王 偉，王亞軍，李立杰，沈子偉，倪朝輝，譚鳳霞，柴 毅

(1.長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434025；2.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；3.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223)

三苯基錫(triphenyltin,TPT)是一類重要的有機(jī)錫化合物，具有較強(qiáng)的殺菌能力，常被作為農(nóng)業(yè)殺菌劑而被廣泛應(yīng)用，由于其過(guò)量使用導(dǎo)致土壤中濃度較高，并可能通過(guò)地表徑流進(jìn)入水環(huán)境，從而造成水域生態(tài)環(huán)境污染。TPT還可用于船舶的防污涂料，這也是其在水環(huán)境中較高濃度的主要原因之一。有研究表明我國(guó)水域中TPT的污染狀況已十分嚴(yán)重，據(jù)報(bào)我國(guó)廈門(mén)近海環(huán)境中的TPT濃度為2.2～160 ngSn/L，嘉陵江段水體中的TPT濃度也已高達(dá)37.2 ngSn/L，長(zhǎng)江流域三峽庫(kù)區(qū)受到有機(jī)錫污染的最大濃度為393.35 ngSn/L。水環(huán)境中較高濃度的TPT除了對(duì)各種水生生物可能產(chǎn)生直接危害外，還可進(jìn)一步通過(guò)食物鏈被放大，使整個(gè)水域生態(tài)系統(tǒng)面臨更嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，TPT可顯著降低中華鱘的產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵率，誘發(fā)中華鱘()幼體畸形，是導(dǎo)致中華鱘物種退化的主要原因之一。對(duì)斑馬魚(yú)()的系列研究表明，TPT暴露可引起其生長(zhǎng)抑制、視力衰退、氧化應(yīng)激和甲狀腺分泌紊亂等不良影響。

國(guó)際上將粒徑≤5 mm的塑料顆粒定義為微塑料(microplastics,MPS)，主要是由較大的塑料碎片在生物降解、光降解以及物理磨損等作用下分解產(chǎn)生的，屬于新型污染物，已引起人們極大的關(guān)注。由于塑料價(jià)格低廉、經(jīng)久耐用和攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中，而造成的塑料廢棄物導(dǎo)致水環(huán)境中積累的MPS濃度正在持續(xù)增加。有數(shù)據(jù)表明，沿海港口水域通常是MPS的聚集區(qū)域，瑞典港口地區(qū)海水中的MPS濃度已達(dá)到100 000個(gè)/m，在英國(guó)添馬艦港口檢測(cè)的MPS豐度占全部碎片的65%，在中國(guó)長(zhǎng)江口地區(qū)和三峽庫(kù)區(qū)也發(fā)現(xiàn)了微塑料污染，其豐度分別為(4 137.3±2 461.5) 個(gè)/m和1 597～12 611個(gè)/m。已有多項(xiàng)研究對(duì)MPS的毒性作用機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，聚苯乙烯微塑料能夠在斑馬魚(yú)腮、腸以及肝臟組織中積累，并誘導(dǎo)氧化脅迫，擾亂魚(yú)體的脂質(zhì)和能量代謝，引起炎癥反應(yīng)。MPS由于其尺寸小，比面積大，吸附能力強(qiáng)，也可成為其他環(huán)境污染物的載體并與之相互作用。MPS在聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)染毒物質(zhì)不同的調(diào)節(jié)作用，如MPS和三苯基錫聯(lián)合暴露會(huì)延緩胭脂魚(yú)()的死亡時(shí)間、與銅聯(lián)合暴露促進(jìn)了銅在斑馬魚(yú)肝臟和腸道組織中的積累，加重了腸道和肝臟中的毒性，表現(xiàn)為丙二醛(MDA)和金屬硫蛋白(MT)水平升高，超氧化物歧化酶(SOD)水平下降，與菲聯(lián)合暴露加劇了斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激以及相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)量。因此MPS和環(huán)境污染物聯(lián)合作用值得關(guān)注。

大鱗副泥鰍()是一種小型底層雜食性魚(yú)類，適應(yīng)性強(qiáng)，棲息范圍廣，對(duì)化學(xué)藥物敏感，易于在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖，是較為理想的水生生物實(shí)驗(yàn)材料。目前已有多種水產(chǎn)藥物對(duì)大鱗副泥鰍毒性試驗(yàn)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究三苯基錫單獨(dú)暴露和與微塑料聯(lián)合暴露對(duì)大鱗副泥鰍的急性毒性效應(yīng)，通過(guò)半致死濃度(LC)、安全濃度(SC)、藥物蓄積程度系數(shù)(MAC)和不同時(shí)間段的死亡率來(lái)分析三苯基錫對(duì)大鱗副泥鰍的毒性變化規(guī)律以及聚苯乙烯微球與三苯基錫的聯(lián)合毒性效應(yīng)，為水環(huán)境保護(hù)及污染治理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鱗副泥鰍由荊州市漁都特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供，挑選規(guī)格一致[體重(0.097±0.013) g，體長(zhǎng)(2.03±0.15) cm]、體質(zhì)健康的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)水箱長(zhǎng)0.7 m，寬0.5 m，暫養(yǎng)水體pH 7.5，溶解氧≥6.5 mg/L，水溫(20±1) ℃，光照周期設(shè)置為14 h光照:10 h黑暗。每天正常喂食，日投喂量為1.5%。暫養(yǎng)水每24 h更換。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前24 h停止喂食。

1.2 暴露液配制

將TPT(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于二甲基亞砜(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)配制成1 g/L的母液，避光4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)前再根據(jù)濃度設(shè)置梯度用蒸餾水稀釋到所需濃度。

聚苯乙烯微球(無(wú)錫瑞格生物科技有限責(zé)任公司)粒徑為200 nm，密度為1.05 g/cm，變異系數(shù)(CV)<6%，乙醇中溶脹率為5%～10%，微球電鏡形貌如圖1所示，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水稀釋到所需濃度。

圖1 聚苯乙烯微球形貌表征Fig.1 Morphology characterization of polystyrene microspheres

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察96 h內(nèi)大鱗副泥鰍的死亡情況，得出24 h全部死亡的最低濃度和96 h全部不死亡最高濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)TPT的濃度梯度。

1.3.1 TPT急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置6個(gè)濃度梯度(表1)，每濃度組10尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)，設(shè)3個(gè)平行組，1個(gè)空白對(duì)照組。采用半靜態(tài)方式水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)期間不投喂，為保證實(shí)驗(yàn)暴露液的濃度，每隔24 h更換暴露液一次。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后12 h連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)魚(yú)的運(yùn)動(dòng)情況并記錄，在24、48、72、96 h觀察死亡情況并及時(shí)清出死亡個(gè)體。

表1 TPT的濃度梯度Tab.1 The concentration of TPT

1.3.2 TPT和聚苯乙烯聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

在LC實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)TPT濃度組與聚苯乙烯微球溶液(1 mg/L)聯(lián)合對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度組設(shè)置三個(gè)平行，一個(gè)空白對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用寇式法(Karber)計(jì)算LC、SC和LC的95%置信區(qū)間(CI)，利用MAC來(lái)分析實(shí)驗(yàn)魚(yú)體內(nèi)對(duì)藥物的蓄積、降減變化。采用檢測(cè)比較TPT與TPT+聚苯乙烯處理下實(shí)驗(yàn)魚(yú)存活情況是否存在差異，當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，<0.01時(shí)差異極顯著。相關(guān)計(jì)算公式如下：

LogLC=-(∑-05)；

SC=48 h LC×0.3/(24 h LC/48 h LC)；

95%CI=LogLC±1.96×[∑(pg/n)]；

MAC=100%×(LC-LC)/(LC-LC)，

公式中:為消毒劑最大濃度的對(duì)數(shù)，為相鄰濃度的對(duì)數(shù)差值，為死亡率(%)，∑為各組死亡率之和，為存活率()，為每組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的尾數(shù)，LC和LC為觀察時(shí)段和的半致死濃度值(mg/L)，LC和LC分別為實(shí)驗(yàn)初始、結(jié)束時(shí)半致死濃度(mg/L)。

2 結(jié)果

2.1 TPT單獨(dú)暴露對(duì)大鱗副泥鰍的急性致死效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始6 h后，TPT高濃度組(Ⅴ和Ⅵ)實(shí)驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)明顯應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為易受驚擾，急促不安地上下游動(dòng)，游動(dòng)迅速。中低濃度組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)未出現(xiàn)明顯應(yīng)激反應(yīng)，游動(dòng)平緩，活動(dòng)范圍小。8 h后高濃度組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)游動(dòng)減緩且身體失衡，漂浮在水面上方，隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，身體傾斜，游動(dòng)減少，最終沉至水底靜止不動(dòng)直至死亡。

如表2所示，在96 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)均未發(fā)生死亡，TPT處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡率均隨藥物濃度升高，實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而上升。低濃度組(Ⅰ)的TPT對(duì)大鱗副泥鰍的急性致死效應(yīng)最小，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT對(duì)大鱗副鰍的急性致死效應(yīng)較大，且72、96 h中高濃度組的死亡率均為100%。

表2 大鱗副泥鰍在三苯基錫作用下的死亡率Tab.2 The mortality of P.dabryanusexposed to triphenyltin

2.2 LC50和毒性蓄積效應(yīng)

24、48、72和96 h的LC、CI、MAC和SC結(jié)果如表3所示。TPT對(duì)大鱗副泥鰍24、48、72和96 h的半致死濃度LC分別為0.086、0.037、0.026、0.019 mg/L，安全濃度SC為0.002 mg/L，藥物蓄積程度系數(shù)MAC 隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而下降，且下降較快。

表3 三苯基錫對(duì)大鱗副泥鰍的半致死濃度、藥物毒性蓄積程度系數(shù)和安全濃度Tab.3 LC50,MAC and SC of the triphenyltin in P.dabryanus

2.3 TPT與聚苯乙烯聯(lián)合的毒性效應(yīng)

如圖2所示，由TPT單一毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡率均隨藥物濃度升高，實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而上升。低濃度組(Ⅰ)的TPT對(duì)大鱗副泥鰍的急性致死效應(yīng)最小，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT對(duì)大鱗副泥鰍的急性致死效應(yīng)較大，且中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)的TPT分別在暴露了72 h和48 h后誘導(dǎo)了大鱗副泥鰍100%的死亡率。而在與MPS聯(lián)合的情況下，低濃度組(Ⅱ、Ⅲ)的72 h和96 h的死亡率顯著下降，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)100%的死亡率只有在暴露了96 h和72 h之后才能記錄到，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)100%死亡率較單一毒性結(jié)果均有延遲，低濃度組(Ⅰ)和高濃度組(Ⅵ)無(wú)顯著變化。表明MPS對(duì)TPT的毒性效應(yīng)具有延緩作用。

圖2 三苯基錫與聚苯乙烯聯(lián)合對(duì)大鱗副泥鰍的死亡率比較Fig.2 Comparison of mortality between triphenyltin and polystyrene on P.dabryanus不同小寫(xiě)字母(a,b,c,d)表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的差異顯著(P<0.05)

2.4 三苯基錫和聚苯乙烯聯(lián)合暴露的半致死濃度

如表4所示，TPT和MPS聯(lián)合暴露對(duì)大鱗副泥鰍24、48、72和96 h的LC分別為0.087、0.065、0.041、0.025 mg/L，與TPT單獨(dú)暴露相比，聯(lián)合暴露48、72和96 h的LC均增大，表明MPS能夠抑制TPT的毒性，表現(xiàn)為拮抗作用。

表4 三苯基錫和聚苯乙烯微塑料對(duì)大鱗副泥鰍的半致死濃度Tab.4 LC50 of triphenyltin combined with polystyrene on P.dabryanus mg/L

3 討論

3.1 三苯基錫對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)研究

LC是評(píng)價(jià)污染物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物急性毒性的重要指標(biāo)，根據(jù)魚(yú)類急性毒性實(shí)驗(yàn)的96 h LC，有毒物質(zhì)對(duì)魚(yú)類的毒性作用分為4級(jí):<0.1 mg/L，劇毒;0.1～1 mg/L，高毒;1～10 mg/L，中毒;>10 mg/L，低毒。林華兵等研究發(fā)現(xiàn)三苯基錫對(duì)羽搖蚊()幼蟲(chóng)、小錐實(shí)螺()、顫蚓()的24 h LC分別為278.7、249.1、287.8 μg/L，顏天等測(cè)得三苯基錫對(duì)糠蝦()24 h LC為0.025 μg/L。這些結(jié)果都表明低濃度的三苯基錫對(duì)水生生物具有很強(qiáng)的毒性。其中王慶偉和張瀟峮等研究發(fā)現(xiàn)，三苯基錫對(duì)斑馬魚(yú)(var)的96 h LC為0.012 mg/L，對(duì)胭脂魚(yú)()幼魚(yú)的96 h LC為0.017 mg/L，而本研究顯示三苯基錫對(duì)大鱗副泥鰍的96 h LC為0.019 mg/L，結(jié)果非常接近，可見(jiàn)三苯基錫對(duì)魚(yú)類是劇毒物質(zhì)，三苯基錫污染會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生巨大危害。

MAC常作為生物對(duì)毒物敏感程度的指示參數(shù)，來(lái)分析毒物在生物體內(nèi)的蓄積和降解情況，當(dāng)MAC為正值時(shí)，蓄積作用強(qiáng)于降解作用，MAC為負(fù)值時(shí)，降解作用強(qiáng)于蓄積作用，MAC值越大，即毒效蓄積程度越大，生物抗毒能力下降致死率越大，反之亦然。已有研究表明，探討污染物對(duì)生物毒性的毒性效應(yīng)時(shí)，應(yīng)分析毒物蓄積變化，來(lái)全面評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較三苯基錫MAC值，發(fā)現(xiàn)24～48 h段的MAC值最大，表明此時(shí)間段內(nèi)毒性的蓄積作用遠(yuǎn)大于降解作用，即死亡高峰段。而后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MAC值下降明顯，48～72 h的MAC值是24～48 h的22.9%，72～96 h的MAC值是48～72 h的54.9%，說(shuō)明隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗副泥鰍的降解毒效能力增強(qiáng)，毒效蓄積速度下降，表明大鱗副泥鰍對(duì)三苯基錫敏感性強(qiáng)。

3.2 微塑料與水環(huán)境污染物聯(lián)合的毒性效應(yīng)

眾多研究表明，微塑料能夠與環(huán)境污染物相互作用。KIM等研究了兩種微塑料與鎳(Ni)對(duì)大型溞()的毒性作用，與鎳單一毒性相比，發(fā)現(xiàn)微塑料對(duì)鎳毒性有輕微的拮抗作用。KHAN等研究發(fā)現(xiàn)微塑料顯著降低了斑馬魚(yú)對(duì)銀(Ag)的攝取，也顯著增加了腸道Ag的比例。這些結(jié)果表明不同的微塑料對(duì)不同的環(huán)境污染物的吸附能力不同，這與它們表面的性質(zhì)特征有關(guān)。這種吸附可能改變水生生物對(duì)環(huán)境污染物的利用度和吸收途徑，從而改變其毒性效應(yīng)。OLIVEIRA等研究表明，微塑料的存在延緩了芘誘導(dǎo)鰕虎魚(yú)()的死亡時(shí)間，芘單獨(dú)暴露，發(fā)現(xiàn)最高濃度的芘(200 μg/L)在48 h誘導(dǎo)了100%的死亡，而與微塑料聯(lián)合暴露，只有在60 h后才能記錄到100%的死亡率。本研究三苯基錫與聚苯乙烯聯(lián)合暴露研究也發(fā)現(xiàn)中高濃度組(Ⅵ，Ⅴ)100%的死亡率較三苯基錫單一毒性結(jié)果均有延遲且48、72和96 h的半致死濃度LC均增大，表明微塑料對(duì)三苯基錫的毒性具有一定的調(diào)節(jié)延緩作用。微塑料的存在推遲了大鱗副泥鰍的致死時(shí)間，但沒(méi)有保護(hù)其免受死亡，其原因可能是:(I)聯(lián)合暴露所涉及的機(jī)制是短暫的，只能維持相對(duì)較短的時(shí)間;(Ⅱ)保護(hù)機(jī)制只能應(yīng)對(duì)一定水平的三苯基錫濃度，高于這一閾值水平就會(huì)造成嚴(yán)重的毒性影響，導(dǎo)致死亡。這種聯(lián)合作用機(jī)制很復(fù)雜，需進(jìn)一步研究微塑料和三苯基錫聯(lián)合對(duì)大鱗副泥鰍的影響，特別是長(zhǎng)期暴露于微塑料和三苯基錫的情況下，研究微塑料對(duì)三苯基錫的吸附能力，以及三苯基錫在大鱗副泥鰍不同組織部位的積累，從分子水平上來(lái)分析這種聯(lián)合毒性效應(yīng)。