鋁是自然界中常見的一種元素，大量研究表明鋁負荷引起肝臟形態(tài)異常和功能障礙

，其損傷的機制可能與氧化應激和炎癥反應相關

。研究發(fā)現(xiàn)鋁通過誘導氧自由基形成，從而引起氧化應激損傷致細胞凋亡

。半胱氨酰白三烯受體1(CysLTR1)與肝細胞損傷過程關系密切，據(jù)報道CysLTR1抑制劑孟魯司特可防止小鼠對乙酰氨基酚誘導的肝損傷

，也有研究發(fā)現(xiàn)抑制CysLTR1可以減少肝細胞凋亡保護腸 I/R繼發(fā)肝損傷

。細胞凋亡是引發(fā)肝損傷的重要機制之一

，既往研究發(fā)現(xiàn)CysLTR1通路通過調(diào)控細胞自噬參與鋁負荷肝細胞損傷

。然而CysLTR1通路參與鋁負荷肝細胞凋亡的具體機制仍未完全清楚，MK-571是 CysLTR1的特異性受體拮抗劑。本研究旨在通過應用MK-571作用鋁負荷肝細胞，探討CysLTR1通路調(diào)節(jié)鋁負荷肝細胞氧化應激及凋亡機制的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：HL-7702(L02)為人源正常肝細胞(北納創(chuàng)聯(lián)生物公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone)，胎牛血清(FBS)(德國Biotech)，MTT(美國Genview)，MK-571(英國Cayman Chemical)，麥芽酚、三氯化鋁(國藥化工)。ALT試劑盒、AST試劑盒、SOD試劑盒(南京建成)，MDA、BCA試劑盒(碧云天)，抗體：Bcl-2(博士德，武漢)、Bax(Proteintech，美國)、Caspase3(Abcam，美國)、Caspase9(CST，美國)、GAPDH(Proteintech，美國)，二抗購自武漢三鷹生物有限公司。

在汽車發(fā)動機電控系統(tǒng)維修、汽車自動變速器維修、汽車電氣系統(tǒng)維修等課程過程考核中，引入汽車檢測與維修技能大賽的規(guī)則評分標準，不僅考核學生的理論知識掌握情況，同時從學生的崗位操作技能、故障分析能力等方面對學生進行綜合評價。例如：汽車發(fā)動機電控系統(tǒng)維修課程過程考核中設有進氣系統(tǒng)電氣元件檢測、發(fā)動機電控系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析、發(fā)動機不能起動故障診斷等內(nèi)容，通過考試模式的改革和考核標準的變更力求實現(xiàn)與崗位技能要求的零對接。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組 L02為貼壁細胞，用RPMI-1640(含1%鏈霉素+青霉素)培養(yǎng)基配置成含10%FBS的培養(yǎng)液，置于5% CO

、37℃恒溫孵箱，每24 h換液一次。將培養(yǎng)好的細胞分為3組：正常對照組、鋁負荷組[(200 μmol/L Al(malt)3]、MK-571(3 nmol/L)+Al(200 μmol/L)組。

1.2.5 Western Blot檢測蛋白表達 按常規(guī)方法操作。

2.2 MK-571作用于鋁負荷L02肝細胞ALT、AST、SOD和MDA含量變化 見表1。

所謂“就業(yè)的時效性”是指學生在畢業(yè)就業(yè)時要抓住機遇及時就業(yè)，在保證就業(yè)的前提下通過工作中自身的努力不斷提高自己的業(yè)務水平，為日后進入更好的領域工作打下堅實的基礎。而不要高不成低不就最后耽誤自己的前途。

2.3 MK-571對鋁負荷L02肝細胞凋亡的影響 圖2表明，通過流式細胞術檢測，鋁負荷L02肝細胞凋亡率較對照組細胞明顯增加(

<0.01)，而給予MK-571作用后細胞凋亡率較鋁負荷組顯著降低(

<0.01)。

1.2.2 MTT法測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板中(100 μl/孔)，待貼壁后進行藥物干預處理。作用36 h后，避光，各孔中加入20 μl MTT，孵箱培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加DMSO 150 μl，迅速置于避光盒中，放置于水平搖床，充分溶解板中結晶。最后置于光吸收酶標儀，選用490 nm檢測光密度(OD)值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，接種于六孔板中密度為5×10

個/孔，藥物作用36 h后，收集細胞，離心(1 000 r/min×10 min)，用冷PBS洗滌，重懸。根據(jù)碧云天細胞凋亡試劑盒按操作說明進行染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

本文的研究對象是有多種配方，生產(chǎn)煉鋼用鐵水、鑄鐵用鐵水等多種鐵水產(chǎn)品的煉鐵廠，本文對所研究的問題作出以下假設：

2 結果

2.1 MK-571對肝細胞L02增殖活力的影響 MK-571干預鋁負荷肝細胞L02 36 h后，在3 nmol/L附近有較好的保護的作用(

<0.01，圖1A)。由圖1B可知在3 μmol/L濃度內(nèi)對肝細胞增殖活力影響較正?？瞻讓φ占毎胁町?

<0.01)，而MK-571濃度≤1 μmol/L則不影響細胞的活力。因此選取3 nmol/L作為實驗的干預劑量。

1.2.3 檢測細胞ALT、AST、SOD、MDA的含量 取對數(shù)生長期細胞，每孔接種密度為5×10

個，作用于六孔板中，藥物處理36 h后，收集細胞混懸液，離心(1 000 r/min×10 min)及PBS洗2次。最后加PBS冰水浴下超聲破碎，收集裂解細胞，充分混勻，測定蛋白濃度。將制備好的細胞勻漿根據(jù)ALT、AST、SOD、MDA試劑盒說明書操作。

長期以來，珠江口東西兩岸一直面臨發(fā)展不協(xié)調(diào)的問題。東岸經(jīng)濟發(fā)達，而西岸經(jīng)濟發(fā)展相對落后，產(chǎn)業(yè)和人口聚集度較低，難以形成規(guī)模效益。同時，粵港澳大灣區(qū)還面臨創(chuàng)新資源分布不均、資源浪費嚴重、發(fā)明創(chuàng)新質(zhì)量不高、跨境創(chuàng)新合作機制不健全等問題，這些短板限制了粵港澳大灣區(qū)的持續(xù)發(fā)展。

2.4 各組L02 肝細胞中相關蛋白表達水平變化 由圖3可知，與正常L02細胞相比，鋁負荷細胞中Caspase 3、Caspase 9、BAX蛋白表達顯著升高(

<0.05和

<0.01)，而Bcl-2顯著降低(

<0.01)；給予MK-571作用，其蛋白表達Caspase 3、Caspase 9、BAX明顯下調(diào)(

<0.05和

<0.01)，而Bcl-2表達明顯上調(diào)(

<0.05)。

3 討論

氧化應激反應在引起機體損傷中發(fā)揮重要作用，是生物體的一種應激反應。氧化應激參與腫瘤、炎癥和代謝綜合征等多種疾病，當機體活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，ROS/活性氮的比值增高，不能被機體抗氧化劑作用抵消，擾亂細胞氧化還原失去平衡，導致細胞結構和功能損傷

。據(jù)報道金屬離子鋁可以影響肝臟氧化應激導致肝臟損傷

，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)200 μmol/L Al(malt)3作用36 h處理L02肝細胞可以有效建立鋁負荷肝細胞損傷模型

，因此采用這一造模方法用于本次體外實驗研究。

然而,蠕蟲狀鏈模型也存在一些不足.由于蠕蟲狀鏈用投影長度來表示分子鏈尺寸,看上去沒有用到統(tǒng)計單元數(shù)的統(tǒng)計關系,統(tǒng)計單元的多寡僅影響其投影的長度,不影響計算結果,因此可用于描述那些因統(tǒng)計單元數(shù)不足而無法用等效自由結合鏈來處理的分子鏈.但實際上,不斷投影取最后的投影長度的方法也是統(tǒng)計的結果.這種暗含式的統(tǒng)計處理方法很隱蔽,使人們在將其運用到剛性鏈時沒有覺得有什么不妥.

MDA通過氧自由基代謝產(chǎn)生，其含量反映了體系脂質(zhì)過氧化進展狀態(tài)

。SOD可以減少脂質(zhì)過氧化反應，實現(xiàn)抗氧化作用，主要通過歧化作用降低體內(nèi)過多的氧自由基

，因此SOD水平的高低反映了機體抗氧化能力的強弱。當前結果顯示鋁負荷L02肝細胞中MDA含量較正常組顯著增加、SOD活性顯著下降，提示L02肝細胞處于氧化應激損傷狀態(tài)。CysLTR1受體拮抗劑MK-571(3nmol/L)作用36 h后可以有效降低鋁負荷L02細胞中ALT、AST、MDA水平，并提高SOD的水平，減輕了鋁負荷引起的L02肝細胞氧化應激反應，使鋁負荷細胞的凋亡率明顯降低。

細胞凋亡是肝損傷發(fā)生的重要機制之一，在細胞凋亡調(diào)控過程中Caspase系統(tǒng)及Bcl-2家族在起到關鍵作用。Ghribi等

研究表明鋁誘導的兔子中呈現(xiàn)出上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達趨勢。也有研究發(fā)現(xiàn)鋁可以直接調(diào)控Bax以及Bcl-2 mRNA的表達，其與BAX成正相關，而與Bcl-2成負相關

。在Bcl-2家族的中，Bcl-2和Bax分別為凋亡的抑制因子和促進因子，Bcl-2蛋白存在于外部線粒體膜，可以防止凋亡并抑制Bax的激活

。而Caspase-9作為細胞凋亡重要的啟動子，當機體氧化應激反應時，通過活化并激活下游Caspase家族凋亡因子，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，促使細胞發(fā)生凋亡

。已有研究表明Caspase3、Bcl-2與鋁致肝損傷機制密切相關，鋁誘導肝毒性大鼠中Caspase3蛋白表達會顯著增加，而Bcl-2蛋白表達降低

。在本次實驗中，通過細胞流式技術我們發(fā)現(xiàn)給予MK-571可以有效減少鋁負荷肝細胞L02凋亡率，并且鋁負荷L02肝細胞中蛋白Caspase3、Caspase9和Bax顯著上升，Bcl-2表達明顯下降。給予MK-571干預后顯著下調(diào)了鋁負荷L02肝細胞中Caspase3、Caspase9、Bax表達，上調(diào)了Bcl-2的表達。

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