王雪嬌，田東梅，廖海霞，李亨利，尹欣，朱明輝

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都 611137；2.成都西囡婦科醫(yī)院， 四川 成都 611137)

0 引言

京尼平是中藥杜仲分離出的一種重要成分，既往研究表明，其作用有：保肝利膽、抗炎、抗氧化，抗血栓、抗腫瘤以及抗抑郁等作用，同時(shí)也可以用于治療糖尿病、癌癥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[1-3]。Tao Zuo[4]等研究表明京尼平可以通過有效的抑制大部分白細(xì)胞介素(IL-6，IL-8，IL-10，IL-1?)的產(chǎn)生，從而達(dá)到減少KGN 細(xì)胞株凋亡以及減輕氧化應(yīng)激造成的損傷的作用，同時(shí)也可減少多囊卵巢綜合征患者的炎癥損傷。

在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，氧化應(yīng)激對人類的生殖過程有負(fù)面影響，隨著女性年齡的增加，卵母細(xì)胞逐漸衰老加快，其抗氧化的能力也隨之下降，易導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程發(fā)生異常，如染色體分離障礙，這導(dǎo)致形成非整倍體胚胎，從兒發(fā)生反復(fù)種植失敗及反復(fù)流產(chǎn)。目前臨床上能使用的抗氧化劑較少，既往大部分研究均在模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)下探討京尼平的抗炎及抗氧化作用，在非氧化應(yīng)激模型下，京尼平是否也有較好的抗炎癥因子分泌功能尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)討論了在非氧化應(yīng)激狀態(tài)下京尼平對KGN 細(xì)胞的分泌功能的影響及可能的調(diào)節(jié)通路，以期為臨床使用京尼平提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

KGN細(xì)胞株、京尼平 (Cayman)、胎牛血清(gibco)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(gibco)、胰酶(gibco)、雙抗(碧云天)、DMSO(Sigma)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)、HSD17B2 抗體(affinity)、CYP19A1 抗體(affinity)、CYP17A1 抗體(proteintech)、UCP2 抗體(proteintech)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(英國abcam--艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)；Human IL-1βELISA KIT、Human IL-6 ELISA KIT、Human E ELISA KIT、Human IL-4 ELISA KIT、Human IL-5 ELISA KIT、Human P ELISA KIT(上海茁彩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 KGN 細(xì)胞株的培養(yǎng)

培養(yǎng)液使用10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM/F-12，將KGN 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式

分為實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.05μmol/L, 0.1μmol/L, 0.2μmol/L, 0.3μmol/L的京尼平干預(yù)，對照組為5/1000DMSO。

1.2.3 ELISA 檢 測 上 清 液 中IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書方法測定各組細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6 和IL-4、IL-5、E2、P 因子含量。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

復(fù)蘇后的KGN 細(xì)胞被接種到培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到70%~80%，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，收集各組細(xì)胞獲得總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，每孔以40μg 樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE，采用濕法進(jìn)行Western blot 轉(zhuǎn)膜 (PVDF 膜) 1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入I 抗 (HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 濃度為1 ∶500~1 ∶1 000，β-actin 濃度為1 ∶5 000)，4℃孵育過夜，Ⅱ抗37℃孵育1 h, ECL化學(xué)顯色，image J 軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。在方差齊性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上行方差分析，并用SNK-q 檢驗(yàn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 結(jié)果

1.4.1 添加京尼平對KGN 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6，IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量的影響

1.4.1.1 與對照組相比，添加京尼平后，隨著京尼平濃度的增加，上清液中雌激素、孕激素分泌量逐漸減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，具體如圖1。

圖1

表1 不同濃度京尼平干預(yù)KGN 細(xì)胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

表1 不同濃度京尼平干預(yù)KGN 細(xì)胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

注：Ctrl 組為對照組，0.05 為京尼平0.05mmol/L，0.1 為京尼平0.1mmol/L，0.2 為京尼平0.2mmol/L，0.3 為京尼平0.3mmol/L 。

?

1.4.1.2 添加京尼平后，培養(yǎng)基上清液中的IL-6,IL-1β 較對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，IL-4、IL-5 含量隨著京尼平濃度的上升，其分泌量逐漸減少，其中IL-4 的分泌量每組均較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),IL-5 的分泌量僅高濃度組(京尼平濃度≥0.2mmol/L)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。具體如圖2 所示。

圖2

1.4.2 京尼平對KGN 細(xì)胞HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 蛋白水平的影響

不同濃度京尼平(0、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L)加入培養(yǎng)基中，對KGN 細(xì)胞株干預(yù)24 小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白，檢測CYP17A1、CYP19A1、HSD17B2、UCP2 蛋白表達(dá)，結(jié)果如下：隨著京尼平濃度的增加，CYP17A1 及HSD17B2 的表達(dá)量與對照組比較呈逐步上升趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CYP19A1 及UCP2 蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比在京尼平濃度為0.2mmol/L 時(shí)表達(dá)量最高(P＜0.01)。

2 討論

哺乳動(dòng)物卵巢中最大的細(xì)胞群是顆粒細(xì)胞群，其在卵巢激素的合成、以及卵泡液的產(chǎn)生、甚至是在卵母細(xì)胞間的信息交換、卵母細(xì)胞的生長發(fā)育和成熟等方面都起著極其重要的作用，臨床上取卵后收集的顆粒細(xì)胞均已黃素化，本身培養(yǎng)極其困難，且不能傳代，而KGN 細(xì)胞株具有易培養(yǎng)，易傳代等好處，且能模擬正常人顆粒細(xì)胞的大部分生理活性，比如激素合成、凋亡調(diào)節(jié)、表達(dá)FSHR 等，被認(rèn)為是研究人顆粒細(xì)胞最佳模型[5]，故本實(shí)驗(yàn)采用KGN 細(xì)胞株進(jìn)行相關(guān)研究。

圖3 不濃度京尼平干預(yù)KGN 細(xì)胞株24h 后CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD2、UCP2 蛋白表達(dá)

2.1 京尼平對KGN 細(xì)胞株分泌雌孕激素功能的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示添加京尼平干預(yù)KGN 細(xì)胞株后，其E2 及P 分泌量的多少與京尼平濃度呈反比。既往較多研究均認(rèn)為在輔助生殖中添加雌孕激素對患者有較大的益處，陳某的研究顯示[6]ART 患者在接受GnRH-ant 方案時(shí)，補(bǔ)充E2 可提高胚胎植入率，張某等[7]文獻(xiàn)總結(jié)提示經(jīng)口服避孕藥和E2 預(yù)處理后可改善輔助生殖中促排卵的效果。呂某某等認(rèn)為[8]促排卵過程中，高水平孕激素的添加能有效抑制LH 峰，且卵子的成熟數(shù)量和質(zhì)量并不會(huì)受高水平孕激素影響，因此，認(rèn)為此種誘導(dǎo)排卵方式或許可以降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生率，高孕激素狀態(tài)下促排卵方案不失為一種輔助生殖的新方案和新選擇，對于需要生殖力保存患者有重要意義。筆者認(rèn)為，目前京尼平對雌孕激素分泌機(jī)制影響的研究甚少，故在臨床中針對無明顯氧化應(yīng)激的患者，京尼平的療效還有待進(jìn)一步研究。

2.2 京尼平對KGN 細(xì)胞株分泌雌孕激素相關(guān)蛋白的影響

17β-HSDs 是一種氧化還原酶，在雌、孕激素合成中發(fā)揮重要作用，在生殖系統(tǒng)中擁有重要調(diào)節(jié)功能，同時(shí)還具有氧化和還原活性，對類固醇激素含量也有一定的影響[9]。17β-HSD2 是17β-HSDs 的一種亞型，主要存在于人體的肝臟、乳腺、以及分泌期子宮內(nèi)膜、胎盤、腎臟中[10]；活性的17β-HSDs 可被其轉(zhuǎn)化成低活性酮類固醇，17β-HSD2 還可降低E2 和雄激素活性[11,12]。孕激素經(jīng)可轉(zhuǎn)化成雌激素，而KGN 細(xì)胞株不分泌雌激素，本實(shí)驗(yàn)中雌激素水平下降后孕激素分泌也隨之下降，與17β-HSD 逐步增加結(jié)果一致。

CYP17A1 是一種多功能酶，具有裂解酶和羥化酶兩種活性，催化生成所有內(nèi)源性雄激素。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著京尼平濃度的增加，CYP17A1 的蛋白表達(dá)量也同步增加，與左濤[13]等研究高濃度京尼 平0.05mmol/L) 促 進(jìn)17β-HSDs 和CYP17A1 表達(dá)增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。而本實(shí)驗(yàn)CYP19A1 的表達(dá)量與京尼平濃度無明顯相關(guān)性，僅提示在較高濃度(0.2mmol/L)時(shí)表達(dá)量增加，CYP19A1 是激素轉(zhuǎn)化和合成的關(guān)鍵酶之一，睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)變成雌二醇，以及排卵前卵巢合成類固醇激素的關(guān)鍵酶均是CYP19A1，因此關(guān)于雌孕激素的分泌與CYP19A1 的關(guān)系可進(jìn)行進(jìn)一步探究。

UCP2 能調(diào)節(jié)線粒體膜電位和能量代謝。主要分布在肝臟、腎臟、免疫細(xì)胞、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪細(xì)胞等組織中；線粒體代謝在人卵巢功能中有重要意義，研究發(fā)現(xiàn)人卵巢顆粒細(xì)胞有UCP2 蛋白的表達(dá)[18]，認(rèn)為UCP2 也可參與調(diào)節(jié)卵細(xì)胞生長、發(fā)育及成熟[19]。Ge H[20]等研究表明UCP2 被抑制后卵泡細(xì)胞合成孕激素下降。本研究中UCP2 的表達(dá)與京尼平的濃度改變呈拋物線型改變，在濃度為0.2mmol/L 時(shí)表達(dá)量最高，與孕激素的改變無明顯相關(guān)性，故筆者認(rèn)為UCP2 的表達(dá)是否與孕激素分泌調(diào)劑有關(guān)還存在爭議，可進(jìn)一步探究。

2.3 京尼平對炎癥因子的影響

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，IL-6，IL-1β 較對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但隨著京尼平濃度增加，炎癥因子IL-4 及IL-5 的濃度逐漸降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證明了京尼平的抗炎作用。不同的輔助性T 細(xì)胞和細(xì)胞因子可以由輔助性T 淋巴細(xì)胞分化而來。Th2 可分泌IL-4、IL-5、IL-6 等細(xì)胞因子，其中IL-4 具有免疫調(diào)節(jié)多效性，IL-5 具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[14]。有研究表明IL-4 能促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，抑制Th1 細(xì)胞因子的分泌，提高機(jī)體免疫耐受能力，對維持妊娠有著重要意義[15,16]。而不良妊娠結(jié)局常常與Th1 細(xì)胞因子增多(IL-2、IFN-γ)和Th2 細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-6)的降低有關(guān)[17]。

3 結(jié)論

在非炎性狀態(tài)下，京尼平可以明顯降低炎癥因子IL-4，IL-5 的分泌，但對IL-6，IL-1β 分泌無明顯影響，進(jìn)一步證實(shí)了其抗炎作用。但隨著京尼平濃度的增加，對雌孕激素的分泌有一定的抑制作用。