王海波, 李芙蓉, 楊金翠, 郭俊云

( 1. 曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院, 云南 曲靖 655011; 2. 曲靖師范學(xué)院 云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 曲靖 655011 )

蔗糖非發(fā)酵-1型相關(guān)蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1 related protein kinase，SnRK)是廣泛存在于植物中的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)類蛋白激酶家族。根據(jù)氨基酸序列聚類結(jié)果，SnRK家族分為SnRK1、SnRK2、SnRK3三個(gè)亞家族。SnRK3又被稱為類鈣調(diào)磷酸酶B亞基互作蛋白激酶CIPK(calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)(Shi et al., 1999; Kim et al., 2000) 或鹽過敏感蛋白SOS(salt overly sensitive)(Ji et al., 2013)，類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like calcium sensor，CBL)是CIPK的直接上游互作蛋白，也能夠感知胞內(nèi)Ca信號(hào)，共同組成Ca-CBL-CIPK級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)，參與植物滲透、高鹽、低溫、高溫等非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程(Li et al., 2009; Sanyal et al., 2016)。作為Ca受體蛋白，CBL都含有4個(gè)保守性不同的“螺旋-環(huán)-螺旋”(helix-loop-helix，HLH)EF手型(EF-hand)基序，是Ca結(jié)合所必需的(Weinl & Kudla, 2009)，同時(shí)，部分CBL蛋白N端還具有脂類修飾的N-豆蔻?；?N-Myristoylation)或N-棕櫚?；?N-Palmitoylation)位點(diǎn)，輔助該蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Batistic et al., 2008)。CIPK蛋白N端激酶結(jié)構(gòu)域中都包含1個(gè)激活環(huán)(activation-loop)基序，位于-DFG-與-APE-序列之間，其中3個(gè)高度保守的Ser、Thr、Tyr殘基是激酶活性發(fā)揮所必須的(Guo et al., 2001)，而C端負(fù)責(zé)調(diào)控激酶結(jié)構(gòu)域的催化活性，其中由21或24個(gè)氨基酸殘基組成的FISL(Phe-Ile-Ser-Leu)/NAF(Asn-Ala-Phe)結(jié)構(gòu)域是CIPK與CBL結(jié)合的核心序列(Du et al., 2011)，正常情況下，F(xiàn)ISL/NAF結(jié)構(gòu)域與N端激酶結(jié)構(gòu)域互作從而具有自抑制作用，當(dāng)結(jié)合Ca而被激活的CBL蛋白與FISL/NAF結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可解除FISL/NAF結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)區(qū)的抑制作用，從而表現(xiàn)出激酶活性(Akaboshi et al., 2008)。另外，C端還包含1個(gè)由37個(gè)氨基酸殘基組成的PPI(protein phosphatase interaction)結(jié)構(gòu)域，決定與CIPK結(jié)合的蛋白磷酸酶PP2C(protein phosphatase 2C)種類，也競(jìng)爭(zhēng)性將CBL蛋白脫離FISL/NAF結(jié)構(gòu)域，使CIPK回到自抑制狀態(tài)(Ohta et al., 2003)。

目前，已經(jīng)對(duì)多種植物在全基因組水平進(jìn)行了與基因的鑒定，基因家族包括：擬南芥()10個(gè)(Kolukisaoglu et al., 2004)、水稻()10個(gè)(Kolukisaoglu et al., 2004)、玉米()10個(gè)(李利斌等, 2010)、楊樹()10個(gè)(Zhang et al., 2008)、小麥()7個(gè)(Sun et al., 2015)、油菜()7個(gè)(Zhang et al., 2014)、茄子()5個(gè)(Li et al., 2016)等；基因家族包括：擬南芥25個(gè)(Kolukisaoglu et al., 2004)、水稻33個(gè)(Kolukisaoglu et al., 2004; Kanwar et al., 2014)、玉米43個(gè)(Chen et al., 2011)、楊樹27個(gè)(Yu et al., 2007)、小麥20個(gè)(Sun et al., 2015)、大豆()52個(gè)(Zhu et al., 2016)、油菜23個(gè)(Zhang et al., 2014)、茄子15個(gè)(Li et al., 2016)、蘋果()34個(gè)(Niu et al., 2018)、葡萄()16個(gè)(路志浩等, 2017)、番茄()22個(gè)(王傲雪和劉思源, 2018)等。小桐子()屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Linnaeus)多年生落葉小型喬木，原產(chǎn)中南美洲地區(qū)(林娟等, 2004)。作為重要的木本油料植物，小桐子種子含油量為35%～60%，適應(yīng)各種柴油發(fā)動(dòng)機(jī)，且關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)達(dá)到了歐IV標(biāo)準(zhǔn)，具有廣闊的開發(fā)利用前景(Makkar & Becker, 2009)。目前，對(duì)于小桐子與家族的基因鑒定及其互作分析還未見報(bào)道。本研究基于小桐子基因組信息(Sato et al., 2011)，利用生物信息學(xué)方法鑒定小桐子與基因，并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白基序、系統(tǒng)進(jìn)化、低溫表達(dá)及功能互作進(jìn)行了分析，以期為研究小桐子與基因家族的抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CBL與CIPK基因家族的鑒定

根據(jù)Kolukisaoglu等(2004)、Zhang等(2008)、Yu等(2007)鑒定的模式植物擬南芥、水稻及小桐子近科物種楊樹的與基因家族序列，從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥10個(gè)基因與25個(gè)基因的蛋白序列，從PlantBiology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下載水稻10個(gè)基因與33個(gè)基因的蛋白序列，從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載楊樹10個(gè)基因與27個(gè)基因的蛋白質(zhì)序列，通過Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmbuild程序?qū)⒈葘?duì)文件生成CBL與CIPK結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫HMM模型。同時(shí)，分別從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/915/)與Kazusa(http://www.kazusa.or.jp/jatropha/)(Sato et al., 2011)下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用NCBI的Makeblastdb程序?qū)⒃摂?shù)據(jù)庫(kù)本地化。利用NCBI Blast程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地BlastP相似性比對(duì)(閾值E<1e-10，序列相似性>50%)，得到初步篩選的小桐子CBL與CIPK蛋白質(zhì)序列。通過序列自對(duì)比(self-blast)去除重復(fù)序列，將非冗余的候選序列利用Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)與CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線工具分析CBL的EF-hand基序與CIPK的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(protein kinase domain)做進(jìn)一步篩選，得到小桐子CBL與CIPK家族蛋白序列。同時(shí)下載其對(duì)應(yīng)的基因序列與mRNA序列用于后續(xù)基因結(jié)構(gòu)分析。

1.2 CBL與CIPK基因家族的序列分析

利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)小桐子CBL與CIPK進(jìn)行氨基酸數(shù)目、理論分子量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)等基本參數(shù)的分析。將鑒定的小桐子CBL與CIPK蛋白序列與擬南芥、水稻及楊樹的CBL與CIPK蛋白序列利用Clustal X進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用自展法(bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)，利用GenDOC軟件對(duì)Clustal X比對(duì)結(jié)果進(jìn)行CBL與CIPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。另外，通過CDS序列(coding sequence)與基因序列比對(duì)以確定與基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，并利用GSDS(gene structure display server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。另外，染色體定位以Wu等(2015)構(gòu)建的小桐子遺傳連鎖圖譜進(jìn)行錨定，并通過MapChart(version2.1)繪制基因定位圖。利用STRING(http://string-db.org)進(jìn)行CBL與CIPK蛋白的信號(hào)互作網(wǎng)絡(luò)分析(設(shè)置可信度大于0.7)。

1.3 CBL與CIPK基因家族的表達(dá)分析

從GenBank的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)下載小桐子不同器官的Illumina高通量測(cè)序數(shù)據(jù)(葉片SRR1639660、根SRR1639659、種子SRR1639661)。通過Bowtie2與Samtools工具將鑒定到的小桐子與家族基因與測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到各與基因的表達(dá)reads數(shù)據(jù)，之后通過Cufflinks程序計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量FPKM(fragments per kilobase per million)值，進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，并設(shè)置以基因與器官同時(shí)進(jìn)行聚類，聚類方法選擇層次聚類法(hierarchical clustering)。另外，以我們前期小桐子轉(zhuǎn)錄組(Wang et al., 2014)與數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression，DGE)(Wang et al., 2013)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，提取對(duì)照與12 ℃低溫處理12、24、48 h的與基因的原始Clean Taq數(shù)據(jù)，通過TPM(transcript per million clean tags)獲得標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量(Thoen et al., 2008; Morrissy et al., 2009)，得到小桐子與基因家族在低溫處理下的差異表達(dá)數(shù)據(jù)。利用R軟件(version 3.4.1)的gplots與pheatmap函數(shù)繪制聚類分析熱圖(heatmap)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBL與CIPK的鑒定及序列特征

通過同源序列比對(duì)檢索，在小桐子基因組中共鑒定到8個(gè)基因(1～8)與18個(gè)基因(1～18)(表1)。通過ExPASy工具對(duì)小桐子與家族基因進(jìn)行理化參數(shù)的分析，結(jié)果表明，家族基因長(zhǎng)度分布在2 172 bp(7)～9 344 bp(2)之間，蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度分布在211 aa(JcCBL8)～257 aa(JcCBL7)之間，等電點(diǎn)全部顯強(qiáng)酸性，分布在4.59(JcCBL5)～5.08(JcCBL4)之間。另外，家族基因長(zhǎng)度分布在1 522 bp(16)～9 348 bp(9)之間，蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度分布在422 aa(JcCIPK16)～484 aa(JcCIPK2)之間，除JcCIPK9、JcCIPK14、JcCIPK15及JcCIPK17，等電點(diǎn)全部呈強(qiáng)堿性，分布在8.03(JcCIPK2)～9.26(JcCIPK4)之間。

2.2 CBL與CIPK基因的系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)

通過MEGA分別構(gòu)建小桐子與擬南芥、水稻、楊樹的與基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，結(jié)果表明，基因家族聚類為I、II、III、IV四個(gè)亞族，小桐子對(duì)應(yīng)基因數(shù)量分別為3(4、6、8)、1(3)、2(5、7)、2(1、2)(圖1: A)，與小桐子基因家族單獨(dú)聚類結(jié)果吻合(圖2: A)，其中3在單獨(dú)聚類中與1、2距離較近，而在多物種共聚類中則屬單獨(dú)II亞族，與3基因結(jié)構(gòu)(9個(gè)外顯子)不同于1、2(10個(gè)外顯子)一致。另外，基因家族共聚類為6個(gè)亞族，小桐子對(duì)應(yīng)基因數(shù)量分別為3、1、5、2、2、5(圖1: B)，也與小桐子基因家族單獨(dú)聚類結(jié)果吻合(圖2: B)。

A. CBL基因家族; B. CIPK基因家族。下同。A. CBL gene family; B. CIPK gene family. The same below.圖 1 小桐子與擬南芥、水稻及楊樹CBL與CIPK基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig. 1 Phylogenetic relationship analysis of Jatropha curcas with Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, and Populus trichocarpa CBL and CIPK gene families

圖 2 小桐子CBL與CIPK家族基因的基因結(jié)構(gòu) Fig. 2 Gene structure features of CBL and CIPK gene families in Jatropha curcas

結(jié)合小桐子與基因家族的聚類結(jié)果，利用GSDS工具分析其基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，小桐子與基因家族的亞族聚類特性與基因結(jié)構(gòu)吻合。小桐子8個(gè)基因的外顯子數(shù)量為8～10個(gè)(表1)，且都包含5′-UTR與3′-UTR區(qū)域，其中亞族III的5(2 501 bp)與7(2 172 bp)都包含9個(gè)外顯子，且基因都較短，而亞族IV的1(7 811 bp)與2(9 344 bp)都包含10個(gè)外顯子，且基因都較長(zhǎng)(圖2: A)。Kolukisaoglu等(2004)報(bào)道的其他物種基因家族的聚類結(jié)果與基因結(jié)構(gòu)關(guān)系，小桐子基因家族也都包含5′-UTR與3′-UTR區(qū)域，18個(gè)基因成員根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為兩大類，11個(gè)基因包含1～2個(gè)外顯子，其中4、5、8、10、13、16和18僅包含1個(gè)外顯子，而1、2、3和6包含2個(gè)外顯子。另外，7個(gè)基因包含12～15個(gè)外顯子，其中7、9、11、12和17都包含15個(gè)外顯子，而14與15分別包含14個(gè)與12個(gè)外顯子(圖2: B)。

表 1 小桐子CBL與CIPK基因家族的序列特征Table 1 Sequence characteristic of Jatropha curcas CBL and CIPK gene families

2.3 CBL與CIPK氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域分析

Kolukisaoglu等(2004)研究表明，CBL蛋白含有4個(gè)保守性不同的EF-hand手型基序，螺旋-環(huán)-螺旋作為EF-hand的典型結(jié)構(gòu)，中間環(huán)(包含12個(gè)氨基酸殘基，共有序列為-DKDGDGKIDFEE-)的1(X)、3(Y)、5(Z)、7(-Y)、9(-X)、12(-Z)位氨基酸殘基較為保守，被認(rèn)為是CBL蛋白結(jié)合Ca所必需的(圖3: A)。通過分析8個(gè)小桐子CBL蛋白的氨基酸序列顯示，第一個(gè)EF-hand(EF1)都具有14個(gè)氨基酸殘基，不是典型的EF-hand結(jié)構(gòu)， 而第2～4個(gè)EF-hand(EF2-4)具有典型的12個(gè)氨基酸殘基，其中除第1位(Asp)和第12位(Glu)氨基酸絕對(duì)保守外，其他氨基酸位(3、5、7、9位)都發(fā)生了部分取代，且EF4、EF3和EF2的氨基酸取代率逐漸增加。另外，第3位Asp(D)在EF2中被Lys(K)取代，在EF3中被Lys(K)與Arg(R)取代，在EF4中被Lys(K)與Asn(N)取代；第5位Asp(D)在EF2中被Asn(N)與Lys(K)取代，在EF3中被Gln(Q)與Asn(N)取代；第7位Lys(K)在EF2中被Val(V)與Ile(I)取代，在EF3中被Phe(F)與Try(Y)取代；第9位Asp(D)在EF2與EF3中都被Glu(E)取代(圖3: B)。以上結(jié)果顯示，EF-hand2-4結(jié)構(gòu)中都被相同類型的氨基酸取代，保證了EF-hand結(jié)合Ca的能力與多樣性。另外，根據(jù)N端區(qū)域的長(zhǎng)度，小桐子CBL家族的JcCBL1、JcCBL2、JcCBL3、JcCBL4、JcCBL6和JcCBL8包含16～34 aa較短的N端序列，且在JcCBL3與JcCBL8 N端鑒定到-MGCXXSK/T-的豆蔻?；蛄?，以加強(qiáng)CBL蛋白與膜的結(jié)合，而JcCBL5與JcCBL7則包含較長(zhǎng)的N端序列(圖3: A)。

A. 小桐子CBL蛋白N端結(jié)構(gòu)域，下劃線表示JcCBL3與JcCBL8的N端豆蔻?；Y(jié)構(gòu)域; B. 小桐子CBL蛋白4個(gè)EF手型基序序列比對(duì)(EF1-4); C. 小桐子CIPK蛋白N端激酶結(jié)構(gòu)域中的功能激活環(huán)，箭頭表示保守的Ser、Thr、Tyr殘基; D. 小桐子CIPK蛋白FISL/NAF結(jié)構(gòu)域。A. N-terminal domain of J. curcas CBL proteins, N-Myristoylation domains of JcCBL3 and JcCBL8 were underlined; B. Sequence alignment of CBL EF-hand (EF1-4) in J. curcas; C. Activation loop within N-terminal kinase domain in J. curcas CIPK protein was presented, conserved amino acid residues of Ser, Thr, and Tyr were marked by arrows; D. FISL/NAF domain of J. curcas CIPK proteins.圖 3 小桐子CBL與CIPK結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Fig. 3 Sequence alignment of Jatropha curcas CBL and CIPK domains

植物特有的CIPK蛋白也稱為SnRK3，該激酶與酵母SNF1、哺乳動(dòng)物AMPK同源，都具有N端激酶結(jié)構(gòu)域，其中內(nèi)部激活環(huán)(activation-loop)基序發(fā)揮核心作用。在小桐子18個(gè)CIPK蛋白的N-端都鑒定到被-DFG-與-APE-序列(圖3: C下劃線表示)間隔的激活環(huán)基序(圖3: C)，且都包含保守的Ser、Thr和Tyr氨基酸殘基(圖3: C箭頭所示)。另外，在C端都鑒定到CIPK蛋白21 aa自抑制基序FISL/NAF的保守-NAF-序列(圖3: D下劃線表示)，以保證CIPK蛋白正常處于自抑制狀態(tài)。

2.4 CBL與CIPK基因家族的染色體定位

依據(jù)Wu等(2015)構(gòu)建的小桐子高密度遺傳連鎖圖譜，在染色體水平定位小桐子與基因，結(jié)果表明，除5號(hào)與7號(hào)染色體沒有基因分布外，26個(gè)小桐子與基因不均勻地分布于9條染色體上，其中3號(hào)與11號(hào)染色體上的基因數(shù)量最多5個(gè)，而10號(hào)染色體上的基因數(shù)量最少，僅包含1個(gè)6基因，進(jìn)一步鑒定到9號(hào)染色體上基因家族的串聯(lián)復(fù)制基因6/8，以及3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)染色體上基因家族的串聯(lián)復(fù)制基因2/4、3/13和1/16(圖4)，推測(cè)該類基因發(fā)生了倍增。

豎線表示基因串聯(lián)復(fù)制; 刻度表示厘摩; LG表示染色體。Vertical line indicates tandem duplication; Scale is in centiMorgans (cM); LG means chromosome.圖 4 小桐子CBL與CIPK基因家族的染色體定位Fig. 4 Chromosomal localization of Jatropha curcas CBL and CIPK gene families

2.5 CBL與CIPK基因的差異表達(dá)分析

基于GenBank小桐子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過Cufflinks程序得到小桐子與基因家族26個(gè)基因的器官表達(dá)數(shù)據(jù)(圖5)。結(jié)果表明，除6與8在種子中沒有表達(dá)外，其他24個(gè)小桐子與基因在葉片、根及種子中都有表達(dá)。其中，2、1、3、5、7、8、13和18在三種器官中表達(dá)量都較高(logFPKM>3.5)，其中5在三種器官中表達(dá)量都最高，推測(cè)在小桐子Ca-CBL-CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中處于核心地位。其他基因存在器官表達(dá)特異性，4在葉片中表達(dá)量較高，而在種子中表達(dá)量較低；7只在根中表達(dá)，而在葉片與種子中表達(dá)量甚微；4在葉片與根中表達(dá)量較高，而在種子中基本沒有表達(dá)(圖5)。

圖 5 小桐子CBL與CIPK家族基因的器官差異表達(dá)分析Fig. 5 Differential expression analysis of Jatropha curcas CBL and CIPK gene families in different organs

通過DGE數(shù)據(jù)分析得到9個(gè)小桐子與家族基因在低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)數(shù)據(jù)(圖6)。與對(duì)照相比，14與18在12 ℃低溫處理12、24、48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)量都達(dá)到了極顯著水平(<0.01)，與小桐子的抗冷性直接相關(guān)。另外，4與16隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量也在逐漸提高，在低溫處理48 h時(shí)，分別較對(duì)照上調(diào)表達(dá)9.92倍(<0.01)與2.10倍。同時(shí)，1與2是響應(yīng)低溫較快的基因，其表達(dá)量都在低溫處理12 h時(shí)達(dá)到最大，分別較對(duì)照上調(diào)表達(dá)5.21倍與2.87倍，之后表達(dá)量逐漸下調(diào)(圖6)。

圖 6 小桐子CBL與CIPK家族基因的低溫處理表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis of Jatropha curcas CBL and CIPK gene families under chilling stress

2.6 CBL與CIPK蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)解析

基于小桐子、擬南芥CBL和CIPK同源蛋白，通過STRING 10.5進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，以解析其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及可能的潛在功能。結(jié)果表明，在可信度為0.7的情況下，除JcCIPK1、JcCIPK3、JcCIPK4和JcCIPK6外，另外8個(gè)JcCBLs與14個(gè)JcCIPKs都參與了典型的CBL-CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且表現(xiàn)出一對(duì)多與多對(duì)一的互作模式。其中，JcCBL1/2、JcCBL3可分別與12個(gè)、10個(gè)JcCIPKs互作結(jié)合，推測(cè)兩者在Ca-CBL-CIPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，而JcCBL6只能與JcCIPK7和JcCIPK16互作結(jié)合。同時(shí)，JcCIPK7可以與所有8個(gè)小桐子JcCBLs結(jié)合，而JcCIPK17與JcCIPK18僅可與JcCBL1/2結(jié)合(圖7)。

圖 7 小桐子與擬南芥同源CBL與CIPK蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 7 Interaction network analysis of CBL and CIPK proteins identified in Jatropha curcas and homologous proteins in Arabidopsis thaliana

3 討論與結(jié)論

傳遞類Ca結(jié)合蛋白CBL通過解碼與感知Ca濃度與分布的變化(Scrase-Field & Knight, 2003; Batistic & Kudla, 2012)，并特異結(jié)合下游CIPK蛋白共同組成Ca-CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)參與小桐子的抗冷性過程(Sanders et al., 2002)。本研究在小桐子全基因組共鑒定到8個(gè)基因與18個(gè)基因，其蛋白長(zhǎng)度、基因結(jié)構(gòu)都較為保守，尤其CBL與CIPK蛋白的等電點(diǎn)都具有顯著的家族特異性，CBL蛋白等電點(diǎn)都呈酸性，而CIPK蛋白等電點(diǎn)大部分都呈堿性，即生理pH環(huán)境條件下，這兩類互作蛋白帶相反的電荷，預(yù)示靜電庫(kù)倫力在CBL蛋白結(jié)合CIPK蛋白FISL/NAF結(jié)構(gòu)域中可能發(fā)揮重要作用。同時(shí)，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，小桐子與擬南芥CBL與CIPK互作結(jié)合還表現(xiàn)出交叉性與偏好性(Kim et al., 2000; Guo et al., 2001)，如小桐子JcCBL1/2可以與12個(gè)JcCIPKs結(jié)合，而JcCIPK7可與所有鑒定的小桐子JcCBLs結(jié)合，另外，JcCIPK17與JcCIPK18偏好結(jié)合JcCBL1/2，而JcCIPK8/10則偏好結(jié)合JcCBL4/8。本研究結(jié)果與Kim等(2000)的類似，擬南芥AtCIPK7/17偏好結(jié)合AtCBL9；AtCIPK24偏好結(jié)合AtCBL4；AtCIPK9偏好結(jié)合AtCBL2。這種特異性與偏好性，主要由CBL蛋白的EF手型基序決定的Ca結(jié)合能力(Nagae et al., 2003; Sanchez-Barrena et al., 2005)、CIPK蛋白的FISL/NAF結(jié)構(gòu)域及其兩側(cè)序列結(jié)構(gòu)差異性決定(Kim et al., 2000; Halfter et al., 2000; Guo et al., 2001)。與典型的12個(gè)氨基酸殘基EF手型基序不同，8個(gè)小桐子CBL蛋白的第一個(gè)EF手型基序都由14個(gè)氨基酸殘基組成，較其他3個(gè)EF手型基序都變異較大，且Asp(D)多被Ser(S)取代，推測(cè)該基序決定了小桐子CBL蛋白與Ca不同的親和力，賦予小桐子CBL蛋白同時(shí)解碼不同Ca信號(hào)的能力(Sanchez-Barrena et al., 2007；Weinl & Kudla, 2009)。當(dāng)CIPK蛋白的FISL/NAF結(jié)構(gòu)域結(jié)合CBL后，導(dǎo)致CIPK激酶結(jié)構(gòu)域中激活環(huán)保守氨基酸磷酸化而被激活(Weinl & Kudla, 2009)。本研究中小桐子CIPK蛋白激活環(huán)都位于保守的-DFG-與-APE-之間，且都鑒定到三個(gè)保守磷酸化的Ser(S)、Thr(T)及Tyr(Y)殘基作為激活位點(diǎn)。

從低等到高等植物，CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)化與植物的環(huán)境適應(yīng)性如生物與非生物脅迫是協(xié)同的(Weinl & Kudla, 2009)。小桐子起源熱帶，具備較強(qiáng)的抗旱、抗鹽能力，但對(duì)低溫環(huán)境耐受力有限。CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)的研究始于擬南芥高鹽超敏感SOS途徑(salt overly sensitive)，當(dāng)擬南芥遭受高鹽脅迫時(shí)，AtCBL4(SOS3)、AtCBL10結(jié)合Ca，再與AtCIPK24(SOS2)結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，通過AtCBL4/10-AtCIPK24途徑調(diào)控細(xì)胞膜與液泡膜上Na-K逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)，將過量的Na泵動(dòng)至胞外或區(qū)隔化至液泡中，從而抵抗或減輕高鹽脅迫的傷害(Zhu, 2002; Quan et al., 2007)，根據(jù)擬南芥同源蛋白比較，小桐子對(duì)應(yīng)的SOS級(jí)聯(lián)途徑為JcCBL4/5/7-JcCIPK12?；谕瑯拥姆椒?，本研究還鑒定到小桐子抗旱信號(hào)途徑JcCBL3-JcCIPK15，而對(duì)應(yīng)擬南芥通過AtCBL1/9-AtCIPK1信號(hào)途徑進(jìn)行感知，并促進(jìn)基因家族表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)滲透平衡，以達(dá)到抗旱的目的(Dangelo et al., 2006)。作為低溫敏感植物，小桐子在低溫環(huán)境下，同樣會(huì)啟動(dòng)CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)，并傳遞至下游抗冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或關(guān)鍵限速蛋白的基因。本研究中，通過小桐子12 °C低溫處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，也鑒定到與小桐子抗冷性密切相關(guān)的14與18，成為后續(xù)克隆與抗冷性功能鑒定的重要候選基因。文獻(xiàn)報(bào)道，低溫脅迫下，擬南芥通過AtCBL1-AtCIPK3感知將信號(hào)傳遞至下游抗冷性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如RD29A (Kim et al., 2003)，而水稻和玉米分別通過OsCIPK3與ZmCIPK3作用于滲透相關(guān)基因，通過提高轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸和可溶性糖含量，進(jìn)而提高其抗冷性(Xiong et al., 2007; 邊鳴鏑等, 2008)，說明以上轉(zhuǎn)錄因子與代謝途徑是驗(yàn)證小桐子CBL-CIPK低溫信號(hào)途徑下游作用機(jī)制的主要研究方向。