陳 凱，趙 越

[北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(北京大學(xué)第三醫(yī)院)，輔助生殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京大學(xué))，生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院卵成熟障礙綜合診治研究創(chuàng)新單元，北京 100191]

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性最常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是無排卵型不孕癥發(fā)生的主要原因。PCOS在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為5%～10%，其中漢族人群的發(fā)病率為5.61%[1]。隨著對PCOS遺傳方面研究的深入，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道胎兒在母體子宮內(nèi)受到不利環(huán)境因素的暴露能導(dǎo)致子一代出現(xiàn)相應(yīng)表型變化[2-3]，并且多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也佐證了這一點(diǎn)，同時(shí)還觀察到這種不利環(huán)境因素暴露所致的PCOS樣表型變化能進(jìn)行跨代傳遞[4-6]，這提示早期不良環(huán)境因素暴露可能通過表觀遺傳調(diào)控影響后代PCOS發(fā)病的潛在機(jī)制。因此，本文主要從PCOS的臨床特征及遺傳影響因素、結(jié)合PCOS樣動(dòng)物模型的子代表型特征以及可能作用機(jī)制對PCOS表型跨代遺傳的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。

1 PCOS的臨床特征及遺傳影響因素

1.1 PCOS的臨床特征 PCOS臨床表現(xiàn)復(fù)雜，根據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，包括3種主要表現(xiàn)：(1)臨床或生化雄激素過多癥；(2)稀發(fā)排卵或無排卵；(3)多囊卵巢的形態(tài)學(xué)改變。此外，PCOS患者血清中黃體生成素(luteinizing hormone,LH)和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者中LH的脈沖頻率明顯增加，且與升高的雄激素共同形成一個(gè)持續(xù)升高的惡性循環(huán)[7]，而AMH水平也反映著PCOS的嚴(yán)重程度。此外，PCOS患者常伴隨肥胖、血脂紊亂、胰島素抵抗、糖耐量異常等多種代謝合并癥[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS女性的肥胖發(fā)病率高達(dá)50%，明顯高于正常女性(7.6%)[9-10]，且其腹部肥胖程度也與循環(huán)中雄激素水平正相關(guān);PCOS患者中約60%伴發(fā)胰島素抵抗[11]，且其胰島素水平的升高進(jìn)一步通過促進(jìn)卵巢中P450c17表達(dá)和抑制肝臟性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)的釋放來提高循環(huán)中雄激素的水平[12]。

1.2 PCOS發(fā)生相關(guān)遺傳因素 近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的母親或姐妹等一級親屬罹患PCOS的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加，其發(fā)病率分別為24%和32%，明顯高于普通人群(5.61%)[13]。而進(jìn)一步基因?qū)用嫜芯堪l(fā)現(xiàn)，參與類固醇生成的CYP11a基因、CYP19基因，及參與其后續(xù)作用的雄激素受體AR基因和性激素結(jié)合球蛋白SHBG基因[14]，同時(shí)包括由全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies，GWAS)確定的中國漢族人群中的11個(gè)PCOS候選位點(diǎn)，其中包括與PCOS患者雄激素水平或胰島素功能相關(guān)的INSR、FSHR、LHCGR、DENND1A、C9orf3和RAB5B，以及與PCOS患者代謝綜合征或胰島素抵抗相聯(lián)系的THADA和TOX3，同時(shí)也包括與PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)的HMGA2、YAP1以及與芳香化酶合成相關(guān)的ZNF217[15]，都被證實(shí)與PCOS發(fā)生具有一定的相關(guān)性。但是，由GWAS所確定的這些位點(diǎn)其所占的遺傳力比例不足10%[16]。這提示PCOS的發(fā)病機(jī)制中還存在著被研究人員忽視的影響因素，其中表觀遺傳調(diào)控機(jī)制可能在PCOS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

2 結(jié)合動(dòng)物模型明確PCOS表型跨代遺傳特征

研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌干擾物在生命早期的干預(yù)能對受暴露影響個(gè)體的后代表型產(chǎn)生影響[17]。由于調(diào)查研究患有PCOS女性的子二代是否相應(yīng)地出現(xiàn)PCOS相關(guān)表型的時(shí)間跨度較大，現(xiàn)在并沒有與之相關(guān)的臨床研究。因此，為了探究PCOS表型跨代遺傳具體的表型變化形式，利用實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的動(dòng)物模型便成了較好的選擇。目前研究常用的動(dòng)物模型包括產(chǎn)前雄激素暴露(prenatal androgen exposure,PNA)模型、產(chǎn)前抗苗勒管激素暴露(prenatal anti-Müllerian hormone exposure,PAMH)模型和青春期大鼠模型三種，表1分別對其PCOS模型組、子一代以及子二代的生殖內(nèi)分泌及代謝相關(guān)表型進(jìn)行了系統(tǒng)的歸納。

2.1 PNA模型 Risal等[5]在胚胎發(fā)育第16.5～18.5d連續(xù)給予C57BL/6J孕鼠伴或不伴高脂高糖飲食的二氫睪酮暴露，通過血清學(xué)和組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),受暴露孕鼠的后代肛門生殖距離(anogenital distance,AGD)增加，睪酮、雄烯二酮水平降低，動(dòng)情期縮短，卵母細(xì)胞DNA修復(fù)以及線粒體形態(tài)異常和脂肪量增加，即表現(xiàn)為PCOS樣表型改變，因此將該后代定義為PCOS模型組。隨后將該模型組小鼠與正常雄鼠交配，進(jìn)而檢測發(fā)現(xiàn)子一代、子二代小鼠AGD增加、卵母細(xì)胞DNA修復(fù)以及線粒體形態(tài)異常和脂肪量增加。然而，子一代、子二代小鼠并未出現(xiàn)血清睪酮、雄烯二酮水平的降低，并且在子二代小鼠中也并未檢測到動(dòng)情周期紊亂現(xiàn)象。此外，與PCOS模型組及其子一代小鼠不同的是，子二代小鼠表現(xiàn)出了明顯的體重增加。

2.2 PAMH模型 Mimouni等[4]通過觀察在胚胎發(fā)育第16.5～18.5d連續(xù)受到AMH暴露影響的C57BL/6J孕鼠后代的表型發(fā)現(xiàn)，受到產(chǎn)前暴露影響的孕鼠，其后代出現(xiàn)了雄激素、LH水平升高和AGD增加，動(dòng)情間、后期的延長和卵巢黃體數(shù)目的減少，同時(shí)出現(xiàn)體重和脂肪量的增加以及血糖和胰島素水平的升高，表現(xiàn)為PCOS樣改變。隨后將此PCOS模型組小鼠與正常雄鼠交配得到子一代與子二代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然子一代與子二代小鼠均出現(xiàn)了AGD增加，動(dòng)情間、后期延長，體重和脂肪量增加，但是子一代小鼠并未出現(xiàn)卵巢黃體數(shù)目的減少和血糖、胰島素水平的變化，而在子二代小鼠中雖出現(xiàn)了黃體數(shù)目的降低和血糖增高，但也并未觀察到循環(huán)中雄激素、LH和胰島素水平的變化。

2.3 青春期大鼠模型 Zhang等[6]通過給予27日齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠連續(xù)20d的6mg/100g體重劑量的脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)暴露，誘導(dǎo)出具有PCOS樣表現(xiàn)的模型組大鼠，即表現(xiàn)為睪酮和LH升高、動(dòng)情間期延長、卵巢囊性變和生育力降低。隨后將PCOS模型組大鼠與正常雄鼠雜交獲得子一代，而子二代大鼠是由對照組和PCOS模型組的子一代大鼠組內(nèi)或組間雜交獲得。經(jīng)進(jìn)一步的血清學(xué)與組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，子一代與子二代均出現(xiàn)了動(dòng)情周期紊亂、LH水平升高和卵巢多囊樣改變表型的傳遞。同時(shí)，子一代與子二代還出現(xiàn)了明顯的體重增加、糖耐量降低與胰島素抵抗。此外，在子二代大鼠中，雖未觀察到生育力降低現(xiàn)象，但是其睪酮水平升高，甘油三酯代謝存在異常。

綜合以上發(fā)現(xiàn)，雖然PNA模型、PAMH模型和青春期大鼠模型三種動(dòng)物模型造模方法不同，但是PCOS模型鼠的子二代均出現(xiàn)了體重增加及雄激素相關(guān)指標(biāo)升高。與PNA模型不同，PAMH模型與青春期大鼠模型子二代均出現(xiàn)了明顯的動(dòng)情周期紊亂表現(xiàn)，并且在此兩種模型中還可觀察到血糖、胰島素、甘油三酯代謝指標(biāo)變化。此外，PNA模型的子二代出現(xiàn)卵母細(xì)胞DNA修復(fù)以及線粒體形態(tài)異常，而PAMH模型中的子二代主要表現(xiàn)為卵巢黃體數(shù)目減少，青春期大鼠模型的子二代則呈現(xiàn)卵巢多囊樣改變。因此，雖然此三種模型的子二代均出現(xiàn)了PCOS表型的跨代遺傳現(xiàn)象，但是其具體的表型變化特征仍有明顯差異，提示母體不同暴露因素和方式對其后代表型的影響機(jī)制可能有所不同。

表1 動(dòng)物模型中的PCOS表型跨代遺傳

3 PCOS表型跨代遺傳的潛在機(jī)制

上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，產(chǎn)前暴露會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)環(huán)境的改變，從而引起后代停留在減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞出現(xiàn)基因表達(dá)的差異，如在PCOS女性患者血清中表達(dá)水平升高的TIAL1基因[4-5]。這些差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)不僅能通過影響相關(guān)的信號(hào)通路，如參與卵泡早期類固醇激素調(diào)節(jié)的FOXO信號(hào)通路[22]或在卵泡的發(fā)生和閉鎖中扮演重要角色的TGF-β信號(hào)通路[23]，進(jìn)而影響早期胚胎的發(fā)育，還能作為印記基因參與到表觀基因組的修飾調(diào)節(jié)中，最終通過DNA甲基化等修飾水平的改變，影響原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)的重編程過程[5,24]，造成跨代遺傳的現(xiàn)象。由此可知，表觀遺傳機(jī)制在PCOS表型跨代遺傳中具有不可忽視的作用。因此，我們將對近年來PCOS表型跨代遺傳中表觀遺傳的潛在機(jī)制進(jìn)行較詳細(xì)的總結(jié)。見圖1。

圖1 結(jié)合動(dòng)物模型分析PCOS跨代遺傳潛在機(jī)制示意圖

3.1 DNA甲基化水平的改變 研究表明，DNA甲基化水平的改變作為基因組印記改變的一種重要形式，參與了表型跨代遺傳效應(yīng)。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸簇的胞嘧啶上,甲基通過與胞嘧啶堿基的共價(jià)結(jié)合完成DNA甲基化過程。而在細(xì)胞中這一過程主要依賴DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferases 1,DNMT1)來維持，其能復(fù)制模板鏈上的甲基化記號(hào)，從而在細(xì)胞分裂周期中將其準(zhǔn)確地傳遞給子鏈[25]，保證了此種表觀遺傳信息的穩(wěn)定遺傳。但是不利的環(huán)境因素暴露能降低DNMT1的活性，進(jìn)而影響生殖細(xì)胞的DNA甲基化過程，導(dǎo)致DNA低甲基化的產(chǎn)生[26]，這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到的差異性DNA甲基化水平改變相符合。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種DNA低甲基化改變主要位于啟動(dòng)子區(qū)域[4,25]，因此其能通過影響基因表達(dá)調(diào)控過程，引起表型的變化。RNA測序(RNA sequencing，RNA-seq)和甲基化DNA免疫沉淀結(jié)合深度測序(methylated DNA immunoprecipitation combined with deep sequencing，MeDIP-seq)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor 1a，CDKN1A)[27]、組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)以及甲基胞嘧啶雙加氧酶1(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1,TET1)[28]等基因在體外試驗(yàn)的PCOS模型小鼠中出現(xiàn)了較顯著的甲基化水平降低[4]。CDKN1A在PCOS患者中能調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖[29-30]。正常情況下，CDKN1A在排卵時(shí)會(huì)上調(diào)表達(dá)從而抑制顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)排卵過程[29]。但在動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn),產(chǎn)前AMH的暴露會(huì)導(dǎo)致子二代CDKN1A甲基化水平降低，出現(xiàn)基因表達(dá)下調(diào)，因此促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的增殖[4,30],而這與觀察到的PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖增加相符[30]。另外，HDC作為組胺合成通路中的限速酶,催化著組氨酸向組胺的轉(zhuǎn)變[31]，此過程主要發(fā)生在晚期或慢性炎癥階段[32]。但是，HDC的甲基化水平降低引起了其基因表達(dá)的增多[4]，進(jìn)而導(dǎo)致PCOS患者炎癥水平加重。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，參與了5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)向5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)的轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮去甲基化作用的TET1[33-34]在體外實(shí)驗(yàn)和PCOS患者血清中均存在顯著的低甲基化水平和表達(dá)增加[4]，這可能是引起PCOS患者DNA甲基化水平降低的一個(gè)可能原因。與設(shè)想不同的是，雖然參與甲基化維持的環(huán)指結(jié)構(gòu)域蛋白1(RING finger domain-containing protein 1，Uhrf1)[35]在體外實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了低甲基化水平的明顯改變，但在PCOS女性患者中并不顯著[4]?？偠灾?，雖然PGCs會(huì)發(fā)生包括DNA甲基化標(biāo)記擦除在內(nèi)的表觀遺傳重編程事件[36]，但是這種擦除的效果并不相同，即仍保留有部分甲基化標(biāo)記未被清除[37-38]。此外，也有觀點(diǎn)認(rèn)為表觀遺傳修飾在甲基化標(biāo)記的擦除過程中存在抵抗作用[25]，而這些均與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果，即DNA甲基化水平改變經(jīng)過世代傳遞出現(xiàn)在子二代相符合。因此，可推測DNA甲基化水平的改變似乎是通過逃脫重編程，進(jìn)而在PCOS表型跨代遺傳中發(fā)揮作用。

模式圖顯示了在青春期或胚胎發(fā)育16.5～18.5d受到DHEA、AMH或DHT暴露的動(dòng)物模型，其發(fā)生PCOS跨代遺傳的潛在調(diào)控分子CDKN1A、HDC、TET1及Nap1甲基化或乙?；揎椝降母淖儯@些改變影響了基因表達(dá)，其中表達(dá)水平上升被標(biāo)記為“綠正三角”，表達(dá)水平降低被標(biāo)記為“紅倒三角”

3.2 組蛋白修飾水平的改變 組蛋白是真核染色質(zhì)的組成成分之一，其能與DNA相互結(jié)合形成核小體。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白能調(diào)節(jié)DNA序列中的控制元件[39],通過其修飾水平，如乙酰化、甲基化等水平的改變，影響基因表達(dá)。一項(xiàng)關(guān)于PCOS患者卵丘細(xì)胞(cumulus cells，CCs)中CYP19A1基因表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3賴氨酸9(histone H3 lysine 9，H3K9)的乙?；ㄟ^作用于啟動(dòng)子PⅡ促進(jìn)其mRNA的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致芳香化酶合成增加[40]。但從PAMH模型可知，作為組蛋白伴侶參與核小體組裝和拆卸的核小體組裝蛋白(Nucleosome assembly proteins 1，Nap1)[41]在子二代小鼠卵巢中表達(dá)水平降低[4]。Nap1已被證明可抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)對組蛋白H1的去乙?；痆42-43]，從而保持組蛋白H1的乙?；剑M(jìn)而通過破壞DNA與核小體之間的靜電作用，導(dǎo)致染色質(zhì)松弛，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[42,44]。因此，可推測子二代PCOS小鼠相關(guān)表型的異?？赡芘cNap1表達(dá)降低之后，組蛋白H1乙酰化水平降低，轉(zhuǎn)錄受抑制有關(guān)。但是子二代小鼠并未受到暴露影響，所以此種包含組蛋白乙?；礁淖兊谋碛^遺傳信息可能是經(jīng)世代傳遞所致，但其具體機(jī)制仍有待于研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，不利環(huán)境因素暴露引起的PCOS表型跨代遺傳涉及DNA甲基化水平以及組蛋白修飾水平的改變兩方面(圖1)。但需注意的是，只有在胚胎發(fā)育的特定時(shí)期，如胎兒性別決定時(shí)期的暴露才能永久性地改變生殖細(xì)胞的表觀遺傳標(biāo)記，并通過受精卵穩(wěn)定傳遞給子代[45]。但是，這種永久性改變的表觀遺傳標(biāo)記如何逃脫生殖細(xì)胞的重編程仍需進(jìn)一步進(jìn)行探究。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，動(dòng)物模型的研究證實(shí)了不利環(huán)境因素的暴露會(huì)導(dǎo)致PCOS相關(guān)表型變化出現(xiàn)跨代遺傳，而這可能由DNA甲基化水平改變以及組蛋白修飾水平改變來介導(dǎo)。雖然目前對于DNA甲基化的研究較為深入，但仍有許多方面尚未闡明，如組蛋白修飾水平的變化和非編碼RNA含量的變化如何具體參與表觀遺傳，以及這些改變了的表觀遺傳標(biāo)記如何逃脫了生殖細(xì)胞早期的重編程事件。此外，動(dòng)物模型的研究也提示生命早期環(huán)境暴露的重要性，因此如何降低不利環(huán)境因素的暴露需要深入探索。PCOS患者中DNA甲基化水平的改變提示甲基供體可能作為一種改善PCOS表型的潛在策略。然而由于嚙齒類動(dòng)物與人類之間始終存在著差異，因此仍需進(jìn)一步探索表觀遺傳機(jī)制在人類PCOS表型跨代遺傳發(fā)生發(fā)展中的重要作用。