趙文俊，陸思名，彭 東，趙超凡，杜 冰，黎 攀

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

美藤果（L.）又稱印加果，是大戟科藤本植物、多年生油料作物。美藤果富含不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，還含有VE、甾醇和多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)，是一種理想的食品加工原料。然而，在實(shí)際加工過程中，美藤果經(jīng)榨取油脂和酶解提取蛋白后，剩余的美藤果粕常被用于生產(chǎn)肥料或者動(dòng)物飼料，甚至直接丟棄。目前，隨著美藤果相關(guān)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和美藤果及其加工產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸擴(kuò)大，美藤果粕產(chǎn)量必會(huì)有所增加，如何高效、高附加值利用美藤果粕成為亟需解決的問題。

膳食纖維根據(jù)溶解性質(zhì)可分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF），與IDF相比，SDF擁有更好的溶解性和黏度，因而更易形成凝膠，在保健及食品工業(yè)領(lǐng)域中有著巨大潛力，并且相較于IDF，SDF抗氧化能力更強(qiáng)。膳食纖維是“第七大營養(yǎng)素”，對(duì)人體健康有著多種積極的作用。研究表明，不同類型的膳食纖維具有不同的功能特點(diǎn)，例如人們從柑橘皮、椰子粉、柚子海綿皮層和蓮藕渣等食品副產(chǎn)品中提取的SDF表現(xiàn)出不同的功能特性，從而為新食品的開發(fā)提供多種思路，滿足消費(fèi)者的不同需求。膳食纖維的來源豐富，但從美藤果中提取膳食纖維卻鮮有報(bào)道。美藤果中含有豐富的脂肪（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.0%）、蛋白質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.8%）和碳水化合物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.2%），經(jīng)過蛋白和油脂提取后，剩余的美藤果粕中含有較多的碳水化合物，是良好的膳食纖維來源。

鑒于此，本研究旨在分析美藤果粕中SDF的化學(xué)組成、基本結(jié)構(gòu)和生理活性，為美藤果加工利用提供理論依據(jù)，為解決美藤果粕造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題，推進(jìn)美藤果加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美藤果粕（美藤果經(jīng)提取蛋白和油脂后剩余的材料） 武漢天天好生物制品有限公司；RAW264.7巨噬細(xì)胞 中山大學(xué)細(xì)胞庫；三氯甲烷、正丁醇等為國產(chǎn)分析純；巖藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、核糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；羥自由基試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒南京建成生物工程研究所；小鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Labserv K3酶標(biāo)儀、CO細(xì)胞培養(yǎng)箱、Evolution 300紫外-可見分光光度計(jì)、ICS5000+離子色譜系統(tǒng)（配備DionexCarboPacPA10色譜柱（250 mm×4.0 mm，10 μm）和電化學(xué)檢測(cè)器） 美國賽默飛世爾科技有限公司；Microfuge 22R Centrifuge低溫高速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；UlitmaIV X射線多晶粉末儀日本理學(xué)公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；EVO MA 15掃描式電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將美藤果粕置于60 ℃的鼓風(fēng)干燥箱烘干10 h，使物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%，粉碎后過40 目篩，按照料液比1∶15（/）加入石油醚，50 ℃回流脫脂6 h，脫脂后過濾，濾渣于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干，得到脫脂美藤果粕。

1.3.2 美藤果粕粗可溶性膳食纖維提取

稱取10.0 g干燥的脫脂美藤果粕樣品，按照料液比1∶20（/）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的硫酸溶液，80 ℃攪拌反應(yīng)2.5 h，室溫冷卻后4 000 r/min離心20 min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，65 ℃低溫減壓濃縮至50 mL，加入4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液靜置24 h進(jìn)行醇沉。醇沉后4 000 r/min離心5 min，取沉淀用95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗滌至中性，冷凍干燥后得到美藤果粕粗SDF。

1.3.3 美藤果粕粗可溶性膳食纖維的純化

美藤果粕粗SDF純化后得到美藤果粕SDF（sacha inchi soluble dietary fiber，SISDF），具體方法如下。取1 g 1.3.2節(jié)制得的美藤果粕粗SDF，加入20 mL去離子水復(fù)溶，加入5 mL Sevag試劑，充分振搖后4 000 r/min離心5 min，取上清液再次加入5 mL Sevag試劑并進(jìn)行振搖和離心，此步驟重復(fù)3 次以除去蛋白質(zhì)。然后將上清液裝入透析袋用去離子水進(jìn)行透析。透析袋外液體的電導(dǎo)率小于1 μS/cm時(shí)結(jié)束透析，將透析袋內(nèi)溶液泵入DEAE-52陰離子交換柱，依次用500 mL去離子水和500 mL 0.02、0.10、0.30、0.50 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液流速2 mL/min，用試管收集洗脫液，每管5 mL，共收集100 管。采用苯酚-硫酸法測(cè)定每管洗脫液的多糖質(zhì)量濃度，收集多糖質(zhì)量濃度較高的組分（SISDF-A1）并凍干，然后用去離子水復(fù)溶，配制成10 mg/mL的溶液，再用葡聚糖凝膠G-100柱純化，洗脫液為去離子水，流速0.6 mL/min，收集多糖質(zhì)量濃度較高的組分，凍干后得到SISDF。

1.3.4 美藤果粕可溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)

1.3.4.1 單糖組成分析

以巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用色譜法得到標(biāo)準(zhǔn)品圖譜。取5 mg SISDF樣品，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，12 ℃冷水浴2 h。通入氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.5 mL甲醇清洗，再次通入氮?dú)獯蹈?，用甲醇重?fù)清洗2～3 次，然后加入0.5 mL超純水溶解后轉(zhuǎn)移至色譜進(jìn)樣瓶備用。采用ICS5000+離子色譜系統(tǒng)（配備DionexCarboPacPA10色譜柱（250 mm×4.0 mm，10 μm）和電化學(xué)檢測(cè)器），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流速0.5 mL/min。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為10 mmol/L NaOH溶液。洗脫程序：0～30.0 min，97.5%～80.0% A；30.1～45.0 min，60.0% A。

1.3.4.2 分子質(zhì)量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]的方法并稍作修改，采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）進(jìn)行分子質(zhì)量的檢測(cè)。流動(dòng)相為20 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL SISDF溶液（質(zhì)量濃度1 g/L），檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。通過測(cè)定SISDF樣品的保留時(shí)間/min，按式（1）計(jì)算其分子質(zhì)量/Da。

1.3.4.3 紫外全波段掃描分析

將SISDF用去離子水配制成1 mg/mL溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察樣品在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處有無吸收峰。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析

取1 mg SISDF樣品和100 mg溴化鉀在研磨缽中充分混合研磨，經(jīng)過壓片機(jī)壓片后，通過傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm范圍內(nèi)進(jìn)行分析。

1.3.4.5 X射線衍射分析

參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行X射線衍射分析。檢測(cè)條件：X射線光源Cu靶，電壓40 kV，入射電流100 mA，掃描角度5°～80°，掃描步長(zhǎng)0.05°，步長(zhǎng)速率0.21（°）/s。

1.3.4.6 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)分析

參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.4.7 掃描電子顯微鏡觀察

將SISDF用銅片和導(dǎo)電雙面膠進(jìn)行黏臺(tái)，用離子濺射法在真空環(huán)境下將試樣鍍金，利用掃描電子顯微鏡觀察SDF形態(tài)。

1.3.5 美藤果粕可溶性膳食纖維體外抗氧化性測(cè)定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率：配制質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的抗壞血酸溶液和SISDF溶液，取1 mL樣品溶液與1 mL DPPH溶液（40 μg/mL）混勻，迅速放置在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，10 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液517 nm波長(zhǎng)處的吸光度（），以加入等體積去離子水作為空白對(duì)照并按上述操作測(cè)定吸光度（），按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

羥自由基清除率根據(jù)羥自由基試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率根據(jù)T-AOC試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 美藤果粕可溶性膳食纖維免疫活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96 孔板中，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO、37 ℃下培養(yǎng)24 h；然后將細(xì)胞分為空白組、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）組和SISDF組；空白組用磷酸鹽緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，LPS組用10 μg/mL LPS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，SISDF組用不同質(zhì)量濃度（62.5、125、250、500、1 000 μg/mL）的SISDF對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，LPS組即陽性對(duì)照組，參考文獻(xiàn)[14]采用MTT法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖活性。

參照文獻(xiàn)[15]的方法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

參照文獻(xiàn)[16]的方法略作修改，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的一氧化氮（NO）濃度；參考相應(yīng)的ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β、IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 美藤果粕可溶性膳食纖維純化

圖1A為DEAE-52陰離子交換色譜純化的結(jié)果。將去離子水洗脫得到組分命名為SISDF-A1，將0.02 mol/L NaCl溶液洗脫得到組分命名為SISDF-A2。由洗脫曲線可知，兩個(gè)組分均沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，表明組分之間分離效果良好。SISDF-A1組分中多糖質(zhì)量濃度較SISDF-A2高，利于后續(xù)檢測(cè)，故收集SISDF-A1組分用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1B為葡聚糖凝膠G-100柱純化的結(jié)果，洗脫曲線呈無拖尾單一峰，說明組分純度高，收集6～14管的純化SDF液體并凍干得到SISDF（純度為98.0%），用于后續(xù)檢測(cè)。

圖1 SISDF的洗脫曲線Fig. 1 Elution profile of SISDF

2.2 美藤果粕可溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 單糖組成

離子色譜分析單糖標(biāo)準(zhǔn)品和SISDF單糖組成結(jié)果如圖2A、B所示，表1所示為SISDF單糖的相對(duì)含量。SISDF的單糖組成中，半乳糖醛酸占最大比例（46.49%），其次為鼠李糖（18.95%）、木糖（17.60%）和半乳糖（11.25%），SISDF不含核糖、古洛糖醛酸和甘露糖醛酸。由此說明，SISDF是雜多糖。SISDF的單糖組成與美藤果多糖（PVLP-1）的部分單糖種類相似，但是SISDF所具有的半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸是PVLP-1中不具有的，出現(xiàn)這些差異的原因可能是原料狀態(tài)、提取條件和純化分離方法的不同。有研究發(fā)現(xiàn)多糖中糖醛酸的含量越高，其清除羥自由基的能力越強(qiáng)，Kereh等從馬尾藻中提取的富含糖醛酸的提取物可以提高雞蛋的免疫力，Ai Zhiyi等的研究表明發(fā)酵導(dǎo)致人參多糖中糖醛酸含量增加，從而增強(qiáng)了人參多糖的體外抗氧化能力，并抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥相關(guān)因子的升高。SISDF具有較高含量的糖醛酸，由此推測(cè)SISDF可能具有較好的抗氧化活性和免疫活性。

圖2 SISDF的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果Fig. 2 Structural analysis of SISDF

表1 SISDF的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of SISDF

2.2.2 分子質(zhì)量

如表2所示，HPGPC測(cè)定SISDF的重均分子質(zhì)量為401 479 Da，且分布列為1.11（＜2），說明SDF的均一性和溶解性較好。研究表明，多糖分子質(zhì)量越高，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，越可能具有高的生物活性，較高的分子質(zhì)量可以改善SDF的表觀黏度，這對(duì)提高其生物活性是有益的。本研究中，SISDF擁有較大的分子質(zhì)量，更容易在胃腸道中包裹住更多的水分子，從而使體積增加，產(chǎn)生飽腹感。

表2 SISDF分子質(zhì)量Table 2 Molecular mass of SISDF

2.2.3 紫外全波段掃描結(jié)果

SISDF紫外全波段掃描結(jié)果如圖2C所示。在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處沒有明顯的吸收峰，說明SISDF不含核酸和蛋白質(zhì)，純度較高。SISDF中的蛋白質(zhì)可通過Sevag法、陰離子交換柱和凝膠柱層析等方法除去，其中能被除去的是游離態(tài)蛋白質(zhì)，表明SISDF并非糖蛋白。

2.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

由圖2D可知，在4 000～400 cm范圍內(nèi)，SISDF在3 376、2 937、1 738、1 657 cm處出現(xiàn)吸收峰，表明SISDF具有多糖特征吸收峰。SISDF在1 738 cm和1 657 cm處的吸收峰分別代表SISDF樣品中羰基的C＝O和羧酸根離子（—COO）基團(tuán)，說明SISDF存在糖醛酸，這與單糖組成的檢測(cè)結(jié)果相印證。1 547 cm處出現(xiàn)的弱峰可能是苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)所引起的，說明SISDF可能含有少量的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，可能存在少量木質(zhì)素；而在1 416 cm處的吸收峰是由C＝C的伸縮振動(dòng)所引起；1 336、1 261、1 239 cm處的吸收峰是吡喃糖的C-O-H伸縮振動(dòng)引起的，1 095、1 041 cm處的吸收峰是吡喃糖苷的C＝O伸縮振動(dòng)引起，說明SISDF是吡喃糖型的雜多糖，糖鏈中含有吡喃環(huán)狀結(jié)構(gòu)。921 cm和895 cm處的弱吸收峰表明-吡喃環(huán)中C-H發(fā)生彎曲；此外，802 cm處的吸收峰表明SISDF存在吡喃環(huán)中的-異頭碳，主要含有-糖苷鍵；而631 cm和534 cm處的吸收峰可能是羰基的-C＝O扭曲振動(dòng)引起的。綜合考慮，推測(cè)SISDF可能是含有糖醛酸的-構(gòu)型吡喃糖。另外，Guo Lei等發(fā)現(xiàn)，從白樺中提取的LBPs-5和LBPs-6多糖為典型的-吡喃糖，兩種水溶性多糖對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基均有較強(qiáng)的清除作用。Al-Sheraji等用酸法從芒果纖維中提取出4種多糖，光譜分析發(fā)現(xiàn)其具有型結(jié)構(gòu)，其中F1不含糖醛酸且抗氧化能力最低，F(xiàn)4的DPPH自由基清楚能力最強(qiáng)。說明，型多糖有良好的抗氧化活性。

2.2.5 X射線衍射結(jié)果

X射線衍射通常用于確定纖維的結(jié)晶度，SISDF的X射線衍射結(jié)果如圖2E所示，SISDF在2＝21.32°處出現(xiàn)了單一的強(qiáng)衍射峰，該處對(duì)應(yīng)的是纖維晶體的002面；利用Segal法計(jì)算得出SISDF的結(jié)晶度為20.20%，可以判斷SISDF屬于纖維素I型，處于晶區(qū)和非晶區(qū)混合狀態(tài)。膳食纖維由70%的有序結(jié)晶區(qū)和30%的無定形區(qū)（即非晶區(qū)）組成，尖銳的XRD峰是結(jié)晶纖維素的特征。另外，木質(zhì)素是無定形區(qū)域的組成部分之一，與傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果相印證。

2.2.6 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SISDF的碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2F所示。當(dāng)波長(zhǎng)為355 nm時(shí)，SISDF與碘-碘化鉀絡(luò)合物出現(xiàn)最大吸收峰；波長(zhǎng)大于355 nm時(shí)，吸光度急速下降并在波長(zhǎng)為500 nm之后緩慢趨于零。由此說明，SISDF可能具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。

2.2.7 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡通常用于觀察和記錄不同化合物的表面形態(tài)。由圖3可知，總體來說，SISDF的表面呈比較光滑平整的碎片狀，并帶有少量不規(guī)則孔洞或間隙，且伴隨著輕微的球狀物凸起，這種結(jié)構(gòu)增大了SISDF的表面積，從而促進(jìn)了水分在腸道中的吸收，有助于增加飽腹感并提高SISDF的吸附能力。

圖3 SISDF的掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic image of SISDF

2.3 美藤果粕可溶性膳食纖維體外抗氧化活性

DPPH自由基清除模型是使用最廣泛的抗氧化活性檢測(cè)方法；羥自由基是一種活性氧，具有很強(qiáng)的氧化能力，可降解DNA和細(xì)胞膜并引起組織損傷或細(xì)胞凋亡，故SDF的羥自由基清除能力對(duì)保護(hù)細(xì)胞甚至食品體系有著密切的關(guān)系；ABTS陽離子自由基模型亦被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)SDF的T-AOC。SISDF的抗氧化活性如圖4所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，SISDF對(duì)DPPH自由基、羥自由基和ABTS陽離子自由基的清除率呈增大的趨勢(shì)，清除率的范圍在38.26%～73.16%之間，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)SISDF的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為68.57%、羥自由基清除率為69.83%、ABTS陽離子自由基清除率為70.35%。從香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜和茶樹菇中提取的SDF在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL以下時(shí)，DPPH自由基清除率在11.63%～73.34%之間；琯溪柚皮海綿層SDF對(duì)羥自由基清除率為51.50%～66.16%，與SISDF的羥自由基清除率相近。相較于上述物料，SISDF的自由基清除能力更強(qiáng)，具有作為食品體系中抗氧化成分的開發(fā)潛力。

圖4 SISDF的抗氧化活性Fig. 4 Antioxidant capacity of SISDF

2.4 美藤果粕可溶性膳食纖維免疫活性

2.4.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖活性和吞噬活性

SISDF處理對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性和吞噬活性的影響結(jié)果分別如圖5A、B所示。LPS組的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性和吞噬活性極顯著低于空白對(duì)照組（＜0.01），說明造模成功，而SISDF質(zhì)量濃度為62.5～1 000 μg/mL時(shí)，能促進(jìn)提升RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖活性和吞噬活性，SISDF質(zhì)量濃度高于62.5 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖活性均極顯著高于空白對(duì)照組（＜0.01），當(dāng)SISDF質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性可達(dá)到121.66%，但質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，增殖效果減弱，可能是劑量過大而損傷細(xì)胞導(dǎo)致的結(jié)果。當(dāng)SISDF質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL時(shí)，RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬活性最高，相較于其他質(zhì)量濃度組差異不明顯。Yang Lichan等從稻殼中分離出的膳食纖維在5～30 mg/kg范圍內(nèi)能夠增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的吞噬活性，與本研究中62.5～1 000 μg/mL SISDF處理的效果相近。

圖5 RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖活性（A）和吞噬活性（B）Fig. 5 Proliferative (A) and phagocytic activity (B) of RAW264.7 macrophages

2.4.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞相關(guān)因子分泌水平

不同質(zhì)量濃度SISDF處理對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞相關(guān)因子分泌水平的影響如圖6所示，空白對(duì)照組RAW264.7巨噬細(xì)胞相關(guān)因子分泌水平顯著或極顯著低于10 μg/mL LPS組（＜0.05或＜0.01），說明RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥造模成功。炎癥因子在機(jī)體內(nèi)的平衡有重要意義，研究表明，機(jī)體內(nèi)炎癥因子的升高有利于細(xì)胞修復(fù)，但過高的炎癥因子水平又會(huì)導(dǎo)致炎癥損傷，故炎癥相關(guān)因子要保持在正常水平以發(fā)揮最適合作用。

NO是一種促炎癥介質(zhì)，也是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，同時(shí)在抗菌反應(yīng)方面起重要作用，NO的釋放可以用作巨噬細(xì)胞活化指標(biāo)的參數(shù)之一。SISDF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO水平的影響如圖6A所示，在62.5～1 000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，NO的濃度隨SISDF的質(zhì)量濃度增加而總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)SISDF質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，NO的濃度達(dá)到最大值（48.54 μmol/mL），高于LPS組，而后NO濃度下降的原因可能是細(xì)胞的增殖活性和吞噬活性下降，由此可知，62.5～1 000 μg/mL SISDF處理可刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO。

IL-1β可刺激巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其傳遞抗原的能力，吸引中性粒細(xì)胞后使炎癥介質(zhì)釋放，對(duì)細(xì)胞損傷具有重要的意義。SISDF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-1β水平的影響如圖6B所示，62.5～1 000 μg/mL SISDF處理可以刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，SISDF處理組的IL-1β水平高于空白對(duì)照組但差異不顯著（＞0.05），與LPS組相比，高質(zhì)量濃度的SISDF能夠顯著降低巨噬細(xì)胞中IL-1β的質(zhì)量濃度，結(jié)果表明，62.5～1 000 μg/mL SISDF處理能夠提高細(xì)胞的IL-1β分泌水平，同時(shí)又可以降低由于炎癥導(dǎo)致的過高的IL-1β分泌水平。

IL-6由多種細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血和神經(jīng)系統(tǒng)有多方面作用。SISDF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6水平的影響如圖6C所示，62.5～1 000 μg/mL SISDF處理巨噬細(xì)胞的IL-6質(zhì)量濃度均高于空白對(duì)照組，當(dāng)SISDF質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，IL-6質(zhì)量濃度最高（39.05 pg/mL），且高于LPS組但差異不顯著（＞0.05）。表明SISDF質(zhì)量濃度在62.5～1 000 μg/mL范圍內(nèi)有一定的提高巨噬細(xì)胞分泌IL-6的能力。

TNF-α是典型的促炎因子之一，其生物學(xué)活性十分復(fù)雜，參與造血、免疫和炎癥的調(diào)節(jié)，對(duì)血管和凝血有一定的影響。SISDF對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α水平的影響如圖6D所示，在62.5～1 000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組相比，SISDF處理組均能提高細(xì)胞中TNF-α的質(zhì)量濃度，當(dāng)SISDF質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，TNF-α的質(zhì)量濃度達(dá)到最高，且高于LPS組。結(jié)果表明，62.5～1 000 μg/mL SISDF處理可刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)，分泌TNF-α，當(dāng)SISDF的質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度過高的原因可能是高劑量的SISDF對(duì)巨噬細(xì)胞有刺激損傷作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，巨噬細(xì)胞增殖活性的分析結(jié)果（圖5A）也可說明高劑量下的SISDF對(duì)細(xì)胞有一定程度的損傷。Ketha等從綠豆中提取的非淀粉多糖組分在質(zhì)量濃度為50～200 μg/mL范圍內(nèi)能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞釋放NO的能力，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，其最大釋放量為5 μmol/mL，而SISDF質(zhì)量濃度為125 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞釋放NO濃度為43.08 μmol/mL，說明SISDF在免疫活性方面有較好的開發(fā)潛力。

圖6 RAW264.7巨噬細(xì)胞相關(guān)因子分泌水平Fig. 6 Secretion levels of related factors in RAW264.7 macrophage

3 結(jié) 論

本研究鑒定的SISDF是以吡喃鏈為主鏈，多分支側(cè)鏈的大分子多糖，表面光滑帶有不規(guī)則間隙。同時(shí)，SISDF有良好的自由基清除能力，并呈劑量依賴性，還能夠增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬能力，具有一定的免疫活性。綜上，SISDF具有良好的抗氧化活性和免疫活性，本研究可為SISDF在功能性食品方面的應(yīng)用提供理論支撐，為美藤果粕資源浪費(fèi)問題提供解決方案。