潘旭婕，劉瑞玲，鄧尚貴，吳偉杰，陳杭君，郜海燕，*

(1.浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

楊梅()為楊梅科(Myricaeac)楊梅屬()植物，是我國的特色水果。我國楊梅種植面積和產(chǎn)量占全球楊梅種植面積和產(chǎn)量的90%以上。楊梅喜溫暖濕潤，原產(chǎn)于我國東南地區(qū)，其中以浙江省的品質(zhì)最好。楊梅果實(shí)酸甜可口，富含多酚、花色苷等生物活性成分。楊梅鮮果無果皮包裹，且多成熟于高溫的梅雨季節(jié)，貯藏期短且極易腐爛，因此除新鮮食用外，楊梅還多用于加工成果汁、果酒和罐頭等產(chǎn)品，發(fā)酵楊梅果醬類加工產(chǎn)品，目前在市場上還較為少見。

益生菌(probiotics)是一類可以改善腸道菌群平衡的活性微生物。近年來，有關(guān)益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品的研究逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，通過乳酸菌發(fā)酵，可以提高產(chǎn)品的抗氧化活性，分解大分子物質(zhì)，增加產(chǎn)品風(fēng)味，還能豐富產(chǎn)品的口感，增加營養(yǎng)功能特性。

近年來，乳酸菌發(fā)酵工藝逐漸被應(yīng)用于臍橙、桑葚等果醬的加工中，以改善產(chǎn)品風(fēng)味。故優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵楊梅果醬工藝條件，并分析發(fā)酵對其風(fēng)味的影響，對楊梅果醬的開發(fā)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東魁楊梅，采自浙江省仙居南峰水果合作社；伊仕特酸奶發(fā)酵劑(主要菌種為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌，活菌數(shù)≥1×10CFU·mL)，購自湖北安琪酵母股份有限公司；白砂糖，購于本地聯(lián)華超市；檸檬酸、異抗壞血酸鈉、果膠、卡拉膠(食品級)，購于浙江一諾生物科技有限公司；氯化鈉(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；蘋果酸、檸檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、奎尼酸、琥珀酸、富馬酸(純度均大于95%)標(biāo)準(zhǔn)樣品，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純)，購自美國泰迪亞公司。

電子天平，余姚市金諾天平儀器有限公司；手持糖度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DS-1高速組織搗碎儀。Waters e2695分析型高效液相色譜儀(配有自動進(jìn)樣器、二極管陣列紫外檢測器)，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵楊梅果醬工藝流程

楊梅清洗去核護(hù)色打漿熬煮白砂糖接種乳酸菌發(fā)酵增稠劑(加熱濃縮)成品。

挑選無損傷且大小成熟度一致的楊梅，用清水漂洗去核后，于1%檸檬酸與異抗壞血酸鈉復(fù)配(體積比1∶1)溶液中護(hù)色30 min，以質(zhì)量體積比2∶1加水打漿，備用。熬煮后加入10%白砂糖，冷卻后接種1%乳酸菌劑，于37 ℃恒溫發(fā)酵12 h，加入0.4%增稠劑后于60 ℃加熱濃縮，待可溶性固形物含量達(dá)到40%后密封裝罐。

1.2.2 未發(fā)酵楊梅果醬工藝流程

未發(fā)酵楊梅果醬除不接種乳酸菌外，其余步驟與發(fā)酵果醬一致。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以感官評分為指標(biāo)，對發(fā)酵時間、蔗糖添加量、乳酸菌接種量、增稠劑添加量進(jìn)行初步篩選，每項(xiàng)因素選取5個水平。發(fā)酵時間為8、10、12、14、16 h，固定乳酸菌接種量1.0%，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量8%；蔗糖添加量為6%、8%、10%、12%、14%，固定乳酸菌接種量1%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間12 h；乳酸菌接種量為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，固定發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量8%；增稠劑添加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，固定乳酸菌接種量1.0%，發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量8%。

分別選擇檸檬酸、異抗壞血酸鈉、檸檬酸復(fù)配以抗壞血酸鈉(1∶1)、檸檬酸復(fù)配氯化鈉(1∶1)、異抗壞血酸鈉復(fù)配氯化鈉(1∶1)5種護(hù)色劑，添加量均為1.0%，護(hù)色時間30 min，以色澤和花色苷含量評價其對乳酸菌發(fā)酵楊梅果醬工藝的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定乳酸菌發(fā)酵條件中的乳酸菌添加量(0.8%、1.0%、1.2%)、發(fā)酵時間(8、10、12 h)和蔗糖添加量(8%、10%、12%)這3個因素作為響應(yīng)面試驗(yàn)中的自變量進(jìn)行研究，以感官評分作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化出乳酸菌發(fā)酵低糖楊梅果醬的最佳工藝。

1.2.5 楊梅果醬有機(jī)酸含量測定

參考關(guān)秀杰等的方法，并作修改。采用高效液相色譜法測定果醬8種有機(jī)酸含量。

色譜條件：迪馬C18反相色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d.)。柱溫40 ℃，流動相A為4%乙酸，流動相B為甲醇，等度洗脫[(A)∶(B)=20∶80]，流速1 mL·min。

1.2.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

揮發(fā)性風(fēng)味成分萃?。翰捎肧PME-GC-MS測定揮發(fā)性風(fēng)味成分，參考程煥的方法，稍作修改。升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持5 min，以5 ℃·min升到180 ℃，保持1 min，再以10 ℃·min升到240 ℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣，恒定流速1.5 mL·min。

定性分析：揮發(fā)性物質(zhì)通過NIST MS Search 2.3質(zhì)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的圖譜對比，采用反匹配度大于800的物質(zhì)。

定量分析：以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)物，采用ROAV法評價楊梅果醬各揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)度。

1.2.7 感官評價

參照GB/T 22474—2008《果醬》和楊穎等的方法，制定乳酸菌發(fā)酵低糖楊梅果醬綜合評價標(biāo)準(zhǔn)，感官評價由10位身體健康、具有分辨能力的食品專業(yè)學(xué)生組成，從口感、風(fēng)味、色澤、組織狀態(tài)和酸甜度5個方面對發(fā)酵果醬進(jìn)行評定，去掉一個最高分，去掉一個最低分，取平均值后即為結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均方差分析(<0.05)。用Excel 2010進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同種類護(hù)色劑對楊梅果醬花色苷含量的影響

花色苷是楊梅果實(shí)中的一種天然色素，屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抑菌等作用。楊梅的紅色主要是由于花色苷的存在，花色苷的含量直接影響楊梅果醬的主要顏色。如圖1-A所示，代表明暗度，代表紅綠色，代表黃藍(lán)色，用檸檬酸復(fù)配異抗壞血酸鈉進(jìn)行護(hù)色的果醬的和最大，說明以檸檬酸復(fù)配異抗壞血酸鈉的果醬最明亮，顏色更接近紅色。圖1-B以花色苷含量為評價指標(biāo)，測定經(jīng)不同護(hù)色劑護(hù)色30 min后，用檸檬酸復(fù)配異抗壞血酸鈉進(jìn)行護(hù)色的果醬花色苷含量最高。綜上所述，由檸檬酸復(fù)配異抗壞血酸鈉進(jìn)行護(hù)色的果醬更接近楊梅果實(shí)的紅色，同時還能保留更多花色苷含量。

圖1 不同種類護(hù)色劑對楊梅果醬顏色和花色苷含量的影響

2.1.2 發(fā)酵條件對楊梅果醬綜合感官評分的影響

乳酸菌發(fā)酵能夠賦予果醬特殊的風(fēng)味，通過考察乳酸菌添加量、發(fā)酵時間和蔗糖添加量3個發(fā)酵條件對綜合感官評分的影響。如圖2-A所示，乳酸菌接種量為1.0%時，綜合感官評分最高為80.375分。當(dāng)乳酸菌添加量在0.6%～1.0%，感官評分隨著乳酸菌添加量的增加而上升；當(dāng)乳酸菌添加量在1.0%～1.4%時，由于發(fā)酵產(chǎn)生的酸味掩蓋楊梅果醬本身的果香味，導(dǎo)致感官評分顯著降低；如圖2-B所示，當(dāng)發(fā)酵時間為10 h時，綜合感官評分為83.625分。當(dāng)發(fā)酵時間小于10 h時，發(fā)酵時間較短，果醬風(fēng)味單一；當(dāng)發(fā)酵時間大于10 h，發(fā)酵時間過長，產(chǎn)生的不良風(fēng)味掩蓋了果醬本身的風(fēng)味，導(dǎo)致感官評分急劇降低；如圖2-C所示，當(dāng)蔗糖添加量為10%時，綜合感官評分最高，為72.857分。外源添加的蔗糖不僅可以作為乳酸菌發(fā)酵的原料，促進(jìn)生長代謝，還可以中和乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)生的酸味。當(dāng)蔗糖添加量小于10%時，無法中和過多酸味，導(dǎo)致口感不佳；當(dāng)蔗糖添加量高于10%時，蔗糖的甜味掩蓋了果醬的風(fēng)味，口感甜膩，評分降低。

圖2 發(fā)酵條件對楊梅果醬綜合感官評分的影響

2.1.3 增稠劑添加量對楊梅果醬綜合感官評分的影響

適量的增稠劑能夠增加果醬厚實(shí)的口感并形成凝膠狀的醬體形態(tài)。如圖3所示，當(dāng)增稠劑添加量為0.4%(果膠∶卡拉膠=1∶1)時，綜合感官評分最高，為80.375分。增稠劑添加量小于0.4%時，果醬醬體黏稠度不夠，有汁液分離、流散現(xiàn)象；當(dāng)添加量高于0.4%時，果醬醬體黏稠，不易涂抹，且添加量過高時，醬體黏度反倒有所降低，口感硬實(shí)，導(dǎo)致感官評分驟降。

圖3 增稠劑添加量對楊梅果醬綜合感官評分的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到楊梅果醬發(fā)酵工藝感官評分()的多元二次回歸方程：

=84+1.88A+0.75B+0.88C+AB-1.25AC+1.5BC-9.13A-1.88B-4.12C。

對模型進(jìn)行顯著性驗(yàn)證檢驗(yàn)表明(表1)，該回歸模型=149.05，<0.000 1<0.01，模型回歸極顯著。同時，失擬項(xiàng)=0.702 2>0.05，模型不顯著，表示模型預(yù)測值與實(shí)際值擬合程度高。回歸系數(shù)=0.994 8，說明模型與試驗(yàn)擬合程度高，可用該模型對發(fā)酵楊梅果醬的感官評分進(jìn)行分析和預(yù)測。

表1 回歸模型方差分析

如表2所示，蔗糖添加量和發(fā)酵時間對感官評分均有顯著影響，乳酸菌添加量對感官評分的影響極顯著。同時，各因素的交互作用對感官評分均有顯著影響。因素值越大，反映出其對試驗(yàn)指標(biāo)影響越大。通過分析可知，影響楊梅發(fā)酵果醬感官評分因素的主次排列順序?yàn)椋喝樗峋砑恿?發(fā)酵時間>蔗糖添加量。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.2 因素間的交互作用

響應(yīng)面曲線是由響應(yīng)值與任意兩個試驗(yàn)因素構(gòu)成的三維曲面圖，可通過每個曲面的彎曲弧度來判斷各因素之間的交互作用，彎曲程度越大，說明交互作用越強(qiáng)。等高線則反映了兩個因素交互作用的顯著程度，越接近圓形交互作用越不明顯。圖4反映了乳酸菌添加量、發(fā)酵時間和蔗糖添加量3個試驗(yàn)因素以感官評分為響應(yīng)值的曲線圖。

由圖4可知，A中曲線彎曲程度最大，說明乳酸菌添加量和蔗糖添加量的交互作用極顯著，B中曲線最為平緩，表明乳酸菌添加量和發(fā)酵時間的交互作用不顯著，C中曲線彎曲程度較大，說明蔗糖添加量和發(fā)酵時間的交互作用顯著。由等高線圖可知，圖4-A形狀更接近橢圓，所以，乳酸菌添加量與蔗糖添加量的交互作用對感官評分的影響最顯著(<0.01)。

圖4 乳酸菌添加量、蔗糖添加量和發(fā)酵時間對楊梅果醬感官評分響應(yīng)面圖

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過數(shù)學(xué)模型對乳酸菌發(fā)酵低糖楊梅果醬工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析獲得最佳工藝配方為乳酸菌添加量1.02%，蔗糖添加量10.57%，發(fā)酵時間10.28 h，預(yù)測感官評分最終得分為84.2709分。為便于實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為乳酸菌添加量1.0%，蔗糖添加量10.5%，發(fā)酵時間10.3 h。在優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評價平均得分為81.625分，與模型預(yù)測值基本相符，說明該模型與實(shí)際情況較為擬合，優(yōu)化所得的工藝參數(shù)合理，具有實(shí)用價值。

2.3 不同楊梅果醬有機(jī)酸分析

果實(shí)中有機(jī)酸的組成與含量是影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，如表3所示，在檢測的8種有機(jī)酸中，發(fā)酵楊梅果醬相比未發(fā)酵楊梅果醬，乳酸含量由6.191 mg·g顯著上升至65.481 mg·g(<0.05)，這是因?yàn)槿樗峋诎l(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸。檸檬酸含量也有上升，在糖酵解過程中，乳酸菌能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)而通過檸檬酸循環(huán)，產(chǎn)生檸檬酸。其中，發(fā)酵楊梅果醬的草酸含量雖略高于未發(fā)酵楊梅果醬，在檢測的7種有機(jī)酸中含量最低，對楊梅果醬的風(fēng)味影響不大。據(jù)研究，草酸經(jīng)人體代謝后的酸性產(chǎn)物，會導(dǎo)致酸堿平衡失衡，過多攝入更會導(dǎo)致中毒。發(fā)酵楊梅果醬中的奎寧酸、蘋果酸、富馬酸和琥珀酸含量相較于未發(fā)酵楊梅果醬略有下降，這與申光輝等在桑葚中的研究結(jié)果一致，但由于其含量不高，因此對發(fā)酵果醬的實(shí)際風(fēng)味影響不大。綜上所述，乳酸菌發(fā)酵顯著增加了楊梅果醬乳酸、檸檬酸的含量，改善了發(fā)酵楊梅果醬的品質(zhì)。

表3 低糖發(fā)酵楊梅果醬與新鮮果漿、未發(fā)酵果醬有機(jī)酸含量比較

2.4 不同楊梅果醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

使用SPME-GC-MS分別對新鮮楊梅果漿、未發(fā)酵楊梅果醬和發(fā)酵楊梅果醬的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示：在發(fā)酵楊梅果醬中檢測出揮發(fā)性風(fēng)味成分共31種，包括酯類2種、酸類3種、烷烴類1種、醛類8種，酮類2種、醇類5種、烯烴類9種、芳香族1種；在未發(fā)酵楊梅果醬中檢測出揮發(fā)性風(fēng)味成分共29種，其中酸類2種、烷烴類1種、醛類8種、酮類2種、醇類2種、烯烴類13種、芳香族1種；在新鮮楊梅果槳中檢測出32種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中酯類4種、烷烴類1種、醛類9種、酮類1種、醇類3種、烯烴類12種、芳香族2種，共計(jì)49種揮發(fā)性風(fēng)味成分。

表4 低糖發(fā)酵楊梅果醬與新鮮果漿、未發(fā)酵果醬揮發(fā)性成分及含量

根據(jù)計(jì)算出的ROAV值，發(fā)酵楊梅果醬中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分(ROAV≥1)有3種，分別為(E)-2-庚烯醛、石竹烯和蛇麻烯，起重要修飾作用的揮發(fā)性風(fēng)味成分(0.1≤ROAV<1)有7種，分別為乙酸、己醛、糠醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、癸醛和鄰苯二甲酸正丁異辛酯；未發(fā)酵楊梅果醬中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分(ROAV≥1)有4種，分別為芳樟醇、(E)-2-壬烯醛、十一醛和石竹烯，起重要修飾作用的揮發(fā)性風(fēng)味成分(0.1≤ROAV<1)有7種，分別為己醛、糠醛、辛醛、壬醛、2，6-壬二烯醛、癸醛和蛇麻烯；新鮮楊梅果漿中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分(ROAV≥1)有3種，為芳樟醇、(E)-2-壬烯醛和石竹烯，起重要修飾作用的揮發(fā)性風(fēng)味成分(0.1≤ROAV<1)有4種，壬醛、2，6-壬二烯醛、十一醛和蛇麻烯。石竹烯在2種楊梅果醬與新鮮楊梅果漿中都是檢出含量最高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有木質(zhì)香和辛香，這與陳亦欣等的研究結(jié)果一致。乙酸和芳樟醇也對發(fā)酵楊梅果醬的風(fēng)味具有貢獻(xiàn)作用，Kang等鑒定出楊梅中重要的香氣化合物有石竹烯、薄荷醇、芳樟醇、乙酸等，但本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵果醬中檢測到的乙酸在新鮮楊梅果漿中并未檢測到，猜測是后期加熱和乳酸菌發(fā)酵過程導(dǎo)致乙酸的產(chǎn)生，芳樟醇則是新鮮楊梅中本就含有的特征風(fēng)味物質(zhì)。

與未發(fā)酵楊梅果醬和新鮮楊梅果漿相比，發(fā)酵楊梅果醬的主要風(fēng)味貢獻(xiàn)成分由(E)-2-壬烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)?E)-2-庚烯醛，同時糠醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮等揮發(fā)性物質(zhì)含量也增多，為楊梅果醬增添了更多木質(zhì)香、花香和脂香味，與新鮮楊梅果醬相比，未發(fā)酵果醬的乙醇含量下降。有關(guān)研究表明，添加非釀酒酵母可以減少葡萄酒的釀造過程中產(chǎn)生的不良風(fēng)味，降低乙醇含量，使香氣更復(fù)雜。烯烴類物質(zhì)是楊梅主要的揮發(fā)性物質(zhì)，通過對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵楊梅果醬與未發(fā)酵楊梅果醬、新鮮楊梅果漿有2種共同的主要風(fēng)味物質(zhì)——石竹烯和芳樟醇，是楊梅代表性的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，雖然石竹烯和芳樟醇的含量經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后降低，但是由于其氣味閾值較低，氣味活度值較高，對發(fā)酵楊梅果醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。說明乳酸菌發(fā)酵不僅保留了楊梅獨(dú)特的風(fēng)味，還為發(fā)酵果醬增加了更多的風(fēng)味，形成其獨(dú)特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出乳酸菌發(fā)酵低糖楊梅果醬的最佳工藝配方為：乳酸菌添加量1%，蔗糖添加量10.5%，發(fā)酵時間10.3 h，獲得的楊梅果醬呈明亮的深紅色，具有楊梅和乳酸菌發(fā)酵的獨(dú)特風(fēng)味，口感醇厚，酸甜適中，具有較好的延展性。乳酸菌發(fā)酵不僅增加了果醬中草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸的含量，尤其是乳酸和檸檬酸(<0.05)從滋味上增加了果醬風(fēng)味，改善了發(fā)酵果醬的口感；還在揮發(fā)性風(fēng)味方面，增加了(E)-2-庚烯醛等醛類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)，為果醬增添了更多木質(zhì)香、花香和脂香味，不僅保留了楊梅獨(dú)特的香氣，還豐富了果醬整體的風(fēng)味，開發(fā)了一種新型的風(fēng)味獨(dú)特的楊梅果醬。