胡家達(dá)，吳海智， 薛昌安， 顧紫薇， 王若茜， 潘江山， 高永恒， 劉 亞，方富貴， 張運(yùn)海， 丁建平， 李運(yùn)生

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036； 2.安徽省畜牧技術(shù)推廣總站，安徽合肥 230001)

精液冷凍保存技術(shù)可提高優(yōu)秀種公畜的利用效率，加快品種改良步伐，便于精液長(zhǎng)途運(yùn)輸，降低疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。但不同物種間精子的冷凍保存效果仍有很大差異，這主要與精子的大小、性狀、蛋白和脂質(zhì)成分有關(guān)。因此，冷凍保存技術(shù)和精液稀釋液是影響精液冷凍保存的關(guān)鍵因素。國(guó)外對(duì)山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究始于20世紀(jì)。我國(guó)開展山羊冷凍保存研究較晚，至目前為止山羊精液冷凍保存效率仍普遍偏低，不同冷凍方法之間凍存效果差異較大，這限制了我國(guó)山羊凍精人工授精的應(yīng)用和推廣。

卵黃是精液冷凍最常用的保護(hù)劑，其廣泛用于牛、羊等精子冷凍保護(hù)液。然而，卵黃也存在較多缺陷，其中，卵黃中含有較多微生物，可產(chǎn)生內(nèi)毒素污染精液，降低精子的受精能力，增加疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，精液中含有副性腺分泌的卵黃凝固酶(EYCE)，它與卵黃作用，對(duì)精子有毒性。因此，利用化學(xué)限定性培養(yǎng)基替代卵黃是近年的研究熱點(diǎn)。大豆卵磷脂(SL)含有豐富的低密度脂蛋白(LDL)，可在精子冷凍過程中保護(hù)精子膜免受低溫?fù)p傷。目前，研究表明，SL可作為卵黃替代用于牛、綿羊和山羊精子冷凍保存。磷脂酰膽堿屬于卵磷脂的一種，是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，其在生物膜之間通過磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PTCP)轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，磷脂酰膽堿是一種潛在的精液冷凍保護(hù)劑。目前尚未見應(yīng)用于磷脂酰膽堿作為保護(hù)劑凍存山羊精液的報(bào)道。

膽固醇影響脂質(zhì)鏈的排列，通過磷脂碳?xì)滏湻€(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，避免膜狀態(tài)發(fā)生變化。精子冷凍過程中膽固醇的大量喪失是膜狀態(tài)轉(zhuǎn)變的前提。Purdy等向公牛的凍精稀釋液添加含有膽固醇的環(huán)糊精，解凍后提高了精子活力。研究表明，在兔和山羊精液稀釋液中分別添加膽固醇均可顯著提高精子活力。在山羊精液冷凍稀釋液中添加含有膽固醇的環(huán)糊精，解凍后的精子活力顯著高于對(duì)照組。

目前，仍需要優(yōu)化在山羊精液冷凍保存中膽固醇和磷脂的添加濃度，且未見膽固醇和磷脂酰膽堿2種物質(zhì)聯(lián)合的報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)精子凍融前后膜質(zhì)成分的檢測(cè)，研究在稀釋液中添加相應(yīng)比例的膽固醇和磷脂酰膽堿，解凍后檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，評(píng)估其在山羊精液冷凍保存中的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選取228只無生殖器官疾病、健康的安徽白山羊。

1.2 主要試劑

膽固醇、Tris、果糖、檸檬酸和甘油，均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；磷脂酰膽堿，來自Sigma公司；雞蛋，購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.3 精液采集和稀釋

假陰道法采集精液，感觀檢查合格，活力大于0.9時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。將采得所有合格精液進(jìn)行混合，測(cè)定混精密度。采用37 ℃基礎(chǔ)稀釋液(Tris 3.07 g/100 mL、檸檬酸 1.64 g/100 mL、果糖 1.26 g/100 mL)將精液稀釋至4.8×10個(gè)/mL，待精液在5 ℃冰箱中緩慢降溫平衡后，再用含10%甘油的稀釋液將精液再稀釋1倍，使得精液的終濃度為2.4×10個(gè)/mL。

1.4 精液的冷凍與解凍

在距離液氮面上方4 cm處將稀釋后的精液在氟板上進(jìn)行滴凍，每粒約50 μL。預(yù)冷10 min后將凍精顆粒浸入液氮保存。從液氮中取1粒凍精顆粒迅速置于預(yù)熱好的離心管中，在37 ℃水浴中快速解凍30 s，取出室溫下輕輕搖晃至顆粒完全融化。

1.5 精子膜脂質(zhì)成分檢測(cè)

參照倪利平的方法，采用甲醇-三氯甲烷混合液抽提精子脂質(zhì)，4 ℃保存待測(cè)。采用總膽固醇試劑盒酶比色法，按試劑盒說明測(cè)定樣品中總膽固醇含量。配制消化液、磷標(biāo)準(zhǔn)液和顯色液等溶液，每個(gè)樣品設(shè)1次重復(fù)，采用紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)測(cè)定各樣品的濃度。

1.6 精子評(píng)估

1.6.1 精子運(yùn)動(dòng)參數(shù) 采用精子分析儀(SCA型，西班牙Microptic公司)測(cè)定精子活力(Motility)、曲線速率(VCL)、直線速率(VSL)、平均路徑速度(VAP)、線性度(LIN)、擺動(dòng)幅度(ALH)、擺動(dòng)性(WOB)、筆直度(STR)和鞭打頻率(BCF)等運(yùn)動(dòng)參數(shù)，隨機(jī)選擇3個(gè)視野，每個(gè)視野使用計(jì)算機(jī)軟件分析5次，取15個(gè)結(jié)果的平均值作為樣品最終結(jié)果。

1.6.2 質(zhì)膜完整率檢測(cè) 采用低滲透腫脹試驗(yàn)(HOST)檢測(cè)質(zhì)膜完整性。取25 μL精液添加至200 μL低滲液中，混合均勻，38.5 ℃下孵育45 min，再添加300 μL 2%戊二醛。取10 μL混合液于載玻片上，并在400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)從幾個(gè)不同視野中，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，精子尾部不彎曲表明精子質(zhì)膜不完整，計(jì)算精子質(zhì)膜的完整率。

1.6.3 頂體完整率檢測(cè) 采用姬姆薩染色法檢測(cè)精子頂體完整率。解凍后的精液抹片風(fēng)干后，采用1 mL 甲醛液固定15 min沖洗干凈，采用2 mL姬姆薩染液染色90 min。水洗風(fēng)干后，在1 000倍油鏡下鏡檢。計(jì)數(shù)200個(gè)精子，頂體嚴(yán)重膨脹或頂體脫落為頂體異常精子，計(jì)算精子頂體的完整率。

1.7 人工授精

在1.5 mL 離心管中加入0.2 mL 2.9%檸檬酸鈉溶液，37 ℃水浴預(yù)熱后，取4粒凍精投入離心管中，在37 ℃水浴30 s后取出，待室溫完全融化后，將精液輸入發(fā)情母羊子宮頸內(nèi)。間隔12 h輸精2次。

1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.8.1 冷凍對(duì)精子膜脂含量的影響 使用基礎(chǔ)稀釋液稀釋精液，并檢測(cè)精子凍融前后膜上膽固醇和磷脂含量變化。

1.8.2 不同濃度的膽固醇稀釋液對(duì)凍精的影響 將混精分成5等份，分別用含1.0、2.5、5.0、 10.0 g/L 膽固醇或15%卵黃的基礎(chǔ)稀釋液稀釋、冷凍，分別標(biāo)為C1、C2.5、C5、C10、EY組。解凍后檢測(cè)各組精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)、頂體完整率和質(zhì)膜完整率。

1.8.3 磷脂酰膽堿稀釋液對(duì)凍精的影響 將混精分成5等份，分別用含10、15、20、25 g/L的磷脂酰膽堿或15%卵黃的基礎(chǔ)稀釋液稀釋、冷凍，標(biāo)為P10、P15、P20、P25、EY組。解凍后檢測(cè)各組精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)、頂體完整率和質(zhì)膜完整率。

1.8.4 不同濃度的磷脂酰膽堿-膽固醇混合稀釋液對(duì)凍精的影響 將混精分成5等份，分別用P19+C1(基礎(chǔ)液+19 g/L磷脂酰膽堿+1 g/L膽固醇)、P18+C2(基礎(chǔ)液+18 g/L磷脂酰膽堿+2 g/L膽固醇)、P16+C4組(基礎(chǔ)液+16 g/L磷脂酰膽堿+4 g/L 膽固醇)、P14+C6(基礎(chǔ)液+14 g/L磷脂酰膽堿+6 g/L膽固醇)和卵黃稀釋液稀釋、冷凍。解凍后檢測(cè)各組精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)、頂體完整率和質(zhì)膜完整率。

1.8.5 磷脂酰膽堿-膽固醇稀釋液對(duì)精子膜脂含量的影響 將混精分成5等份，分別使用P19+C1、P18+C2、P16+C4、P14+C6和EY這5種稀釋液稀釋，比較各組凍融前后精子膜上膽固醇、磷脂的含量變化。

1.8.6 人工授精 選取224只正常發(fā)情的母羊，分別使用卵黃和P16+C4稀釋液制作的顆粒凍精用于山羊輸精，于輸精后20 d，利用試情公羊連續(xù)試情48 h，統(tǒng)計(jì)不返情率，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)產(chǎn)羔率等相關(guān)指標(biāo)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)6次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行處理，所得的試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Graph Pad Prism 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍對(duì)精子膜卵磷脂和膽固醇含量的影響

由圖1可知，經(jīng)凍-融處理后，山羊精子磷脂和膽固醇含量均顯著降低(<0.05)。

2.2 不同濃度的膽固醇稀釋液對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

由圖2可知，C2.5組、C5組和C10組的質(zhì)膜完整率與卵黃組無顯著差異(>0.05)，而C1組質(zhì)膜完整率顯著低于卵黃組(<0.05)。C1組的頂體完整率均顯著低于其他各組(<0.05)。

由表1可知，膽固醇組解凍后的精子活力、VCL、VAP顯著低于EY組(<0.05)，C1組和C2.5組的VSL顯著低于EY組(<0.05)。膽固醇組解凍后的精子、LIN、筆直度(STR)、擺動(dòng)性(WOB)、擺動(dòng)幅度(ALH)和鞭打頻率(BCF)與卵黃組無顯著差異(>0.05)。

表1 膽固醇對(duì)山羊凍精活力及運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

2.3 不同濃度的磷脂酰膽堿稀釋液對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

由圖3可知，P20組質(zhì)膜完整率與EY組差異不顯著(>0.05)，P15組和P20組的頂體完整率與EY組差異不顯著(>0.05)。P25組的質(zhì)膜完整率和頂體完整率顯著低于EY組(<0.05)，P15組的質(zhì)膜完整率顯著高于EY組(<0.05)，P10組的頂體完整率顯著高于EY組(<0.05)。

由表2可知，P15組解凍活力及其他運(yùn)動(dòng)參數(shù)與EY組差異不顯著(>0.05)，P10組、P20組和P25組的解凍活力均顯著低于EY組(<0.05)，P25組的VCL和VAP顯著低于EY組(<0.05)，而P25組的BCF顯著高于EY組(<0.05)。

表2 磷脂酰膽堿稀釋液對(duì)山羊凍精活力及運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

2.4 不同濃度的磷脂酰膽堿、膽固醇混合稀釋液對(duì)山羊精液冷凍保存的影響

由圖4可知，P18+C2組、P16+C4組和P14+C6組的質(zhì)膜完整率與EY組無顯著差異(>0.05)，P19+C1組的質(zhì)膜完整率顯著低于EY組(<0.05)。P19+C1組、P18+C2組和P14+C6組的頂體完整率與EY組無顯著差異(>0.05)，P16+C4組的頂體完整率顯著高于EY組(<0.05)。

由表3可知，P16+C4組的精子活力、VCL和VAP顯著高于卵黃組，VSL與卵黃組無顯著差異(>0.05)。P19+C1組和P18+C2組的精子活力、VCL、VSL和VAP均與卵黃對(duì)照組無顯著差異(>0.05)。

表3 磷脂酰膽堿和膽固醇混合稀釋液對(duì)凍精活力及運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

2.5 不同濃度磷脂酰膽堿、膽固醇混合稀釋液對(duì)精子膜上卵磷脂和膽固醇含量的影響

由圖5可知，P16+C4組凍精后精子膜上的磷脂含量顯著高于P19+C1組、P18+C2組和P14+C6組(<0.05)。P18+C2組、P16+C4組和 P14+C6組凍精后精子膜上的膽固醇含量與卵黃組無顯著差異(>0.05)，而P19+C1組凍精后精子膜上的膽固醇含量顯著低于卵黃組(<0.05)。

2.6 P16+C4組和卵黃組稀釋液對(duì)人工授精效果的比較

由表4可知，由于P16+C4添加組可顯著改善精子冷凍前后膽固醇、磷脂濃度的損傷，同時(shí)提高精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率。本研究利用該方案獲得的凍精進(jìn)行人工授精配種試驗(yàn)，結(jié)果顯示，P16+C4組的不返情率、受胎率、產(chǎn)仔率和公母比例均與EY組差異不顯著(>0.05)。

表4 P16+C4組和卵黃組稀釋液對(duì)山羊人工授精效果的比較

3 討論與結(jié)論

卵黃作為使用最廣泛的精液冷凍保護(hù)劑，存在較多不利因素，影響凍精保存效果。本研究目的是尋找一種可替代卵黃的限定化學(xué)成分精液冷凍稀釋液。膽固醇可以調(diào)節(jié)膜脂的流動(dòng)性，溫度較高時(shí)可以降低膜的流動(dòng)性，在低溫下能促進(jìn)脂肽鏈的運(yùn)動(dòng)，溫度的降低不會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性的減弱，因此膽固醇可改善低溫下精子膜的流動(dòng)性，提高冷凍精子的活力。本研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度膽固醇添加到精液冷凍液中，解凍后精子的質(zhì)膜完整率與卵黃組無顯著差異，表明膽固醇對(duì)精子質(zhì)膜具有較好地保護(hù)作用。這與前人在山羊精液冷凍保存的研究結(jié)論一致。但單獨(dú)以膽固醇取代卵黃冷凍后精子的活力、運(yùn)動(dòng)參數(shù)和頂體完整率均低于卵黃組，說明單獨(dú)添加膽固醇不能達(dá)到替代卵黃的效果。Barenholz研究表明，膽固醇抑制了膜上的Na/KATP泵，對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響。當(dāng)膽固醇濃度過高時(shí)，膜的流動(dòng)性反而會(huì)顯著降低，精子更易受到機(jī)械損傷。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加的膽固醇濃度由5 g/L增加至10 g/L時(shí)，解凍精子的活力反而下降。頂體損傷通常是由于形成了較大冰晶，損傷了精子的內(nèi)在結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致。膽固醇組的頂體完整率較低的原因可能是膽固醇不能阻止大量冰晶的形成對(duì)頂體造成的損傷。

磷脂酰膽堿補(bǔ)充了精子在降溫過程中丟失的膜磷脂，而且可以替換一些精子膜上的磷脂酰膽堿，減少膜受到損傷。高濃度的大豆卵磷脂會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒性，主要會(huì)對(duì)膜完整性產(chǎn)生不利的影響。本試驗(yàn)中當(dāng)磷脂酰膽堿添加量大于20 g/L時(shí)，造成膜損傷可能是由于磷脂酰膽堿濃度過高引起毒性反應(yīng)。而添加10 g/L磷脂酰膽堿，可能由于濃度過低不能有效地保護(hù)精子。

本試驗(yàn)中，當(dāng)同時(shí)添加16 g/L磷脂酰膽堿和 4 g/L 膽固醇獲得了比卵黃更好的保存效果，凍精后精子活力、精子VCL、VSL均顯著提高。通過脂質(zhì)含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P16+C4稀釋液凍后精子質(zhì)膜上的磷脂含量較卵黃組高，表明采用膽固醇和磷脂酰膽堿代替卵黃，能更好地避免精子膜上膽固醇與磷脂的流失，提高凍精保存的效果。Mutalik等在稀釋液中按照一定比例(95 ∶5、90 ∶10、80 ∶20、70 ∶30)添加大豆卵磷脂和膽固醇，結(jié)果表明按照80 ∶20比例添加兩種物質(zhì)替代卵黃用于人的精子冷凍得到了較好的保存效果。另外精子膜完整性對(duì)精子在雌性的生殖道中行使功能也發(fā)揮著重要的作用，這可能也是P16+C4組的人工授精效果更好的原因。

本研究結(jié)果表明，單獨(dú)用膽固醇或磷脂酰膽堿替代卵黃，凍精效果低于卵黃組，當(dāng)添加16 g/L磷脂酰膽堿和4 g/L膽固醇替代卵黃時(shí)解凍效率高于卵黃組，達(dá)到了在山羊精液冷凍保存中替代卵黃效果。