌細(xì)胞的生存能力和致瘤性，還可作為肺腺癌的獨立預(yù)后因素，TIAM1高表達(dá)常預(yù)示肺癌患者較差的生存結(jié)局[9-11]。研究還發(fā)現(xiàn)，TIAM1在肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤組織中呈高表達(dá)，并與惡性實體瘤患者較短的生存期和多種臨床病理參數(shù)顯著相關(guān),TIAM1上調(diào)還可通過FGFR/STAT3通路使乳腺癌細(xì)胞對NVP-BEZ235產(chǎn)生耐藥性，表明TIAM1可能是一種有前景的預(yù)后生物標(biāo)志物和惡性實體腫瘤的有效治療靶點[12-17]。GRIM19定位于19p13.2,由144個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約16kDa[18]。研究證實，GRIM19在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)并影響腫瘤發(fā)展，GRIM19在胃、結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，并與分化程度和臨床分期密切相關(guān)，GRIM19下調(diào)可加速胃、結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移；體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，GRIM19可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能增強奧沙利鉑治療結(jié)直腸癌的效果。因此，GRIM19是臨床治療胃癌和結(jié)直腸癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點[19-21]。Western blot與免疫組化結(jié)果顯示，GRIM19在卵巢癌中表達(dá)最低，其次是卵巢交界性腫瘤和卵巢良性腫瘤，而在正常卵巢中表達(dá)量高;卵巢上皮癌中GRIM19表達(dá)水平與FIGO分期呈負(fù)相關(guān)，淋巴轉(zhuǎn)移灶中GRIM19和STAT3表達(dá)與原發(fā)灶呈顯著正相關(guān)[22]。此外，GRIM19蛋白和mRNA水平在腎透明細(xì)胞癌組織中下調(diào)，并與TNM分期、Fuhrman分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，這表明GRIM19作為一種腫瘤抑制因子，其缺失促進了腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展和進展[23]。GRIM19在子宮腺肌癥、多發(fā)性硬化癥中也發(fā)揮著重要的作用[24-25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TIAM1在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生、不典型增生、子宮內(nèi)膜癌中呈遞增趨勢，且子宮內(nèi)膜癌組織中TIAM1表達(dá)水平顯著高于正常組和增生不伴不典型增生組，不典型增生組顯著高于正常組，GRIM19則相反；隨著分化程度越差、肌層浸潤越深，TIAM1表達(dá)水平越高，TIAM1表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。這表明TIAM1蛋白在子宮內(nèi)膜癌的形成與演變過程扮演驅(qū)動基因的角色，參與子宮內(nèi)膜病變的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。GRIM19表達(dá)與I型子宮內(nèi)膜癌的分化程度、手術(shù)病理分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。同時生存分析結(jié)果顯示，GRIM19高表達(dá)患者的生存率顯著高于低表達(dá)患者。推測低表達(dá)的GRIM19可能失去了抑癌作用而促進細(xì)胞惡變和轉(zhuǎn)移，這與以往報道在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)論一致[18-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)病理分期Ⅲ～Ⅳ級、深肌層浸潤者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、有脈管浸潤的生存率分別顯著低于Ⅰ～Ⅱ級、淺肌層浸潤者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和無脈管轉(zhuǎn)移者；GRIM19蛋白低表達(dá)患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯少于高表達(dá)患者，提示GRIM19低表達(dá)可成為子宮內(nèi)膜癌患者不良預(yù)后的重要分子指標(biāo)，GRIM19可能成為子宮內(nèi)膜癌臨床診療的潛在治療靶點。因此，監(jiān)測TIAM1和GRIM19表達(dá)水平有望成為監(jiān)測子宮內(nèi)膜癌疾病進展、療效評估與預(yù)后監(jiān)測的一個重要指標(biāo)。

Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中TIAM1呈高表達(dá)，GRIM19呈低表達(dá)，兩者在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面呈相反的作用，分別對Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展起著促進或抑制的作用。TIAM1的促癌機制與GRIM19的抑癌機制有共同作用點，兩者均可通過影響細(xì)胞供能,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡。TIAM1有一個重要的DH功能區(qū)，是Rho樣GFPase的GDP分離刺激因子(GDS)，具有鳥苷酸轉(zhuǎn)換活性，通過GDP-GTP轉(zhuǎn)換，促進GDP的釋放以及與GTP的結(jié)合，調(diào)節(jié)Rho樣GTP酶Rac1活性，刺激葡萄糖的攝取并調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合、細(xì)胞黏附與遷移及細(xì)胞增殖凋亡等[1-2]。GRIM19在線粒體I型呼吸過程中至關(guān)重要，參與了細(xì)胞的供能和凋亡的啟動[3]。兩者促癌機制還與c-myc密切相關(guān)，TIAM1抑制c-myc誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡,GRIM19啟動JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路改變c-myc轉(zhuǎn)錄表達(dá)，影響細(xì)胞增殖和凋亡[2-3]。c-myc是一種參與細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移過程的轉(zhuǎn)錄因子蛋白[26]，在子宮內(nèi)膜癌患者的血清和腫瘤組織中均有高表達(dá)，并與手術(shù)病理分期、浸潤深度、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[27]。本實驗通過Spearman等級相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)，70例Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌織中，TIAM1及GRIM19同時高表達(dá)16例，同時低表達(dá)5例，TIAM1及GRIM19蛋白表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。這提示在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中，TIAM1蛋白與GRIM19蛋白可能是通過某些作用機制相互聯(lián)系，是否以上述通路發(fā)揮拮抗作用共同影響子宮內(nèi)膜癌的惡性進展過程，仍需進一步證實。

本研究顯示，術(shù)后輔助放療患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯高于未放療組，術(shù)后輔助化療患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯高于未化療組。這表明術(shù)后輔助放化療可在一定程度上延長生存時間。

本研究首次探討TIAM1和GRIM19在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌腫瘤進展中的生物學(xué)意義，不僅為腫瘤的致癌作用提供了新的視角，也為通過靶向治療Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌提供了新的策略。實驗再次證實術(shù)后放化療在一定程度上可有效降低子宮內(nèi)膜腺癌的復(fù)發(fā)率。因此，術(shù)前癌基因檢測、聯(lián)合靶向治療和術(shù)后放化療將在一定程度上為攻克子宮內(nèi)膜癌難題提供更好的解決方案。但本研究僅基于蛋白表達(dá)層面上探討TIAM1和GRIM19與子宮內(nèi)膜癌的相互關(guān)系，其具體作用機制尚不清楚。此外，本實驗樣本量相對小、檢驗方法單一，后續(xù)研究需加大樣本量以及增加論證方法進一步論證或深入到基因?qū)用嫔咸接慣IAM1和GRIM19基因在I型子宮內(nèi)膜癌組織中的發(fā)病機制。