楊肖芳，李云端，孫云帆，李紹佳，苗立祥，張?jiān)コY桂華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

栽培草莓(×)因其果實(shí)酸甜可口、香味濃郁且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在世界各地已成為了重要的經(jīng)濟(jì)水果，深受消費(fèi)者歡迎。果實(shí)的酸甜度是草莓品質(zhì)的重要指標(biāo)，是影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要因素之一。果實(shí)中可溶性糖類物質(zhì)主要有3種，即蔗糖、葡萄糖和果糖，不同種類成熟果實(shí)中積累的可溶性糖類各不相同，成熟草莓果實(shí)中蔗糖含量最高。有機(jī)酸是決定果實(shí)酸度的重要因子，而影響草莓果實(shí)酸度的有機(jī)酸主要為檸檬酸。因此，探索生產(chǎn)上調(diào)控草莓果實(shí)蔗糖和檸檬酸積累的有效手段對(duì)于調(diào)控其酸甜度至關(guān)重要。

參與蔗糖代謝相關(guān)的酶主要包括蔗糖磷酸合酶(SPS)、蔗糖合酶(SUS)和轉(zhuǎn)化酶(IVR)。SPS主要與蔗糖合成相關(guān)，大量研究表明，SPS與果實(shí)蔗糖含量呈正相關(guān)，在蘋果中過(guò)表達(dá)基因可顯著提高果實(shí)的蔗糖含量。SUS既可催化蔗糖分解，也可參與蔗糖合成。研究表明，在梨等果實(shí)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生了2種不同形式的SUS，即SS1和SS2；SS1在未成熟果實(shí)中主要起分解蔗糖的作用，在坐果時(shí)分解活性最高，SS2則在成熟果實(shí)中起積累蔗糖的作用。IVR則將蔗糖不可逆催化水解成葡萄糖和果糖，IVR主要包括細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(CWIN)、液泡轉(zhuǎn)化酶(VIN)和細(xì)胞質(zhì)(CIN)3類；IVR與蔗糖含量關(guān)系密切，在過(guò)表達(dá)CWIN抑制劑基因-番茄植株中，CWIN活性明顯受到抑制，果實(shí)中蔗糖含量則顯著上升，達(dá)到野生型果實(shí)2倍以上。檸檬酸作為果實(shí)中常見(jiàn)有機(jī)酸之一，廣泛存在于各種果實(shí)中。線粒體是檸檬酸合成的主要部位。首先，糖在果實(shí)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，形成丙酮酸，脫羧形成乙酰輔酶A(Ac-CoA)，CO在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的催化下與磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸(OAA)；然后，OAA與Ac-CoA在檸檬酸合酶(CS)的作用下縮合為檸檬酸。已有研究表明，CS為檸檬酸合成的限速酶，過(guò)表達(dá)基因可促進(jìn)檸檬酸的合成。在檸檬酸降解過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)順烏頭酸酶(ACO)被認(rèn)為是其降解的關(guān)鍵酶，過(guò)表達(dá)的果實(shí)檸檬酸含量顯著降低，而缺失則導(dǎo)致果實(shí)檸檬酸含量升高。

目前，盡管蔗糖和檸檬酸的合成通路和分子調(diào)控機(jī)制已經(jīng)得到了較為深入的研究，但是生產(chǎn)實(shí)踐中不同栽培條件對(duì)草莓果實(shí)蔗糖和檸檬酸合成的影響未有報(bào)道。本文以栽培草莓越心(בYuexin’)為研究對(duì)象，比較基質(zhì)栽培和土壤栽培草莓果實(shí)蔗糖和檸檬酸積累差異，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析蔗糖、檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量差異，為探究差異形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)不同栽培條件調(diào)控草莓品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

八倍體栽培草莓越心由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧楊渡科技創(chuàng)新基地提供?；|(zhì)栽培的配方為40%泥炭、20%有機(jī)介質(zhì)、10%蛭石、20%植生基盤材、10%珍珠巖、緩釋肥料(2 kg·m)、基質(zhì)殺菌劑、穩(wěn)定劑，生產(chǎn)廠家均為杭州錦海農(nóng)業(yè)科技有限公司?；|(zhì)的有機(jī)質(zhì)含量為38.7%、全氮27.6 g·kg、有效磷237 mg·kg、有效鉀8 317 mg·kg、電導(dǎo)率(EC)3.27 mS·cm、pH值5.98。土壤的有機(jī)質(zhì)1.62%、全氮1.09 g·kg、有效磷123.23 mg·kg、有效鉀194.57 mg·kg、EC 34 mS·cm、pH值7.08。試驗(yàn)周期內(nèi)用營(yíng)養(yǎng)液(EC 0.8 mS·cm，pH值5.8)對(duì)草莓進(jìn)行滴灌。

分別在白果期(white，W)、轉(zhuǎn)色期(turning，T)、半紅期(intermediate red，IR)和全紅期(full red，R)4個(gè)發(fā)育階段挑選大小一致且無(wú)明顯缺陷的果實(shí)進(jìn)行取樣。1.5 h內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，除去花萼后將果實(shí)平分成尖部和基部，迅速切成小塊，立即在液氮中冷凍，然后在-80 ℃保存?zhèn)溆?。?個(gè)果實(shí)為1組生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)果實(shí)發(fā)育階段取4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 果實(shí)糖酸含量測(cè)定

參考Li等的方法進(jìn)行草莓果實(shí)糖酸提取與含量測(cè)定。取0.1 g凍于-80 ℃冰箱的草莓果實(shí)粉末于1.5 mL離心管中，加入提前放置于-20 ℃預(yù)冷的色譜甲醇1.4 mL，渦旋3次使之充分混勻。將離心管置于70 ℃金屬浴中950 r·min加熱15 min，4 ℃、10 000×離心10 min，將上清液倒入10 mL離心管中，加入750 μL三氯甲烷(-20 ℃)和1.5 mL mili-Q水(4 ℃)，渦旋3次，常溫下2 200×離心10 min。離心后，吸取上清液于1.5 mL離心管中，置于-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

吸取100 μL上清液加入20 μL內(nèi)標(biāo)核糖醇(20 mg·mL)，置于常溫下真空干燥。干燥后加入60 μL現(xiàn)配的20 mg·mL甲氧胺鹽酸鹽(吡啶溶)，充分渦旋后37 ℃、950 r·min加熱1.5 h，隨后加入40 μL N，O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)，同樣條件下金屬浴加熱30 min。

樣品制備完成后，使用氣相色譜儀(7890N-5975C，安捷倫公司，美國(guó))測(cè)定草莓果實(shí)糖酸含量。色譜柱為HP-5MS(30 M×0.25 mm×0.25 μm，J & WScientific，F(xiàn)olsom，CA)。用氮?dú)庾鳛檩d體，進(jìn)樣口溫度250 ℃。進(jìn)樣量為1 μL，分流比10：1，流量為1 mL·min。升溫程序：100 ℃保持1 min，3 ℃·min升溫至185 ℃，15 ℃·min升至230 ℃，保持1 min。

1.3 果實(shí)RNA提取和cDNA合成

參考改良的CTAB法提取草莓果實(shí)總RNA。使用PrimeScriptRT(TaKaRa，日本)去除RNA樣品中的基因組DNA，隨后用1 μg的RNA按試劑盒操作說(shuō)明(PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，日本)進(jìn)行cDNA第一鏈合成，合成體積20 μL。

1.4 qRT-PCR分析

利用草莓基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蔗糖合酶基因1(gene12940)、2(gene11077)，蔗糖磷酸合酶基因1(gene11606)、2(gene22863)、3(gene31122)，檸檬酸合酶基因1(gene00583)、2(gene05118)、4(gene26778)，順烏頭酸酶基因1(gene14541)、3(gene23775)的CDS序列，利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物。對(duì)cDNA以1∶10的比例進(jìn)行稀釋，2 μL作為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)總體積20 μL，包含10 μL Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad，美國(guó))，上下游引物(10 μmol·L)各1 μL，6 μL DEPC水和2 μL稀釋后的cDNA模板。qRT-PCR在CFX96儀器(Bio-Rad)進(jìn)行。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

以413為內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)量的校正，并將土壤栽培和基質(zhì)栽培中全紅期基因的表達(dá)量設(shè)為1，用2法計(jì)算果實(shí)成熟過(guò)程中各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和統(tǒng)計(jì)分析，使用Graphpad Prism 8軟件作圖。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培條件下草莓果實(shí)的蔗糖含量

草莓果實(shí)尖部的成熟早于基部，蔗糖的積累是果實(shí)成熟的重要性狀之一。因此，把果實(shí)分為尖部和基部?jī)刹糠诌M(jìn)行分析。蔗糖含量測(cè)定的結(jié)果顯示，蔗糖含量隨草莓果實(shí)的發(fā)育不斷增加，在果實(shí)完全成熟時(shí)其蔗糖含量達(dá)到最大值。土壤栽培的果實(shí)尖部蔗糖積累在白果期、轉(zhuǎn)色期、半紅期和全紅期均顯著高于基質(zhì)栽培。在果實(shí)基部，除白果期土壤栽培比基質(zhì)栽培高外，其他3個(gè)時(shí)期2種栽培條件下蔗糖含量均無(wú)顯著差異(圖1)。

A，果實(shí)尖部；B，果實(shí)基部。W，白果期；T，轉(zhuǎn)色期；IR，半紅期；R，全紅期。下同。

2.2 不同栽培條件下草莓果實(shí)的檸檬酸含量

在草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，基質(zhì)栽培果實(shí)尖部和基部的檸檬酸含量先上升后下降，而土壤栽培的則隨果實(shí)的發(fā)育逐步下降(圖2)。土壤栽培果實(shí)尖部和基部的檸檬酸含量均顯著高于同一時(shí)期基質(zhì)栽培的果實(shí)，表明土壤栽培可能較基質(zhì)栽培更有利于檸檬酸的積累。

A,尖部；B,基部。

2.3 不同栽培條件下草莓果實(shí)蔗糖合成相關(guān)基因的表達(dá)模式

從圖3可以看出，基質(zhì)栽培條件下，果實(shí)尖部1基因在全紅期的表達(dá)量顯著高于土壤栽培。果實(shí)基部，土壤栽培條件下2基因在半紅期和全紅期的表達(dá)量顯著高于基質(zhì)栽培。果實(shí)尖部和基部，基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下3基因在相同發(fā)育時(shí)期沒(méi)有顯著性差異。在果實(shí)尖部，土壤栽培條件下1基因在白果期的表達(dá)量顯著高于基質(zhì)栽培，而在全紅期土壤栽培條件下1基因的表達(dá)量顯著低于基質(zhì)栽培。在果實(shí)基部和尖部，土壤栽培條件下果實(shí)中2基因的表達(dá)量在白果期均顯著高于基質(zhì)栽培，其他時(shí)期均無(wú)顯著性差異。進(jìn)一步分析表明，只有2的表達(dá)量在兩種栽培條件的果實(shí)中隨發(fā)育呈上升趨勢(shì)，且與蔗糖的積累呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)=0.567)(圖4)。這與土壤栽培條件下果實(shí)蔗糖含量高于基質(zhì)栽培條件下的果實(shí)相一致(圖1)。

圖3 基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下蔗糖合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式

圖4 蔗糖含量與FaSPS2基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

2.4 不同栽培條件下檸檬酸降解相關(guān)基因的表達(dá)模式

從圖5可以看出，隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，與檸檬酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)量有不同程度的差異，其中，1和3基因的表達(dá)量在土壤和基質(zhì)栽培條件下有顯著差異。在半紅期，果實(shí)基部基質(zhì)栽培的1基因比土壤栽培的表達(dá)量低，其他時(shí)期基質(zhì)栽培條件下1、3基因的表達(dá)量都高于土壤栽培。相關(guān)性分析結(jié)果表明，1、3基因的表達(dá)量與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān)(圖6)，這與基質(zhì)栽培條件下果實(shí)檸檬酸含量低于土壤栽培條件下的果實(shí)相符合(圖2)?；|(zhì)栽培和土壤栽培條件下果實(shí)基部1基因表達(dá)量?jī)H在半紅期有顯著差異，其他均無(wú)顯著差異。土壤栽培栽培條件下果實(shí)尖部2基因表達(dá)量?jī)H在全紅期顯著高于基質(zhì)栽培，果實(shí)基部2基因表達(dá)量?jī)H在半紅期顯著高于基質(zhì)栽培。土壤栽培條件下果實(shí)基部4基因的表達(dá)量?jī)H在半紅期顯著高于基質(zhì)栽培。

圖5 基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下檸檬酸降解相關(guān)基因的表達(dá)模式

圖6 檸檬酸含量與FaACO1基因和FaACO3基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本研究表明，參與蔗糖合成的關(guān)鍵基因2的表達(dá)量與蔗糖的積累呈正相關(guān)，與檸檬酸降解相關(guān)的關(guān)鍵基因1、3表達(dá)量與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān)，土壤栽培較基質(zhì)栽培更利于越心草莓積累蔗糖和檸檬酸。

栽培環(huán)境直接影響植株生長(zhǎng)狀況、產(chǎn)量和品質(zhì)。已有研究表明，土壤栽培比基質(zhì)栽培更有利于促進(jìn)草莓植株的生長(zhǎng)，果實(shí)的品質(zhì)、口感風(fēng)味也較好。分別用土壤和基質(zhì)進(jìn)行羅馬花椰菜栽培時(shí)，與基質(zhì)栽培相比，土壤栽培不僅可以提高單果重和產(chǎn)量，還能提高可溶性糖含量。本實(shí)驗(yàn)也得出了類似的結(jié)論，土壤栽培的越心草莓可以比基質(zhì)栽培積累更多的蔗糖和檸檬酸。也有研究表明，基質(zhì)栽培比土壤栽培在品質(zhì)改善方面更有效果。當(dāng)用海島土壤進(jìn)行草莓栽培時(shí)，其糖度會(huì)低于基質(zhì)栽培?；|(zhì)栽培的番茄能顯著提高凈光合速率，有利于培育壯苗，提高可溶性糖含量，改善糖酸比。導(dǎo)致這些研究結(jié)果不一致的原因，除了作物種類不同外，還有可能與品種特性、栽培環(huán)境的理化特性，以及所含的有效營(yíng)養(yǎng)元素含量有關(guān)。

草莓果實(shí)中蔗糖分布具有一定的梯度，果實(shí)尖部的含量大于基部含量。本研究發(fā)現(xiàn)，不同栽培環(huán)境不會(huì)改變這一特性。草莓土壤栽培較基質(zhì)栽培顯著提高了蔗糖含量，主要是提高了尖部的蔗糖含量，但兩種栽培方式下果實(shí)基部蔗糖含量差異不顯著。1、2、1、2、3等基因在草莓果實(shí)蔗糖合成與積累中扮演了重要的角色，然而本研究顯示，這些基因的表達(dá)量并沒(méi)有一定的規(guī)律。進(jìn)一步將基因表達(dá)量與糖含量進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，只有2的表達(dá)量在兩種栽培條件的果實(shí)中隨發(fā)育呈上升趨勢(shì)，且與蔗糖的積累呈正相關(guān)。

檸檬酸是草莓果實(shí)中最重要的有機(jī)酸，與可溶性糖一起決定了果實(shí)的主要口感。無(wú)論是土壤栽培還是基質(zhì)栽培，果實(shí)基部和尖部的檸檬酸含量相差不大。白果后期，隨著果實(shí)的發(fā)育檸檬酸逐漸被降解，起作用的基因有1、2、4、1、3等。本研究顯示，白果期草莓的檸檬酸含量最高，隨著果實(shí)不斷成熟，檸檬酸含量逐漸降低。在全紅期，土壤栽培的果實(shí)檸檬酸含量顯著高于基質(zhì)栽培。由于1、3基因在果實(shí)成熟過(guò)程中主要負(fù)責(zé)檸檬酸的降解，且與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān)。因此推測(cè)，1、3的表達(dá)量差異可能是引起土壤栽培與基質(zhì)栽培草莓果實(shí)檸檬酸含量差異的主要原因。