楊秋娥，潘婷，梁紅梅，羅裕旋，凌晟榮，鐘文英

（深圳市龍華區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518109）

0 引言

妊 娠 期 糖 尿 ?。╣estational diabetesmellitus，GDM）是指孕前糖代謝正常婦女于妊娠期間發(fā)生或首次出現(xiàn)糖尿病或不同程度糖耐量異?；蚩崭寡巧?，其病因及發(fā)病機制目前尚未完全明確，有研究表明，GDM是由環(huán)境、遺傳及生活方式等多種因素共同所致的一種復(fù)雜性疾病[1-3]。維生素D（Vitamin D，VitD）主要調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，此外還參與糖脂代謝、胰島素合成和分泌、炎性、免疫及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，與多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[4-6]。VitD受體（vitamin D receptor，VDR）含有25-（OH）D-1α羥化酶，可使VitD轉(zhuǎn)化為具有活性的25-(OH)VitD3，且VDR基因多個位點易發(fā)生多態(tài)性突變，進而影響VitD的水平或結(jié)構(gòu)，從而參與多種疾病發(fā)生[7-8]。本文對深圳區(qū)域GDM和妊娠期非糖尿病患者血清25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態(tài)性進行對比研究分析，了解25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態(tài)性與深圳地區(qū)GDM的易感性，現(xiàn)報導(dǎo)如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2021年01月至2021年06月深圳市龍華區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科門診及住院部確診GDM患者76例為GDM組。GDM診斷符合《中國2型糖尿病指南（2020年）》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)：24～28周口服75 g葡萄糖行OGTT試驗，空腹血糖≥5.1 mmol/L，服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L，2 h≥8.5 mmol/L，其中有一個值達到標(biāo)準(zhǔn)即可診斷GDM。選擇同期在我院婦產(chǎn)科門診及住院部就診的妊娠期非糖尿病患者80例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎妊娠；②無肝、腎、心及產(chǎn)科其它并發(fā)癥；③患者及家屬簽署知情同意書；④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①顯性糖尿?。ㄈ焉锲冢?；②孕前糖尿?。虎酆喜⒙巫?、哮喘、慢性消化性和泌尿系統(tǒng)疾??；④伴有惡性腫瘤者；⑤有糖尿病家屬史者；⑥服用VitD及其他鈣制劑者；⑦伴有甲狀腺疾病者。確保兩組孕婦年齡、孕中期BMI及分娩孕周比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

iflash3000-C化學(xué)發(fā)光分析儀（深圳亞輝龍）；DNA 提取試劑盒（深圳亞能）；ABI7500儀（美國ABI公司）；基因SNP多態(tài)性分析試劑盒（上海吉凱）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

均于清晨抽取空腹外周靜脈血5.0~6.0mL，其中2.0~3.0mL于干燥管內(nèi)，離心(3500r/min)10min，取血清測定25-(OH)VitD3水平。余下的于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，用于VDR基因rs731236T/C位點多態(tài)性分析。

1.3.2 25-(OH)VitD3水平測定

采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測血清25-(OH)VitD3水平，按試劑和儀器說明書進行操作。

1.3.3 VDR基因rs731236

T/C位點SNP分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法對VDR基因rs731236 T/C位點SNP進行分析。具體方法：（1）DNA提 ??；（2）引物設(shè)計上游引物：5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物：5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTC TC-3’；（3）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積25.0μL，含模板DNA 2 ng，引物10 nmol，聚合酶1 U，dNTPs5 nmol；（4）擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，然后以95℃30 s，65℃30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸7min；（5）酶切：取擴增產(chǎn)物4μL，加5 U Apa I酶，10xBuffer TangoTM 2μL，加ddH2O至20ul，37℃水浴消化1 h；（6）多態(tài)性分析：取酶切產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗比較；計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗比較；遺傳平衡采用Hardy-Weinberg檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組25-(OH)VitD3水平比較

GDM患者血清25-(OH)VitD3水平為（24.93±7.61）mmol/L，明顯低于對照組的（50.27±14.38）mmol/L，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.0645，P<0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg檢驗

GDM組和對照組VDR基因rs731236 T/C位點SNP均檢出TT，TC和CC 3種基因型。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.2048，P>0.05），表明抽樣具有代表性。

2.3 兩組VDR基因rs731236

T/C位點SNP比較 GDM患者VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型及C等位基因檢出率分別為48.68%和59.21%，明顯高于對照組的21.25%和33.13%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.8172，4.0721，P<0.05），結(jié)果見表1。

表1 GDM組和對照組VDR基因rs731236 T/C位點SNP比較[n（%）]

2.4 不同基因型GDM患者25-(OH)VitD3水平比較

VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型GDM患 者 血 清25-(OH)VitD3水 平 為（13.29±4.58）mmol/L，明顯低于TC和TT基因型的（33.70±6.85）mmol/L和（37.55±8.27）mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.9125，7.2854，P<0.05），但TC和TT基 因型GDM患者25-(OH)VitD3水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.3028，P>0.05）。

3 討論

GDM是妊娠期間首次發(fā)生的糖耐量異常綜合征，可導(dǎo)致多種妊娠不良結(jié)局。此外，其還增加產(chǎn)婦及新生兒日后患2型糖尿?。═2DM）和心血管疾病風(fēng)險，并能引起一系列并發(fā)癥及后遺癥，嚴重影響產(chǎn)婦及新生兒生活質(zhì)量，對母嬰健康造成巨大威脅，且隨著我國經(jīng)濟和生活水平不斷提高、肥胖率及高齡產(chǎn)婦比例不斷增加，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10-12]。但GDM病因及發(fā)病機制目前尚未完全明確，給GDM患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷及預(yù)防帶來很大困難。因此，探索GDM病因及發(fā)病機制，對預(yù)防、診斷及治療GDM具有重要的臨床意義。

VitD主要調(diào)節(jié)鈣磷代謝，但最近研究表明，妊娠期孕婦體內(nèi)VitD缺乏或不足與一系列不良妊娠結(jié)局有密切關(guān)系[13-14]。而25-(OH)VitD3是VitD主要存在形式，其水平可直接反映人體內(nèi)VitD儲存水平，且與VitD缺乏的臨床癥狀相關(guān)，同時不同地區(qū)和種族人群之間存在差異很大[15-17]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)GDM患者血清25-(OH)VitD3水平較妊娠期非糖尿病孕婦明顯降低（P<0.05），與有關(guān)報導(dǎo)基本一致[15-17]，這表明25-(OH)VitD3水平降低可能是導(dǎo)致GDM的發(fā)病的危險因素之一。

研究表明，GDM可能由多種因素共同所致的，其中遺傳在其發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用，但有關(guān)遺傳病因和發(fā)病機制尚未完全清楚。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，GDM發(fā)生和發(fā)展與人體內(nèi)多個基因多個位點多態(tài)性突變有關(guān)[18-19]，其中VDR基因多個位點（如是TaqⅠ、FokⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ）的多態(tài)性突變與GDM發(fā)病有關(guān)，如張琰等[20]報導(dǎo)遼沈地區(qū)漢族女性人群中VDR基因ApaⅠ位點多態(tài)性與妊娠期糖尿病存在相關(guān)性，但不同地區(qū)和種族人群因遺傳背景、環(huán)境、免疫及生活習(xí)慣等諸多因素的不同而基因多態(tài)性存在地域性和種族性差異。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)GDM患者VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型和C等位基因頻率明顯比妊娠期非糖尿病孕婦升高（P<0.05），這表明VDR基因rs731236 T/C位點多態(tài)性可能與GDM的發(fā)病有密切關(guān)系，其中CC基因型可能是本地區(qū)GDM發(fā)病的危險易感基因之一。此外，攜帶VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型的GDM患者血清25-(OH)VitD3水平明顯比妊娠期非糖尿病患者降低（P<0.05），這說明VDR基因rs731236 T/C位點多態(tài)性可能通過影響25-(OH)VitD3水平或結(jié)構(gòu)而在GDM發(fā)病中發(fā)揮作用的。

綜上所述，深圳區(qū)域GDM患者25-(OH)VitD3含量顯著降低，其中CC基因型GDM患者降低尤為明顯，且VDR基因rs731236 T/C位點呈多態(tài)性分布。因此，加強孕婦25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態(tài)性分析，對GDM患者早期診斷、治療及發(fā)病機制研究具有重要的意義。