趙雪飛，黃 晶，李 乾，梁利群，孫 博，張立民，王維坤，常玉梅

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040； 3.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；4.黑龍江省東寧市水產(chǎn)局，黑龍江東寧 157200)

三塊魚(yú)()是鯉形目鯉科雅羅魚(yú)亞科三塊魚(yú)屬幾種土著經(jīng)濟(jì)種的統(tǒng)稱，主要分布于太平洋西北部的日本海及一些內(nèi)陸淡水河流，包括俄羅斯的濱海省、哈巴洛夫斯克和薩哈林，日本及朝鮮半島，在我國(guó)僅分布于綏芬河和圖們江流域。三塊魚(yú)是傳統(tǒng)的珍稀名貴魚(yú)類(lèi)，肉質(zhì)細(xì)嫩、肉味鮮美，其中所含的蛋氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸較一般魚(yú)類(lèi)含量高，同時(shí)含有豐富的不飽和脂肪酸和維生素A、維生素D等。歷史上，三塊魚(yú)與興凱湖的大白魚(yú)和烏蘇里江的鮭并稱為“邊塞三珍”。

近年來(lái)，由于水域環(huán)境遭到破壞，加之污染和酷捕濫撈等人為因素，洄游至我國(guó)的三塊魚(yú)資源瀕臨枯竭，由曾經(jīng)的幾十萬(wàn)尾到目前的幾千尾。為增加三塊魚(yú)的野生種群數(shù)量，自1989年以來(lái)，黑龍江省東寧市水產(chǎn)局通過(guò)捕撈洄游產(chǎn)卵群體，采集精卵，實(shí)施人工授精和苗種孵化的方式，補(bǔ)充三塊魚(yú)野生資源。早期三塊魚(yú)洄游產(chǎn)卵群體因婚姻色差異和洄游時(shí)間的不同被劃分為3個(gè)群體，俗稱“金灘頭”、“銀灘頭”和“黑灘頭”。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者從解剖學(xué)、生化及DNA分子標(biāo)記等多個(gè)角度證實(shí)，洄游到我國(guó)綏芬河產(chǎn)卵的只有2個(gè)種群，即俗稱“金灘頭”的珠星三塊魚(yú)()和俗稱“黑灘頭”的三塊魚(yú)()；而“銀灘頭”實(shí)際上是珠星三塊魚(yú)、三塊魚(yú)及二者少量的雜交個(gè)體組成的一個(gè)混合群體。

珠星三塊魚(yú)和三塊魚(yú)表型相近，不易區(qū)分，只有在性成熟時(shí)，依據(jù)洄游時(shí)間和婚姻色進(jìn)行區(qū)分，因此極易造成種質(zhì)混雜。近期研究團(tuán)隊(duì)在結(jié)合表型鑒定和分子標(biāo)記檢測(cè)兩種技術(shù)判定時(shí)就發(fā)現(xiàn)，珠星三塊魚(yú)種質(zhì)混雜嚴(yán)重，一些個(gè)體在表型和基因組層面都出現(xiàn)了三塊魚(yú)特有的表型特征和基因痕跡。因此，為保護(hù)這一珍貴種質(zhì)資源，本研究采用了“表型+基因型”相結(jié)合的輔助選育技術(shù)，對(duì)珠星三塊魚(yú)野生原種連續(xù)兩代進(jìn)行鑒定，并對(duì)比選育和未選育F代生長(zhǎng)性狀，以期獲得提純的優(yōu)質(zhì)珠星三塊魚(yú)種質(zhì)，為科學(xué)指導(dǎo)珠星三塊魚(yú)的增殖放流，確保其種質(zhì)的純正及天然野生資源的可持續(xù)利用提供保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)來(lái)源及表型鑒定

依據(jù)珠星三塊魚(yú)的洄游時(shí)間，2014年4月下旬，從黑龍江省東寧市綏芬河捕撈洄游產(chǎn)卵的珠星三塊魚(yú)野生親魚(yú)，分別采集精卵進(jìn)行人工授精，然后將約3萬(wàn)粒受精卵帶回至黑龍江水產(chǎn)研究所室內(nèi)養(yǎng)殖車(chē)間進(jìn)行孵化桶流水孵化，獲得魚(yú)苗約6 000尾，經(jīng)開(kāi)口馴化后轉(zhuǎn)至黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站室外土池(0.2 hm)培養(yǎng)至4齡性成熟。體色鑒別發(fā)現(xiàn)這批珠星三塊魚(yú)出現(xiàn)兩種體色特征，一種是珠星三塊魚(yú)特有體色特征，體側(cè)為三條紅線(側(cè)線鱗，側(cè)線鱗上、側(cè)線鱗下)，記為珠星三塊魚(yú)野生原種；另一種則為三塊魚(yú)特有體色特征，體側(cè)為單條紅線(側(cè)線鱗下，圖1)，記為珠星三塊魚(yú)變異種。分別選取93尾顏色純正的原種和69尾變異種進(jìn)行電子標(biāo)記，并剪取鰭條進(jìn)行mtDNA和核DNA檢測(cè)。

圖1 珠星三塊魚(yú)原種及變異種Fig.1 Wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

1.2 線粒體DNA COI基因鑒定

DNA提取和線粒體基因引物信息及擴(kuò)增方法等參考常玉梅等的報(bào)道。具體來(lái)講，采用線粒體通用引物(F:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；R:5′-TAGACTTCTGGG TGGCCAAAGAATCA-3′)對(duì)珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種共162尾個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包含自制PCR buffer mix 18μL(50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.10%TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl、0.10%NP-40、0.01%明膠、200 μmol/L 4種dNTP)，濃度10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA聚合酶0.2 μL(Fermentas,5 U/L)，模板DNA 2 μL，去離子滅菌水補(bǔ)至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 15 s，57.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送至北京諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序。

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載俄羅斯濱海區(qū)珠星三塊魚(yú)(isolate Vkk，EU392224.1)和三塊魚(yú)(EU392229.1)特有的單倍型序列，然后與本研究中的162條序列合并后采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter,K2P)的單倍型進(jìn)化樹(shù)，并經(jīng)1 000次自展檢驗(yàn)(Bootstrap)。選用草魚(yú)()基因相應(yīng)片段(NC_010288.1)作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的外類(lèi)群。

1.3 種質(zhì)特異DNA分子標(biāo)記鑒定

為了避免mtDNA因母性遺傳特征而無(wú)法高效鑒定雜交種的問(wèn)題，本研究采用前期已鑒定的三塊魚(yú)種質(zhì)特異性核DNA(Microphthalmia-associated transcription factor a)基因繼續(xù)對(duì)已完成基因鑒定的珠星三塊魚(yú)野生原種進(jìn)行種質(zhì)鑒定。同時(shí)，根據(jù)常玉梅等和趙雪飛等報(bào)道的已用分子標(biāo)記鑒定過(guò)的珠星三塊魚(yú)和三塊魚(yú)野生鰭條樣本(各2尾)作為對(duì)照?；蛞镄畔⒓皵U(kuò)增方法參照趙雪飛等的報(bào)道。具體來(lái)講，采用基因引物(F：5′-CTGGGGTTGACAAAGAATGGT-3′；R：5′-TGGTGTGTTCGTTTCTGCTG-3′)對(duì)88尾珠星三塊魚(yú)野生原種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系同基因擴(kuò)增體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 分子標(biāo)記輔助珠星三塊魚(yú)原種擴(kuò)繁

將表型和基因型(線粒體DNA基因型及核DNA基因型)鑒定均為珠星三塊魚(yú)野生原種的4+性成熟個(gè)體，于2019年5月28日進(jìn)行人工催產(chǎn)和授精，獲得自交F。隨機(jī)抽取30尾子代樣本和30尾親本，進(jìn)行線粒體DNA基因及核DNA基因雙重鑒定，確定子代種質(zhì)純正。

1.5 提純子代與未提純子代生長(zhǎng)對(duì)比

為了觀察提純子代是否存在生長(zhǎng)衰退現(xiàn)象，本研究進(jìn)行了提純子代及未提純子代生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。首先將2 600尾提純子代及未提純子代于2019年6月5日分別投放至黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站兩個(gè)0.08 hm室外土池進(jìn)行分塘飼養(yǎng)，越冬前(4月齡)分別測(cè)定體重和體長(zhǎng)；然后剪鰭標(biāo)記后分別挑選1 500尾進(jìn)行并塘越冬(0.2 hm土池)，次年繼續(xù)同塘飼養(yǎng)28個(gè)月，每年10月初(16月齡和28月齡)隨機(jī)打撈兩種實(shí)驗(yàn)魚(yú)分別測(cè)定體重和體長(zhǎng)。采用Student′s t-test分別評(píng)估同一采樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)提純子代和未提純子代的體重和體長(zhǎng)差異，顯著性設(shè)定為<0.05，所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種線粒體COI基因鑒定結(jié)果

將4齡珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種共計(jì)162尾個(gè)體的基因擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì)處理，得到有效序列長(zhǎng)度為633 bp。單倍型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，162尾個(gè)體共檢測(cè)到4種單倍型(圖2)，其中Hap3為主效單倍型，有144尾個(gè)體共享，其余3種單倍型，只有5～7尾個(gè)體共享(表1)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，珠星三塊魚(yú)原種的兩個(gè)單倍型Hap3和Hap4與俄羅斯的珠星三塊魚(yú)聚為一支；而珠星三塊魚(yú)變異種特有的兩個(gè)單倍型Hap1和Hap2與俄羅斯的三塊魚(yú)聚為一支(圖3)。

圖2 COI基因在珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種中的4種單倍型Fig.2 Four haplotypes of COI gene in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

圖3 珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種單倍型系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹(shù)Fig.3 Neighbor-Joining tree of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

表1 珠星三塊魚(yú)野生原種及其變異種的單倍型檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The number of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

2.2 珠星三塊魚(yú)野生原種核DNA mitfa基因鑒定結(jié)果

將單倍型為Hap3的88尾珠星三塊魚(yú)原種挑選出來(lái)，進(jìn)一步利用種質(zhì)特異性DNA標(biāo)記基因進(jìn)行核基因組基因污染檢測(cè)。結(jié)果顯示單倍型為Hap3的人工養(yǎng)殖的珠星三塊魚(yú)野生原種個(gè)體均擴(kuò)增出與野外采集的珠星三塊魚(yú)一致的條帶，并未出現(xiàn)三塊魚(yú)特有的DNA譜帶(圖4)。

圖4 單倍型為Hap3的珠星三塊魚(yú)特異的mitfa基因型Fig.4 Specific mitfa genotypes of T.hakonensis with Hap3M為DNA marker 2000；序號(hào)1-20為珠星三塊魚(yú)原種部分個(gè)體

2.3 分子標(biāo)記輔助珠星三塊魚(yú)原種擴(kuò)繁及子代提純鑒定結(jié)果

經(jīng)線粒體DNA和核DNA雙重分子標(biāo)記鑒定的88尾原種個(gè)體(37♀，51)進(jìn)行人工催產(chǎn)，結(jié)果有55尾個(gè)體(25♀，30)繁殖成功。受精卵孵化出F子代魚(yú)苗后，隨機(jī)選取30尾F子代與30尾親本共同進(jìn)行和基因雙重鑒定?；蜩b定結(jié)果顯示，所有子代與親代均為單倍型Hap3(圖2)；基因鑒定結(jié)果顯示，F(xiàn)子代擴(kuò)增條帶類(lèi)型與親代保持一致，均為珠星三塊魚(yú)野生種特有基因型(圖5)。

圖5 單倍型為Hap3的珠星三塊魚(yú)原種親本及其子代特異DNA譜帶Fig.5 Specific DNA bands of original parents and their offspring of T.hakonensis with Hap3 haplotypeM為DNA marker DL2000；親本為珠星三塊魚(yú)原種的親本；子代為提純的F1子代

2.4 提純子代生長(zhǎng)性狀測(cè)量結(jié)果

提純子代和未提純子代池塘生長(zhǎng)對(duì)比結(jié)果顯示(表2)，分塘飼養(yǎng)至4月齡和并塘飼養(yǎng)至16月齡時(shí)二者體重和體長(zhǎng)均無(wú)明顯差異。但同塘飼養(yǎng)至28月齡時(shí)，提純子代平均體重已增至(256.62±23.28) g，而同齡未提純個(gè)體平均體重僅為(217.78±29.39) g，其生長(zhǎng)速度顯著低于提純子代。

表2 珠星三塊魚(yú)提純子代與未提純子代生長(zhǎng)對(duì)比情況Tab.2 Growth comparison between purified offspring and unselected offspring of T.hakonensis

3 討論

自上世紀(jì)80年代起，就有學(xué)者對(duì)三塊魚(yú)(早期稱之灘頭雅羅魚(yú))的種群生物學(xué)和繁殖生物學(xué)特性等開(kāi)展了相關(guān)研究。目前雖然已經(jīng)能夠?qū)θ斯ゐB(yǎng)殖的兩種三塊魚(yú)野生種實(shí)現(xiàn)全人工繁殖，但由于珠星三塊魚(yú)與三塊魚(yú)僅能通過(guò)洄游時(shí)間和體表的婚姻色進(jìn)行區(qū)分，且野外產(chǎn)卵場(chǎng)地重疊，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均在野外發(fā)現(xiàn)有雜交個(gè)體，因而種群存在種質(zhì)混雜現(xiàn)象。

種質(zhì)鑒定是水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源評(píng)估、開(kāi)發(fā)及利用的重要基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)避免了常規(guī)表型鑒定時(shí)可能存在的誤差，是目前對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行更為合理、準(zhǔn)確鑒定的重要技術(shù)手段。線粒體基因作為物種鑒定的有效基因，因其在不同物種的保守性存在很大差異，被廣泛用于不同種間的種質(zhì)鑒定。利用該技術(shù)，國(guó)外學(xué)者成功地將三塊魚(yú)屬的不同種及地理群體進(jìn)行了劃分。常玉梅等同樣利用該技術(shù)，明確了我國(guó)綏芬河珠星三塊魚(yú)和三塊魚(yú)的分類(lèi)地位。但是由于線粒體DNA的母性遺傳特性，對(duì)存在基因漸滲的群體的鑒定存在偏差，而核DNA分子標(biāo)記技術(shù)則能有效彌補(bǔ)線粒體DNA母性遺傳的不足。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在區(qū)分珠星三塊魚(yú)和三塊魚(yú)時(shí)均選擇采用“mtDNA+核DNA”的兩種基因標(biāo)記鑒定方法來(lái)綜合判定。

為了檢驗(yàn)珠星三塊魚(yú)種質(zhì)是否純正，本研究在原有的“mtDNA+核DNA”鑒定方法基礎(chǔ)上與表型鑒定方法相結(jié)合進(jìn)行三重鑒定。首先依據(jù)表型特征將其劃分為野生原種和變異種，隨后利用基因成功地將162個(gè)個(gè)體劃分到兩個(gè)類(lèi)群，即93個(gè)原種個(gè)體和56個(gè)變異種個(gè)體聚類(lèi)到珠星三塊魚(yú)分支，剩余13個(gè)變異種個(gè)體則聚類(lèi)到三塊魚(yú)分支，說(shuō)明2014年引進(jìn)的珠星三塊魚(yú)野生群體確實(shí)出現(xiàn)了種質(zhì)混雜(表2，圖3)，推測(cè)這些個(gè)體可能是以三塊魚(yú)為母本，珠星三塊魚(yú)為父本的雜交后代。POLYAKOVA等和SAKAI等曾發(fā)現(xiàn)珠星三塊魚(yú)在野外常與分布于北海道的三塊魚(yú)雜交(10-20%的野生后代是雜種)，且通常三塊魚(yú)多為母本參與雜交(85%)，這與本研究結(jié)果是一致的。除天然雜交外，不科學(xué)的增殖放流也可能是造成珠星三塊魚(yú)種質(zhì)混雜的另一主要原因。

從表型鑒定和基因型鑒定結(jié)果可以看出珠星三塊魚(yú)種質(zhì)混雜比較嚴(yán)重，162尾個(gè)體中有69尾個(gè)體都出現(xiàn)了不同程度的混雜。分子標(biāo)記輔助選育可加快具有特定優(yōu)良性狀的品種的選育速度，廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)的遺傳改良。孫效文等利用與體重相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行品種培育，建立了綜合性狀好、生長(zhǎng)速度更快的鏡鯉()新品系；FUJI等利用一個(gè)與抗淋巴囊腫病相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記9-8輔助牙鲆()繁育，其后代未爆發(fā)淋巴囊腫病，而對(duì)照組有4.5%～6.3%的發(fā)病率。但利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)提純鮮有報(bào)道。本研究利用“表型+基因型”逐級(jí)遞進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)成功地對(duì)珠星三塊魚(yú)野生原種進(jìn)行了種質(zhì)提純。連續(xù)兩代檢測(cè)結(jié)果中單倍型均為野生珠星三塊魚(yú)特有單倍型Hap3，核DNA擴(kuò)增譜帶為野生珠星三塊魚(yú)特有基因型，無(wú)論線粒體DNA還是核DNA均未出現(xiàn)分化，表明珠星三塊魚(yú)提純效果佳。另外，通過(guò)池塘生長(zhǎng)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)分子標(biāo)記輔助選育的F子代平均體重顯著高于同齡的未選育子代(表2)，表明提純F代具有良好的生長(zhǎng)性狀。

珠星三塊魚(yú)需4齡才能達(dá)到性成熟，采用傳統(tǒng)的表型選擇的方法進(jìn)行提純復(fù)壯，周期過(guò)長(zhǎng)，而且不能保證種質(zhì)純正。如果采用本研究的“表型+mtDNA+核DNA”三重鑒定輔助選育技術(shù)，則可以克服傳統(tǒng)選育方法中的弊端，大大提升珠星三塊魚(yú)種質(zhì)的提純速度，有效縮短選育周期，提高提純復(fù)壯效率，為珠星三塊魚(yú)野生種質(zhì)資源的恢復(fù)、保護(hù)及合理利用提供技術(shù)支撐和種質(zhì)保障。