魏后軍, 范志宇, 胡 波, 仇汝龍, 陳萌萌, 宋艷華, 徐為中, 王 芳
(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點實驗室,江蘇南京 210014)
產(chǎn)氣莢膜梭菌()也稱魏氏梭菌,是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。該菌的致病因子是其分泌的外毒素,主要是、、和毒素,據(jù)此將該菌分為A、B、C、D、E等5個毒素型;各毒素型均產(chǎn)生毒素,毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的毒力因子,其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌毒素最多。毒素基因位于染色體上,大小為1 194 bp,編碼的產(chǎn)物由398 個氨基酸殘基組成,其中前28 個氨基酸為信號肽,成熟肽為 370 個氨基酸。毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶2種酶活性,能同時水解細胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂,導致細胞裂解,因而具有細胞毒性、溶血活性和血小板聚集等特性。因此,研究者利用基因工程技術(shù)將毒素去毒性,作為抗原研制疫苗。
Studier提出了外源基因表達自誘導(auto-induction)的方法。其原理是大腸桿菌首先以葡萄糖為碳源生長,葡萄糖消耗殆盡,達到一定活力后,開始消耗培養(yǎng)基中的乳糖,在乳糖滲透酶(lactose permease)和-半乳糖苷酶(-galactosidase)的作用下,乳糖穿過細胞膜并部分轉(zhuǎn)化為異乳糖開啟了T7表達系統(tǒng),乳糖的代謝產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖也可作為碳源。與IPTG(isopropyl--thiogalactoside)相比,乳糖無細胞毒性、價格較低,自誘導的培養(yǎng)基中含有誘導劑,無需在培養(yǎng)過程中檢測重組菌的生長情況添加誘導劑。
本研究對含信號肽的毒素基因進行突變?nèi)ザ炯懊艽a子優(yōu)化,采用大腸桿菌表達系統(tǒng)自誘導分泌表達了無毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白,該方法具有安全、抗原免疫原性好、工藝簡單、成本低等優(yōu)點,研制的疫苗能有效避免現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)工藝較復雜、成本較高等問題。本研究為研制產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗提供了技術(shù)保障。
A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)由筆者所在實驗室鑒定、保存;兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)滅活疫苗購自山東華宏生物工程有限公司,主要成分為滅活的蘇84-A株全菌液,用量為2 mL/只;細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司;高保真酶購自 Invitrogen 公司;凝膠回收純化試劑盒購自TaKaRa公司;大腸桿菌() BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購自上海翊圣生物科技有限公司;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16~20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL),由筆者所在實驗室制備、保存;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體由筆者所在實驗室制備、保存;HRP標記的羊抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;自誘導培養(yǎng)基配方:10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L 甘油、0.25 g/L 葡萄糖、25 mmol/L NaHPO、25 mmol/L KHPO、50 mmol/L NHCl、5 mmol/L NaSO、2 mmol/L MgSO、1 g/L乳糖。
根據(jù)GenBank上公布的α毒素基因序列(GenBank:AY823400.1)設(shè)計引物,上游引物:5′-G C G G A A T T C A T G A A A A G A A A G A T T T G T A A G-3′,下游引物:5′-G C G C T C G A G T T A T T T T A T A T T A T A A G T T G-3′,由南京擎科生物科技有限公司合成。以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板,PCR反應(yīng)體系:模板1 μL,高保真酶0.2 μL,10×Buffer 5 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL,dNTPs(25 mmol/L)4 μL,MgSO(50 mmol/L)2 μL,ddHO 37 μL;反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,62.0 ℃ 1 min,68 ℃ 1.5 min,30個循環(huán);68 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒回收目的片段。回收的目的片段測序,獲得毒素基因序列(蘇84-A株)。
根據(jù)毒素測序結(jié)果,將毒素的第176位組氨酸(CAT)突變?yōu)樘於0?AAT),同時對信號肽序列進行密碼子優(yōu)化;將化學合成的該序列插入到載體pET32a(RⅠ和Ⅰ酶切位點之間),獲得重組質(zhì)粒pET32a-αH176N。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂布于含氨芐青霉素的抗性LB平板,37℃靜置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的抗性LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振搖過夜,菌液經(jīng)PCR鑒定陽性,將該菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株。
將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含氨芐青霉素的抗性自誘導培養(yǎng)基,28 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,6 000 r/min 離心15 min,收集上清,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾后,獲得重組蛋白αH176N,在αH176N蛋白及100、50、25 μg/mL 的BSA中分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻,煮沸 5~8 min,進行SDS-PAGE分析;同時以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體為一抗,HRP標記的羊抗兔IgG為二抗,對αH176N蛋白進行Western blot鑒定。
將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導培養(yǎng)基,每個乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,6 000 r/min 離心15 min,收集上清,經(jīng) 0.22 μm 孔徑濾膜過濾后,分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻,煮沸5~8 min,進行12% SDS-PAGE分析。
1.6.1 卵磷脂酶活性試驗毒素具有磷脂酶C活性,能將卵黃中的磷酸卵磷脂特異性的水解成磷酰膽堿和1,2-甘油二脂,產(chǎn)生白色混濁。將αH176N蛋白和野生型毒素,分別滴加2 μL到卵黃瓊脂平板,37 ℃靜置1 h后,觀察滴加的位置是否出現(xiàn)白色混濁斑。
1.6.2 小鼠毒力試驗 10只16~20 g小鼠,隨機分成2組,每組5只。其中1組作為對照組,將空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a自誘導的全菌液,離心后取上清,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜的濾液,尾靜脈注射小鼠0.3 mL/只;另1組小鼠,尾靜脈注射αH176N蛋白液0.3 mL/只,連續(xù)觀察7 d。
將制備的αH176N蛋白(62.4 μg/mL),與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑,作為本次試驗用基因工程疫苗;將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16~20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL),用甲醛滅活后與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑,作為本次試驗用自制類毒素疫苗。分別將基因工程疫苗(1、0.25、0.125 mL)、自制類毒素疫苗(2、1 mL)、商品化疫苗(2 mL)免疫1.5~2.0 kg健康易感家兔,每個劑量組各6只,21 d后,連同6只對照組,耳緣靜脈注射1 MLD的 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素,連續(xù)觀察3~5 d。
以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板,進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明:擴增出約1 200 bp的片段,與預期結(jié)果相符(圖1)。回收目的片段,測序獲得α毒素基因序列。
大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株在自誘導培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),SDS-PAGE電泳分析顯示,蛋白分泌到培養(yǎng)基中 (圖2-A),通過QuantiyOne軟件,計算蛋白含量為50.1 μg/mL。Western blot結(jié)果顯示,αH176N蛋白有約42.5 ku大小的目的條帶,空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a經(jīng)誘導的全菌液無條帶,表明目的蛋白已得到分泌表達。
將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導培養(yǎng)基,每個乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,收獲蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,在含1~2 g/L 乳糖的自誘導培養(yǎng)基及28 ℃誘導條件下,可以獲得較多分泌表達的目的蛋白(圖3)。
野生型α毒素在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)白色混濁斑,而αH176N蛋白不出現(xiàn)白色混濁斑,說明αH176N蛋白已不具備毒素的磷脂酶C活性。將αH176N蛋白尾靜脈注射小鼠,觀察期內(nèi),連同對照組小鼠均健活且無不良反應(yīng),說明重組蛋白αH176N是無毒的。
分別將基因工程疫苗、自制類毒素疫苗、商品化疫苗免疫試驗兔,21 d后攻毒,結(jié)果顯示,基因工程疫苗0.25 mL/只免疫保護效果優(yōu)于類毒素疫苗 2 mL/只 及商品化疫苗2 mL/只的免疫保護效果(表1)。
表1 免疫攻毒試驗結(jié)果
目前商品化的產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗是將厭氧培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液或外毒素滅活制備而成,存在抗原成分復雜、穩(wěn)定性差、副作用大以及滅活不徹底等安全隱患問題。而有關(guān)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗的研究大多采用大腸桿菌表達系統(tǒng)、以截短表達或多點突變的方法使毒素去毒性。毒素蛋白通常在胞內(nèi)以不可溶性的包涵體或胞內(nèi)的可溶性蛋白表達。包涵體形式表達影響了毒素的天然結(jié)構(gòu),使其失去生物活性,需進行復性處理;胞內(nèi)的可溶性蛋白具有生物活性,但含雜蛋白較多,需進行復雜的純化過程;且重組大腸桿菌采用IPTG作為誘導劑,需要依據(jù)檢測重組菌的生長情況添加誘導劑。
本研究通過基因工程技術(shù)突變毒素蛋白的1個氨基酸,使其失去毒性,同時保留其天然結(jié)構(gòu)和分子特征。此外,本研究采用自誘導分泌表達技術(shù),以培養(yǎng)基中天然成分乳糖作為誘導劑,并對信號肽序列進行優(yōu)化,實現(xiàn)重組毒素“胞外分泌”,直接以可溶的形式分泌釋放到培養(yǎng)基中,無需添加化學誘導劑。將制備的αH176N蛋白液與氫氧化鋁膠配制成的疫苗,免疫0.25 mL/只就能達到100%(6/6)保護的效果,且具有抗原成分單一、安全性好、工藝簡單和成本低等優(yōu)點,可為多聯(lián)苗、多價苗的研究奠定基礎(chǔ)。