張藝帆， 繆瀟瑤， 肖炳坤， 楊建云， 董藝普， 黃榮清*

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850； 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 511436)

保元湯源自明代孫志宏所著《簡明醫(yī)彀》，全方組成為：人參一錢，黃芪二錢，甘草五分，肉桂二分，加生姜一片，水煎服。人參、黃芪大補元氣，扶助心氣；甘草炙用，甘溫益氣，通經(jīng)利脈，行血氣；肉桂辛熱補陽，溫通血脈，全方以益氣、補虛、培元為主，主治元氣虛弱之證?！稄埵厢t(yī)通·祖劑》將此方列為補氣類諸方之首[1]，并被《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》所收錄。研究表明，保元湯具有保護心血管系統(tǒng)的藥理活性，可用于治療冠心病[2]、心肌梗死[3]和慢性心衰[4]等心血管疾病，對心肌細(xì)胞具有一定保護作用[5-6]。同時該方可調(diào)節(jié)免疫功能[7]，抗缺氧[8]，臨床上常與他方合用治療氣虛血瘀引起的多種病癥[9-10]。

目前有關(guān)中藥復(fù)方的療效及優(yōu)勢大多來源于臨床經(jīng)驗的總結(jié)。代謝組學(xué)通過考察生物體受到外界刺激或擾動前后的變化，追溯至代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)，進而闡明疾病的發(fā)生發(fā)展及藥物的作用機制[11]，強調(diào)系統(tǒng)的整體性和動態(tài)性?；诩膊『退幬锔深A(yù)下的代謝網(wǎng)絡(luò)的變化來評價中藥復(fù)方的整體效應(yīng)[12]，其全景式、綜合性和整體互動性與中藥多組分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點不謀而合。代謝組學(xué)已越來越多被應(yīng)用到中藥配伍的藥效研究中[13]。

血虛證是指因血液虧虛，臟腑、經(jīng)絡(luò)、組織失于濡養(yǎng)而表現(xiàn)出來的虛證，是中醫(yī)臨床常見證候之一[14]。目前僅依靠單一成分或生化指標(biāo)難以全面解釋血虛證治療機制。研究表明，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)通過殺傷免疫細(xì)胞(特別是白細(xì)胞)從而導(dǎo)致機體免疫功能低下[15]，注射CTX可顯著抑制動物胸腺、脾臟功能[16]，改變小鼠血清代謝輪廓[17]?，F(xiàn)采取腹腔注射CTX建立免疫抑制模型，模擬中醫(yī)癥候血虛證的病理情況，選擇四物湯作為陽性對照藥[18]，運用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)的代謝組學(xué)技術(shù)觀察造模后小鼠代謝輪廓的改變，對保元湯在血虛證小鼠模型中的干預(yù)作用以及相應(yīng)的差異性代謝物進行研究。從分子水平分析代謝通路并闡述其作用機制，進而評價中藥復(fù)方保元湯治療血虛證的整體藥效，以期為古典名方的現(xiàn)代開發(fā)和應(yīng)用提供一定的參考，在中醫(yī)治療血虛證及代謝通路的闡釋方面具備一定的新穎性和前瞻性。

1 儀器、試藥與實驗動物

1.1 儀器

GCMS-QP2010SE氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，NV-15G 氮氣吹干儀(成都塞斯特儀器儀表有限公司)，LGJ-25C冷凍干燥機(四環(huán)科學(xué)儀器有限公司)，高速冷凍離心機(美國賽默飛科技有限公司)，BC-2600Vet獸用全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療國際股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑

紅參、黃芪(廈門半山農(nóng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司)，肉桂(亳州市永剛飲片廠有限公司，批號：200824)，炙甘草(安徽道源堂中藥飲片公司，批號：200501)，四物顆粒(四川吉泰安藥業(yè)有限公司，批號：1911043，規(guī)格：5 g/袋)。

注射用環(huán)磷酰胺(德國Baxter Oncology GmbH公司，批號：6C105A，規(guī)格：0.2 g/瓶)，庚烷、甲氧胺鹽酸鹽購自TCI上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，雙三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、甲醇、乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，普通氮氣(純度≥99.2%)、高純氦(純度≥99.999%)購自北京環(huán)宇京輝京城氣體科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種(KM)小鼠48只，雄性，4～6周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)溫度為23～25 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境濕度為45%±10%。

2 方法

2.1 保元湯方劑制備

參考《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中保元湯的配比(一劑中含人參3 g、黃芪9 g、炙甘草3 g、肉桂1.5 g, 共計16.5 g)。取紅參75 g、黃芪225 g、炙甘草75 g、肉桂37.5 g，加10倍水浸泡過夜，沸騰后改文火煎煮1 h，倒出藥液，第二次和第三次煎煮加8倍水，文火煎煮1 h，合并藥液，過濾、濃縮至每1 mL藥液含1 g生藥的保元湯樣品，冷卻分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型建立與給藥

雄性KM小鼠48只，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組(NC)、模型組(M)、陽性對照組(PC，2.0 g/kg)、保元湯低劑量組(BY-L，2.0 g/kg)、中劑量組(BY-M，6.0 g/kg)和高劑量組(BY-H，12.0 g/kg)，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，參照文獻[19]方法，采用腹腔注射CTX(80 mg/kg，連續(xù)3 d，1次/ d)的方法建立小鼠血虛證模型，空白對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

給藥組小鼠每天灌服對應(yīng)藥物，空白對照組與模型組給予等量生理鹽水，灌胃量為0.1 mL/10 g，1次/d，從造模第一天起，連續(xù)給藥14 d，試驗期間自由飲水、攝食，每日記錄小鼠體重。

2.3 樣本采集與處理

末次給藥30 min后，尾靜脈采血20 μL進行血常規(guī)分析，摘眼球取全血。全血4 ℃靜置2 h后，12 000 r/min 離心15 min，移取血清置-80 ℃保存待分析。取胸腺和脾臟進行稱重, 分別計算胸腺及脾臟指數(shù)。100 μL血清樣本室溫解融后，加入1 200 μL甲醇，充分渦旋30 s，超聲10 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液200 μL至2 mL玻璃瓶中，氮氣吹干，加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，渦旋混勻，置70 ℃水浴鍋中加熱。1 h后取出，待冷卻至室溫，加入BSTFA+TMCS(99∶1)50 μL，渦旋30 s，再次于70 ℃水浴鍋中加熱1 h。冷卻后加入正庚烷100 μL，渦旋混勻，0.22 μm濾膜過濾，濾液置進樣瓶中待分析。

2.4 GC-MS分析參數(shù)

Rtx-5MS毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)進樣口溫度：280 ℃，分流比為10∶1，載氣：He(99.999%)，流速：1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度80 ℃，保持5 min，然后以4 ℃/min的速度升溫至300 ℃，保持10 min；進樣量：1 μL。電子轟擊離子源溫度：230 ℃，轟擊能量：70 eV，倍增電壓：1.0 kV；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)譜掃描離子范圍：50～1 000m/z；溶劑切除時間：4 min。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將GC-MS譜圖數(shù)據(jù)以“. cdf”格式輸出，在XCMS online數(shù)據(jù)平臺進行峰識別與對齊，譜圖濾噪，基線校正，保留時間校正等處理，獲取的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，結(jié)合總離子流圖(total ionchromatograms, TIC)中峰信息，以主成分分析(principal components analysis, PCA)對變量進行降維并將其聚類，繪制主成分分類圖，采用偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)篩選變量投影重要度(variable important projection, VIP)>1.0的變量為可能的差異性代謝標(biāo)志物。

2.6 差異性代謝物鑒定

結(jié)合質(zhì)荷比(m/z)與色譜保留時間(RT)等參數(shù)，對比NIST17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、KEGG(https: //www. genome. jp/kegg/)、HMDB(https: //hmdb. ca/)和SMPDB(http://www.smpdb.ca/)等在線數(shù)據(jù)庫對可能的差異性代謝物進行確認(rèn)，利用MetaboAnalyst 5.0(https: //www. metaboanalyst. ca)網(wǎng)站對鑒定出的差異代謝物進行代謝通路分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 一般行為學(xué)觀察

空白組小鼠行動敏捷，被毛有光澤，眼睛轉(zhuǎn)動靈活，鼻唇潔凈、濕潤，呈淡粉紅色。模型組小鼠均出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩，口唇顏色蒼白，飲水量增多，進食減少等癥狀。相比模型組，保元湯組小鼠相關(guān)癥狀有所緩解。

3.2 保元湯對小鼠體重的影響

分別計算各組小鼠體重變化率r，公式為

r=(W2-W1)/W1×100%

(1)

式(1)中：W2為實測體重；W1為起始體重。

如圖1所示，除空白組外，接受CTX注射的各組小鼠體重明顯呈下降趨勢，造模結(jié)束后隨給藥天數(shù)增加體重逐漸恢復(fù)上升趨勢，但始終低于空白組。其中保元湯中劑量組和陽性對照組與空白組最為接近。

圖1 小鼠體重14 d變化趨勢Fig.1 Body weight growth rate of mice during 14 days

3.3 血常規(guī)分析及臟器指數(shù)

如表1所示，模型組小鼠外周血中白細(xì)胞(WBC)數(shù)量與空白組相比顯著下降(P< 0.01)，單核細(xì)胞比例也明顯降低(P< 0.05)，中性粒細(xì)胞比例顯著上升(P< 0.01)，與模型組相比，各給藥組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量與單核細(xì)胞比例均有不同程度的升高。如圖2所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟均出現(xiàn)代償性增大，表明注射CTX對小鼠免疫器官產(chǎn)生了影響，對應(yīng)的胸腺及脾臟指數(shù)明顯增加(P< 0.001，P< 0.05)，小鼠血虛證模型建立。陽性對照組、保元湯中劑量組和保元湯高劑量組胸腺及脾臟指數(shù)有所降低，其中以保元湯中、高劑量組較為明顯。以上結(jié)果提示保元湯可提高CTX造成的免疫抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)目、單核細(xì)胞比例和中性粒細(xì)胞比例，緩解CTX所致的免疫器官受損。

表1 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)對比

與NC組對比，*P<0.05, **P<0.01；與M組對比，#P<0.05, ##P<0.01；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組小鼠樣品數(shù)量n=8圖2 各組小鼠臟器指數(shù)對比Fig.2 Comparison of spleen and thymus index

自上而下依次為空白組、模型組、陽性對照組和保元湯中劑量組圖3 各組血清樣品典型總離子流圖Fig.3 Typical total ion chromatograms of serum samples in different treated groups

3.4 差異性代謝物的篩選

圖4 多元統(tǒng)計分析結(jié)果Fig.4 Multivariate statistical analysis results

3.5 基于代謝組學(xué)分析保元湯對CTX誘導(dǎo)的血虛證小鼠的影響

為進一步評價保元湯對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制型血虛證小鼠的治療作用，將歸一化處理后的各組GC-MS血清數(shù)據(jù)輸入MetaboAnalyst 5.0進行多元統(tǒng)計分析。如圖5所示，PLS-DA得分圖顯示各給藥組與模型組區(qū)分良好且遠離模型組，接近空白組，表明各給藥組對血虛證模型均具有一定的干預(yù)效果。其中保元湯中劑量組相比其他劑量給藥組更接近空白組且遠離模型組，結(jié)合血常規(guī)和臟器指數(shù)，表明保元湯中劑量組干預(yù)CTX所致血虛證效果較好，因此下一步以3.4節(jié)部分篩選出的差異性代謝物為指標(biāo)，觀察保元湯中劑量各代謝物水平的變化，結(jié)果顯示，給予保元湯可以顯著上調(diào)機體內(nèi)甘油、肌醇、硬脂醇、亞油酸、油酸水平，下調(diào)乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸水平。

1為空白組；2為模型組；3為陽性對照組；4為保元湯低劑量組；5為保元湯中劑量組；6為保元湯高劑量組圖5 PLS-DA分析結(jié)果Fig.5 PLS-DA loading plot of different treated group

3.6 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst 5.0對表2中的10個潛在差異性代謝物進行代謝通路的富集分析，得到14條代謝通路，通路分析影響值如圖6所示。以影響值(impact)>0.1為判定標(biāo)準(zhǔn)，其中3條受到較大擾動，如表3所示。綜合上述研究結(jié)果并對相關(guān)文獻進行分析，推測保元湯干預(yù)小鼠血虛證模型較為密切的3條代謝通路為亞油酸代謝、甘油酯類代謝和磷酸肌醇代謝。

a為亞油酸代謝；b為甘油酯類代謝；c為磷酸肌醇代謝圖6 代謝分析影響值Fig.6 Metabolic analysis impact value

表3 血虛證小鼠受擾動的代謝通路

4 討論與結(jié)論

采用腹腔注射CTX復(fù)制以白細(xì)胞減少為標(biāo)志的小鼠血虛證模型，考察了低、中、高3個劑量的保元湯對血虛證小鼠的治療作用，并以免疫細(xì)胞數(shù)、免疫器官臟器指數(shù)等指標(biāo)初步評價保元湯的藥效。胸腺和脾臟是機體主要的兩個免疫器官，其臟器指數(shù)能反映機體免疫功能[20]。保元湯可使血虛小鼠臟器指數(shù)下降，緩解CTX所致的胸腺及脾臟受損。保元湯中、高劑量組小鼠血清中白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)等顯著回升，表明保元湯可改善CTX誘導(dǎo)的血虛證，恢復(fù)機體免疫功能。

表2 潛在差異性代謝標(biāo)志物及其相對峰強度變化

代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，血虛證小鼠體內(nèi)受較大擾動的代謝通路有亞油酸代謝、甘油酯代謝和磷酸肌醇代謝，涉及的差異性代謝物為亞油酸、甘油和肌醇。與正常組相比，模型組中乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸的含量顯著升高，乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸的含量顯著下降，上述10個化合物可能是與血虛證相關(guān)的潛在差異性代謝物。

亞油酸是一種不飽和脂肪酸，是生長發(fā)育的必需脂肪酸，參與構(gòu)建細(xì)胞膜，對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、基因表達調(diào)節(jié)等有著重要的影響，有助于降低血清膽固醇和抑制動脈血栓的形成，作用機制與花生四烯酸類似[21]，其含量降低可能與造血干細(xì)胞的壞死和凋亡有一定的關(guān)系[22-23]。GC-MS血清代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中亞油酸和油酸含量下降。保元湯給藥組通過上調(diào)亞油酸減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解血虛癥狀。

甘油酯是甘油和脂肪酸經(jīng)酯化所生成的酯，在機體內(nèi)負(fù)責(zé)貯存能量與輸送。甘油作為重要小分子物質(zhì)，是甘油三酯的前體，參與多條代謝通路如甘油酯類代謝、甘油磷脂類代謝等。代謝組學(xué)結(jié)果表明，模型組小鼠血清中甘油含量顯著下降，游離脂肪酸如硬脂酸、棕櫚酸等含量上升，推測血虛證可能干擾機體甘油酯類合成，保元湯給藥組對應(yīng)物質(zhì)含量恢復(fù)正常水平。

肌醇可降低膽固醇含量，并參與磷酸肌醇代謝，生成肌醇三磷酸和二酰基甘油，后者通過升高細(xì)胞內(nèi)鈣和激活蛋白激酶而發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)[24]。作為許多二級信使的前體分子，肌醇由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的組成部分，廣泛分布在動植物和微生物體內(nèi)。肌醇代謝的穩(wěn)定對于維持機體正常生理功能至關(guān)重要。模型組小鼠的肌醇顯著下降，保元湯可提高血虛模型小鼠的肌醇含量趨于正常。

綜上，首次從代謝組學(xué)角度探討了中藥復(fù)方保元湯對血虛證的影響并對相關(guān)的代謝通路進行了分析，一定程度上可反映血虛證小鼠代謝水平的變化。鑒定出的差異性代謝物以脂肪酸類物質(zhì)為主，發(fā)現(xiàn)保元湯對血虛證小鼠體內(nèi)3條紊亂的代謝通路均有較好的調(diào)節(jié)作用。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣能生血、行血，血能養(yǎng)氣、載氣，兩者互為陰陽，故氣虛一般均會導(dǎo)致血虛。CTX可使脾氣虧虛，無力生化血液，進而表現(xiàn)出血虛的一系列癥狀。保元湯善補元氣，補氣的同時亦能補血。采用中醫(yī)證候動物模型與代謝組學(xué)相結(jié)合的研究方法，借助生化指標(biāo)評價其藥效，有助于系統(tǒng)了解機體的病理生理過程，較好地契合了中醫(yī)學(xué)“整體觀念，辨證論治”的理論。并為進一步研究中醫(yī)“血虛證”的本質(zhì)提供參考和借鑒。