普鳳雅， 谷書杰， 何永宏， 楊志清，，3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明 650201)

植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的存在具有普遍性和多樣性的特點(diǎn)，目前研究認(rèn)為內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期共處中形成了一種復(fù)雜、特殊的互利共生關(guān)系。植物內(nèi)生菌可以通過提高植物體內(nèi)生長(zhǎng)素和分裂素的代謝，促進(jìn)植物的細(xì)胞分裂、根系發(fā)育、幼苗生長(zhǎng)，如產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶、吲哚-3-乙酸(IAA)等；還可以提高植物的固氮、溶磷、解鉀作用，以及產(chǎn)生嗜鐵素、羧甲基纖維素酶等促進(jìn)植物對(duì)環(huán)境中有益物質(zhì)的吸收能力。如在缺鐵的土壤環(huán)境中，植物會(huì)利用嗜鐵素產(chǎn)生菌產(chǎn)生的鐵載體滿足植物對(duì)鐵元素的需要；在逆境下，ACC脫氨酶能夠降低乙烯含量來促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，緩解植物所受脅迫。Adnan等研究發(fā)現(xiàn)，解磷細(xì)菌能夠改善石灰性土壤中作物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)磷元素的吸收。趙青云等的研究表明，接種解磷微生物顯著增加了香草蘭植株干質(zhì)量、土壤有效磷含量；王雪菲的研究表明，解磷細(xì)菌能夠提高白菜的農(nóng)藝性狀和生物量；接種解磷細(xì)菌和叢枝菌根真菌顯著提高了苜蓿地上生物量、株高、莖粗、粗蛋白含量等。

薏苡(-L.)屬于禾本科(Gramineae)玉蜀黍族(Maydeae)薏苡屬()，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)薏苡促生菌的相關(guān)報(bào)道較少，篩選薏苡促生菌并研究其促生特性對(duì)薏苡生長(zhǎng)發(fā)育、薏苡仁產(chǎn)量、品質(zhì)、有效活性成分積累有一定的幫助，對(duì)推動(dòng)薏苡產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究以前期分離得到的2株薏苡內(nèi)生菌為研究對(duì)象，通過測(cè)定2株薏苡內(nèi)生菌分泌嗜鐵素、羧甲基纖維素酶、ACC脫氨酶的能力，探究這2株內(nèi)生菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的生理機(jī)制；通過種子萌發(fā)試驗(yàn)評(píng)價(jià)2株薏苡內(nèi)生菌及其混合菌液對(duì)薏苡種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，同時(shí)也探究薏苡促生菌對(duì)禾本科作物(玉米、水稻、大麥、小麥)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響；以期為穩(wěn)定薏苡產(chǎn)量、減少化肥施用以及為后期薏苡生物菌肥的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 本試驗(yàn)于2019年12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新及可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。所需菌株由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存，編號(hào)為L(zhǎng)21的菌株分離自文薏2號(hào)葉片，經(jīng)筆者所在課題組鑒定為貝萊斯芽孢桿菌()，編號(hào)為R24的菌株分離自文薏2號(hào)根部，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌()。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入17 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

鉻天青(CAS)鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基、DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基按照劉璐的方法進(jìn)行配制；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基按照吳靜的方法進(jìn)行配制。

1.1.3 供試作物品種 玉米：點(diǎn)谷1號(hào)；水稻：滇禾優(yōu)55，大麥：北青7號(hào)，小麥：云麥53；以上品種均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。薏苡：文薏2號(hào)和師薏1號(hào)，由云南省文山州農(nóng)科院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株產(chǎn)嗜鐵素能力的定性和定量分析 (1)定性檢測(cè)。將內(nèi)生菌菌株點(diǎn)接種至鉻天青固體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，出現(xiàn)透明圈即說明菌株產(chǎn)生嗜鐵素。計(jì)算可溶性指數(shù)：可溶性指數(shù)=，其中：代表透明圈直徑，代表菌落直徑。(2)定量測(cè)定。將菌液接種于液體 MKB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 離心10 min，保留嗜鐵素發(fā)酵上清液(SCS)，將嗜鐵素發(fā)酵上清液(3 mL)和CAS(3 mL)溶液以1 ∶1的體積比混合均勻，暗反應(yīng) 1 h，用分光光度計(jì)測(cè)反應(yīng)液在 630 nm 處的吸光度，記為。取3 mL未接種MKB液體加入等體積的 CAS 檢測(cè)液，其余操作相同，吸光度記為。

1.2.2 菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶能力的定性和定量分析 定性檢測(cè)：將內(nèi)生菌菌株點(diǎn)接種至纖維素酶鑒別培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，加入剛果紅溶液，再加入氯化鈉溶液脫色。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生纖維素水解圈，產(chǎn)生纖維素水解圈則說明菌株可產(chǎn)生纖維素酶。

定量測(cè)定：將產(chǎn)生纖維素酶的菌株接種至纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 離心10 min，采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定菌株的纖維素酶活性和濾紙酶活性。

1.2.3 ACC脫氨酶活性的測(cè)定 將供試菌株在液體LB培養(yǎng)基中活化過夜，4 ℃、8 000 r/min離心 10 min，用無菌水收集菌體沉淀并將其重新懸浮于ADF培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后按照秦寶軍等的方法測(cè)定ACC脫氨酶的活性。

1.2.4 菌株對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響 菌液準(zhǔn)備：將供試菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中，35 ℃過夜培養(yǎng)，4 ℃、8 000 r/min離心收集沉淀，無菌水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×10CFU/mL備用。T1處理：濃度為 1×10CFU/mL的L21菌液；T2處理：濃度為1×10CFU/mL 的R24菌液；T3處理：濃度為1×10CFU/mL的L21和R24等比例復(fù)配的菌液；以無菌水處理作為對(duì)照(CK)。

將所供試的種子用75%乙醇溶液消毒10 min，用無菌水洗凈，晾干后置于以上菌液中浸種4 h，待風(fēng)干后再放置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)檢查濕度，確保濾紙潮濕。定時(shí)記錄種子的萌發(fā)數(shù)(以胚根突破種皮1 mm為標(biāo)準(zhǔn))，直至第10天。第4天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第10天計(jì)算發(fā)芽率，并測(cè)定作物的鮮質(zhì)量、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根系活力(用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法測(cè)定)。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)=(4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)()=∑/，其中：為每天的發(fā)芽數(shù)，為發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)()=×，其中：為平均幼苗長(zhǎng)度(芽長(zhǎng)+根長(zhǎng))。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010 和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄、整理、統(tǒng)計(jì)和分析；對(duì)不同菌株處理的小組進(jìn)行組間單因素方差分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株嗜鐵素合成能力測(cè)定結(jié)果

2.1.1 定性測(cè)定結(jié)果 從圖1中可看出，2株內(nèi)生菌在CAS檢測(cè)平板上均可以生長(zhǎng)并產(chǎn)生透明圈，R24菌株的透明圈大于L21菌株?？扇苄灾笖?shù)可初步判斷菌株產(chǎn)嗜鐵素的能力，該值越大其分泌的鐵載體在培養(yǎng)基中的分布范圍越大，即其在相同培養(yǎng)條件和時(shí)間下產(chǎn)生鐵載體的能力越強(qiáng)。本研究中2株供試菌株可溶性指數(shù)均在1.5以上，可溶性指數(shù)表現(xiàn)為R24菌株>L21菌株(表1)。

表1 嗜鐵素合成能力定性測(cè)定結(jié)果

2.1.2 定量測(cè)定結(jié)果 由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株分泌嗜鐵素的能力逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)到60 h時(shí)R24和L21菌株分泌嗜鐵素的能力最強(qiáng)，嗜鐵素相對(duì)含量分別為95.80%、90.08%。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，R24菌株分泌的嗜鐵素相對(duì)含量均大于L21菌株，這與“2.1.1”節(jié)中的結(jié)果一致。

2.2 羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性測(cè)定

2.2.1 定性測(cè)定結(jié)果 2株菌株均能在羧甲基纖維素酶鑒別培養(yǎng)基中形成纖維素水解圈(圖3)，說明2株菌都能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶?？扇苄灾笖?shù)越大表明菌對(duì)纖維素的降解能力越強(qiáng)，由表2可知，菌株R24的可溶性指數(shù)為5.29，L21的可溶性指數(shù)為5.11，降解纖維素酶的能力表現(xiàn)為R24菌株>L21菌株。

表2 羧甲基纖維素酶定性檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 定量測(cè)定結(jié)果 將菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h后上清液的纖維素酶活性和濾紙酶活性測(cè)定結(jié)果如圖4和圖5所示；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在培養(yǎng)72 h后R24和L21菌株的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性均達(dá)到最大值，分別為0.28、0.61 U/mL和0.86、1.43 U/mL。2株菌的羧甲基纖維素酶活性均低于濾紙酶活性，菌株L21的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性均高于菌株R24。

2.3 ACC脫氨酶含量測(cè)定結(jié)果

將菌株在ADF培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜后棄上清液收集菌體，測(cè)得ACC脫氨酶活性如圖6所示，ACC脫氨酶酶活性表現(xiàn)為L(zhǎng)21菌株>R24菌株，其ACC脫氨酶活性分別為2.30、2.00 μmol/(μg·h)。

2.4 菌株對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

2.4.1 不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響 由表3可知，T1、T2、T3處理均能提高薏苡、玉米、水稻、大麥、小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，其中，處理效果最佳的是T1處理，T2處理次之。在T1處理下，文薏2號(hào)、師薏1號(hào)、滇禾優(yōu)55、云麥53的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)；點(diǎn)谷1號(hào)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)和北青7號(hào)的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與CK相比差異也達(dá)到極顯著水平(<0.01)。T1處理下文薏2號(hào)和師薏1號(hào)的發(fā)芽率分別為95.56%、84.44%，較無菌水處理分別增加了13.16%、28.80%；發(fā)芽勢(shì)分別為82.22%、76.67%，較CK分別增加了19.35%、25.46%；發(fā)芽指數(shù)分別為43.69%、41.81%，較CK分別增加24.30%、34.09%；活力指數(shù)分別為17.03、15.63，較CK分別增加160.80%、84.32%。

表3 不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

2.4.2 不同處理對(duì)作物根系生長(zhǎng)的影響 由圖7可知，T1、T2、T3處理均能夠促進(jìn)薏苡、玉米、水稻、大麥、小麥的根系生長(zhǎng)，T1處理下，所有供試材料的根系生長(zhǎng)與CK相比差異都達(dá)到極顯著水平(<0.01)，其中，效果最佳的是文薏2號(hào)，其根長(zhǎng)較CK增加了292.85%。T2處理下，文薏2號(hào)、師薏1號(hào)、滇禾優(yōu)55、云麥53和北青7號(hào)的根長(zhǎng)與CK相比差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)，點(diǎn)谷1號(hào)的根長(zhǎng)與CK相比差異達(dá)到顯著水平(<0.05)。T3處理下，師薏1號(hào)的根長(zhǎng)較CK增加了22.08%，并與CK相比差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)；文薏2號(hào)和云麥53的根長(zhǎng)與CK相比差異達(dá)到顯著水平(<0.05)；點(diǎn)谷1號(hào)、滇禾優(yōu)55、北青7號(hào)的根長(zhǎng)分別比CK增加了8.05%、8.89%、55.56%，但是與CK相比差異均未達(dá)到顯著水平。

2.4.3 不同處理對(duì)作物芽長(zhǎng)的影響 由圖8可知，T1、T2、T3處理均提升了供試作物芽的生長(zhǎng)，處理效果表現(xiàn)為T1處理>T2處理>T3處理。除北青7號(hào)外其余供試材料在T1和T2處理下與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)。在T3處理下，師薏1號(hào)和云麥53的芽長(zhǎng)與CK相比差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)；點(diǎn)谷1號(hào)和滇禾優(yōu)55的芽長(zhǎng)與CK相比差異達(dá)到顯著水平(<0.05)；文薏2號(hào)和北青7號(hào)的芽長(zhǎng)分別比CK增加了3.81%和3.41%，但差異未達(dá)到顯著水平。不同處理下幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)詳見圖9。

2.4.4 不同處理對(duì)作物鮮質(zhì)量的影響 由圖10可知，T1、T2、T3處理能夠促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，增加供試作物的鮮質(zhì)量。在T1處理下，所有供試作物的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)。在T2處理下，文薏2號(hào)、師薏1號(hào)和點(diǎn)谷1號(hào)的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達(dá)到顯著水平(<0.05)，滇禾優(yōu)55、云麥53和北青7號(hào)的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)。在T3處理下，點(diǎn)谷1號(hào)和云麥53的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達(dá)到顯著水平，文薏2號(hào)、師薏1號(hào)、滇禾優(yōu)55和北青7號(hào)的鮮質(zhì)量分別顯著較CK增加了3.44%、10.76%、10.89%、6.00%，但差異均未達(dá)到顯著水平。

2.4.5 不同處理對(duì)作物根系活力的影響 由圖11可知，T1、T2、T3處理均能夠提高供試作物的根系活力。在T1和T2處理下，所有供試材料的根系活力與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)；在T1和T2處理下，文薏2號(hào)的根系活力較CK分別增加了205.04%和171.35%。在T3處理下，除了云麥53，其余供試材料的根系活力與CK相比差異均達(dá)到極顯著水平(<0.01)。

3 討論與結(jié)論

植物促生菌能夠有效提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用、改善土壤耕層環(huán)境以及田間生態(tài)環(huán)境，還能通過自身作用或者產(chǎn)生代謝產(chǎn)物來緩解逆境對(duì)植物的傷害，從而來促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在作物生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境方面都具有一定的潛能。本研究利用L21和R24這2株薏苡內(nèi)生菌來探究其促生長(zhǎng)的特性，結(jié)果表明，2株薏苡內(nèi)生菌均能夠產(chǎn)生嗜鐵素、ACC脫氨酶和羧甲基纖維素酶。在本研究中，產(chǎn)生嗜鐵素能力最強(qiáng)的是分離自文薏2號(hào)根系的R24菌株，搖瓶60 h后嗜鐵素相對(duì)含量為95.80%，高于吳娟麗等在土壤中分離得到的E7和W7菌株的嗜鐵素相對(duì)含量，但是菌株產(chǎn)生的嗜鐵素的種類需要進(jìn)一步研究。梁燁等的研究表明，接種含ACC脫氨酶的根際促生細(xì)菌后，在各種鹽堿處理?xiàng)l件下，大豆地上部和根系的干質(zhì)量均增加。本研究中，2株薏苡內(nèi)生菌L21和R24菌株的ACC脫氨酶活性為2.30、2.00 μmol/(μg·h)。促生菌株可以通過利用能夠降解纖維素的微生物，把秸稈降解為腐殖質(zhì)物質(zhì)，增加土壤肥力，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)。在本研究中，2株菌中產(chǎn)生羧甲基纖維素酶和濾紙酶能力最強(qiáng)的是分離自文薏2號(hào)葉片的菌株L21，其活性分別為0.61、1.43 U/mL，2株菌的羧甲基纖維素酶活性均低于濾紙酶活性。在篩選羧甲基纖維素酶高產(chǎn)菌株的過程中發(fā)現(xiàn)，在定性篩選培養(yǎng)基平板上水解圈較大的菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后測(cè)得的酶活性不高，其原因可能是篩選所用的固體培養(yǎng)基和發(fā)酵所用的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件不同；另外，篩選培養(yǎng)基的厚度和菌落菌體量的差異也會(huì)影響水解圈的大小。

韓麗珍等的研究結(jié)果表明，HGD12溶磷菌株顯著促進(jìn)了辣椒和花生種子的萌發(fā)，對(duì)辣椒和花生幼苗植株的鮮質(zhì)量、株高及根長(zhǎng)均有顯著的促生作用。汪焱等的研究結(jié)果表明，促生菌對(duì)植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用；蔡紅丹等的研究結(jié)果表明，用溶磷細(xì)菌處理過的水稻種子出苗速度、出苗整齊度和發(fā)芽率最好。本研究通過種子萌發(fā)試驗(yàn)探究了2株薏苡內(nèi)生菌及其混合菌液對(duì)其宿主植物薏苡以及其他禾本科作物(玉米、水稻、大麥、小麥)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，L21、R24菌株均能顯著提高宿主植物薏苡以及玉米、水稻、大麥、小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根系活力以及幼苗生長(zhǎng)；其中，經(jīng)L21和R24菌株處理的文薏2號(hào)的根長(zhǎng)較無菌水處理分別增加了292.85%和260.71%，說明菌株L21和R24具有極強(qiáng)的促生長(zhǎng)能力，主要表現(xiàn)在促進(jìn)其根系的生長(zhǎng)發(fā)育，且L21菌株的效果更佳；L21和R24菌株的等比例混合菌液與CK相比，在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)方面促進(jìn)效果顯著，但是低于L21和R24菌株單獨(dú)處理的效果，可能的原因是2株菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位等方面有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。綜上可知，L21和R24菌株能顯著促進(jìn)作物苗期生長(zhǎng)發(fā)育，可作為后續(xù)研制生物菌肥的優(yōu)良菌株資源。本研究結(jié)果為薏苡減肥增效提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)，對(duì)推動(dòng)薏苡產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。