楊 洋,李 林,白冠星,畢建啟,萬(wàn)正平,陳 鋒,梁銀銓,張志明

(1.水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所，水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省水生態(tài)保護(hù)與修復(fù)工程技術(shù)研究中心，武漢 430079；2.廣西大藤峽水利樞紐開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，南寧 530000；3.廣州珠江水資源保護(hù)科技發(fā)展有限公司，廣州 510000)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

1.2 精液采集

用干凈的毛巾擦干雄魚(yú)生殖孔附近及體表的水分后，將雄魚(yú)包裹在毛巾內(nèi)，暴露出生殖孔，輕輕從前往后擠壓雄魚(yú)腹部，使精子流出。采集精液要求無(wú)水、尿、血和糞便，精液呈乳白色，入水立即散開(kāi)。每次采集的精液在20 min內(nèi)完成相關(guān)檢測(cè)，避免保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從50尾雄魚(yú)中隨機(jī)挑選10尾，用無(wú)菌移液槍收集雄魚(yú)精子置于滅菌燒杯中混勻，顯微鏡下立即觀察，每次試驗(yàn)觀測(cè)30次，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 精子形態(tài)觀察及密度和pH測(cè)定

將精液用0.9% NaCl溶液分化10 min后用無(wú)水乙醇固定，HE染色，在Nikon Eclipse 80i顯微鏡(400×)下觀察精子形態(tài)，測(cè)量精子頭長(zhǎng)、頭寬和鞭毛長(zhǎng)等指標(biāo)。

用0.9% NaCl溶液稀釋精液400倍，用血球計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司XB.K.25.0.1 mm)在上光XSP-BM-8CA生物顯微鏡(100×)下計(jì)數(shù)，求出精子密度。

1.4 試驗(yàn)液的配置

1.5 精子活力觀察

將精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)劃分為5個(gè)等級(jí)，分別為：激烈運(yùn)動(dòng)、快速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)、搖擺運(yùn)動(dòng)和死亡，以同一個(gè)視野內(nèi)70%精子進(jìn)入下一個(gè)時(shí)期來(lái)劃分每個(gè)時(shí)期。從精子被激活到死亡的全部時(shí)間為精子壽命，在搖擺運(yùn)動(dòng)之前精子均能夠使卵子受精，故將前三個(gè)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間稱為有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

采集到的精液立即送至實(shí)驗(yàn)室，用移液槍吸取部分精液(<5 μL)于載玻片上，涂布均勻，放置于顯微鏡下，將顯微鏡調(diào)至可以觀察到精子的合適位置(100×)，用移液槍加適量實(shí)驗(yàn)液激活精子，記錄時(shí)間并觀察精子運(yùn)動(dòng)情況。本次實(shí)驗(yàn)僅記錄有效運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命和激活率(被激活精子數(shù)量占精子總數(shù)的比值稱為激活率)，觀察結(jié)果以一個(gè)視野下精子為準(zhǔn)。

由同一實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行精子活力、壽命及激活率的觀測(cè)，并由另外一名實(shí)驗(yàn)員隨機(jī)提供精子和實(shí)驗(yàn)液，避免觀測(cè)實(shí)驗(yàn)員主觀誤差。

1.6 不同保存條件下多線盤(pán) 精子活力觀察

采集到的精液立即送至實(shí)驗(yàn)室，各取1 mL原液分裝于5個(gè)10 mL無(wú)菌離心管中。將其中4個(gè)分別存放于-20、-4、4 ℃和室溫(18 ℃)，另外一個(gè)添加9 mL蒸餾水配置的0.9% NaCl溶液(配置方法同上)混勻后也存放于室溫(18 ℃)。每隔1 h觀察各組精子活力(觀察方法同上)并記錄，直至每組精子活力均顯著下降。

1.7 卵子的采集和形態(tài)學(xué)

1.8 繁殖力測(cè)定

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0對(duì)本次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graph pad對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行圖片的繪制。每組均測(cè)量30組數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05判定為具有顯著差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 精子密度、pH和形態(tài)學(xué)指標(biāo)

圖1 多線盤(pán) 精子形態(tài)Fig.1 The sperm morphology of D.multilineatus Cui

2.2 不同水體對(duì)精子活力和壽命的影響

圖2 不同水體對(duì)多線盤(pán) 精子活力和壽命的影響(溫度18 ℃)Fig.2 Effects of different water on sperm motility and sperm life span of D.multilineatus Cui(temperature 18 ℃)圖標(biāo)上方不同小寫(xiě)字母，表示存在顯著性差異(P<0.05)，下圖同。

2.3 不同鹽度對(duì)精子活力和壽命的影響

圖3 不同鹽度對(duì)多線盤(pán) 精子活力和壽命的影響(溫度18 ℃)Fig.3 Effects of different salinity on sperm motility and sperm life span of D.multilineatus Cui(temperature 18 ℃)

2.4 不同pH對(duì)精子活力和壽命的影響

圖4 不同pH對(duì)多線盤(pán) 精子活力和壽命的影響(溫度18 ℃)Fig.4 Effects of different pH on sperm motility and sperm life span of D.multilineatus Cui(temperature 18 ℃)

2.5 不同保存條件下多線盤(pán) 精子活力和壽命

表1 不同保存方式下多線盤(pán) 精子活力和壽命Tab.1 Sperm motility and sperm life span of D.multilineatus Cui under different preservation methods

2.6 多線盤(pán) 卵的形態(tài)

2.7 多線盤(pán) 繁殖力

圖5 多線盤(pán) AF與SL、BW和OW的關(guān)系Fig.5 Regressions between AF and SL,BW,and OW in D.multilineatus Cui

3 討論

3.1 多線盤(pán) 精卵生物學(xué)特性

3.2 多線盤(pán) 精子的適宜保存條件

3.3 多線盤(pán) 精子的適宜激活條件

魚(yú)類(lèi)精子釋放至體外后，須遇水激活才具備使卵子受精的能力。大多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)精子被激活后壽命不足2 min，精子高度活躍具備受精能力的時(shí)間在30 s以內(nèi)，精子激活后壽命和活躍時(shí)間與各種環(huán)境因子(鹽度、pH、溫度和水質(zhì)等)密切相關(guān)，適宜環(huán)境條件下激活，可使精子具備更高的活力，從而能顯著提高受精率。