牙周炎是細(xì)菌感染引起的慢性炎癥性疾病，可激活宿主的免疫反應(yīng)，破壞牙齒的支持組織，最終導(dǎo)致牙齒脫落

。牙周炎的現(xiàn)有治療方法旨在去除菌斑和控制局部炎癥，然而恢復(fù)已經(jīng)喪失的牙周組織依舊是一個(gè)挑戰(zhàn)?；诟杉?xì)胞的組織工程策略為牙周再生帶來新的希望，人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs）是形成牙槽骨的理想細(xì)胞來源，但局部炎癥微環(huán)境抑制了hPDLSCs 成骨分化能力，因此明確hPDLSCs 的成骨分化機(jī)制，尤其是在炎癥環(huán)境下的成骨分化，對(duì)牙周炎治療至關(guān)重要。含有Src 同源結(jié)構(gòu)域2 的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2）是一種由非受體型酪氨酸蛋白磷酸酶11（tyrosineprotein phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）基因編碼，并廣泛表達(dá)的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）。越來越多的證據(jù)表明，SHP2 在骨骼發(fā)育和形成中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)SHP2 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）的體外成骨和體內(nèi)骨形成密切相關(guān)

。但目前SHP2 對(duì)干細(xì)胞的骨形成作用尚有爭議，SHP2 在不同環(huán)境以及不同的細(xì)胞可能對(duì)成骨有著不同作用

。SHP2 與炎癥反應(yīng)同樣關(guān)系密切。SHP2 與干擾素-β 的產(chǎn)生

以及促炎細(xì)胞因子和趨化因子（包括IL-1β）的產(chǎn)生密切相關(guān)

。SHP2 也被證實(shí)可能在不同的炎癥通路中表現(xiàn)出正或負(fù)調(diào)節(jié)功能。由于SHP2 同時(shí)參與成骨和炎癥過程，筆者猜測SHP2 可能參與調(diào)節(jié)hPDLSCs 的成骨分化。SHP2 目前在炎癥條件下是否調(diào)節(jié)hPDLSCs 的成骨分化以及通過何種方式調(diào)節(jié)，目前尚無報(bào)道。本研究通過慢病毒感染敲低hPDLSCs 中的SHP2 基因，旨在探討敲低SHP2 對(duì)炎癥環(huán)境下hPDLSCs 增殖和成骨分化的影響，并研究相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器

hPDLSCs（Sciencell，美國）；SHP2 shRNA 慢病毒表達(dá)載體［pSLenti-U6-shRNA（PTPN11）-CMVEGFP-F2A-Puro-WPRE，和元生物，中國］；胎牛血清（Gibco，美國）；青鏈霉素（Hyclone，美國）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；PBS（Gibco，美國）；甲醇（CNW，德國)；蛋白酶抑制劑（碧云天，中國）；RIPA 裂解液（碧云天，中國）；轉(zhuǎn)膜緩沖液（蘇州新賽美生物科技有限公司，中國）；電泳緩沖液（南京金斯瑞生物科技有限公司，中國）；TBS 緩沖液（上海生物工程有限公司，中國）；蛋白酶抑制劑（碧云天，中國）；CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本）；堿性磷酸酶染色試劑盒（碧云天，中國）；茜素紅S（Sigma，美國）；氯化十六烷基吡啶（Sigma，美國）；COL-1 抗體（1∶1 000，Abcam，美國)；RUNX2 抗體（1∶1 000，Abcam，美國)；ALP 抗體（1∶1 000，proteintech，美國）；GAPDH 抗體（1∶5 000，Proteintech，美國)；核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抗體（p-p65、p65 和IκBα，1∶1 000，Affinity Biosciences，美國）；MAPK 抗體（p-ERK、ERK、p-p38、p-38、p-JNK 和JNK，1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國）；兔源及鼠源二抗（1∶5 000, Proteintech，英國）；ECL 試劑盒（蘇州新賽美生物科技有限公司，中國）；總RNA 提取試劑盒（諾唯贊生物，中國）；HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（諾唯贊生物，中國）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物，中國）；多聚甲醛（博士德生物，中國）；地塞米松（Sigma，美國）；β-甘油磷酸鈉（Sigma，美國）；抗敗血酸（Sigma，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按照低糖DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素/鏈霉素）配置完全培養(yǎng)基用于PDLSCs 的培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)液為完全培養(yǎng)基額外添加成骨誘導(dǎo)成分（50 μM抗壞血酸,10 mM β-磷酸甘油和100 nM 地塞米松）。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及既往研究

，使用10 ng/mL 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和10 ng/mL 白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）刺激hPDLSCs 創(chuàng)建炎癥微環(huán)境。

1.2.2 SHP2 shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 SHP2 shRNA 慢病毒載體由和元生物公司構(gòu)建，根據(jù)Human PTPN11 基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)siRNA 靶點(diǎn)，安排引物合成。將單鏈的引物退火成雙鏈oligo 序列，連接入雙酶切線性化的RNA 干擾載體，替換原有ccdB 毒性基因。菌落PCR 篩選轉(zhuǎn)化子，篩選的陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序驗(yàn)證正確的克隆，進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提。

1.2.3 重組質(zhì)粒的包裝和滴度測定 將構(gòu)建的SHP2 shRNA 慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)人腎上皮細(xì)胞系HEK 293T 細(xì)胞，換液、培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清液，進(jìn)一步離心獲得病毒濃縮液。使用有限稀釋法稀釋病毒濃縮液，用不同濃度梯度感染HEK 293T 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察各孔熒光細(xì)胞數(shù)量，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

11月28日，歐洲委員會(huì)宣布其已根據(jù)《歐盟并購制度》就日本電產(chǎn)集團(tuán)（尼得科）計(jì)劃收購美國家電制造商惠而浦旗下壓縮機(jī)業(yè)務(wù)恩布拉科開展深入調(diào)查。尼得科預(yù)計(jì)將于2019年上半年完成對(duì)恩布拉科的收購。

1.2.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 在96 孔板中加入100 μL 不同處理后的細(xì)胞懸液（5×10

個(gè)/孔），置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO

）中孵育24 h，使細(xì)胞貼壁。在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（1、3、5、7 d）后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育1 h 后酶標(biāo)儀測量450 nm 處的吸光度并繪制生長曲線。

學(xué)生內(nèi)在原因一方面體現(xiàn)在其自我防護(hù)意識(shí)的薄弱，另一方面是由于其心理特點(diǎn)的復(fù)雜化和多樣化。自我防護(hù)意識(shí)受到后天環(huán)境和教育的影響，若在就學(xué)期間缺少相應(yīng)的教育，接觸社會(huì)少，思辨能力差，很容易受到外界的影響改變其初心。還有很多學(xué)生在宿舍里亂用違章電器，缺少防火意識(shí)，一旦出現(xiàn)突發(fā)情況就無法從容應(yīng)對(duì)等。心理特點(diǎn)的復(fù)雜和多樣體現(xiàn)為在學(xué)習(xí)壓力、生活壓力或周邊環(huán)境的影響下，很多學(xué)生會(huì)存在或輕或重的心理問題，承受能力不強(qiáng)，遇到困難就容易選擇極端的處理方式。這些心理問題若不能及時(shí)解決，會(huì)嚴(yán)重影響學(xué)生的身心健康［3］。

1.2.6 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase , ALP）染色及ALP 活性檢測 hPDLSCs 成骨誘導(dǎo)3、7 d 后，去除孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS 洗滌細(xì)胞樣品5 次，每次5 min。加入適量染色工作液，將樣品置于室溫下，避光孵育30 min。去除染色工作液，蒸餾水洗滌2 次，終止顯色反應(yīng)。

慢病毒感染HEK 293T 細(xì)胞72 h 后通過倒置熒光顯微鏡觀察到綠色熒光（圖2），測得SHP2 shRNA 重組慢病毒的滴度為2.9×10

TU/mL，表明轉(zhuǎn)染成功。

ALP 在鈣化過程中作為第一批功能基因，在骨骼發(fā)育早期表達(dá)。在骨礦化過程中，ALP 增加局部無機(jī)磷的濃度，同時(shí)可水解抑制礦化結(jié)晶的焦磷酸鹽，最終促進(jìn)羥基磷灰石的形成。COL-1 是骨骼中有機(jī)細(xì)胞外基質(zhì)中最豐富的成分，其主要功能是和其他膠原蛋白一同充當(dāng)骨細(xì)胞的支架，并起著支撐作用。因此ALP、COL-1 在早期成骨中意義重大，也是經(jīng)典的早期成骨指標(biāo)

。本實(shí)驗(yàn)證明敲低SHP2 可促進(jìn)ALP、COL-1 的表達(dá)，表明SHP2參與了上述早期礦化過程。

1.2.7 茜素紅染色（alizarin red staining, ARS）及鈣離子濃度分析 hPDLSCs 成骨培養(yǎng)21 d 后，用4%多聚甲醛固定15 min 并用茜素紅S 染色液在室溫下染色30 min，顯微鏡下觀察并拍照。每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶，在室溫下充分溶解。使用酶標(biāo)儀測量562 nm 處的吸光度作為鈣結(jié)節(jié)的半定量分析結(jié)果。

成骨誘導(dǎo)3 d 時(shí)，與對(duì)照組相比，SHP2 敲低組ALP、COL-1 基因表達(dá)均有增高（

= 3.628，

=0.022；

= 11.010，

＜0.001），而RUNX2 和OCN 基因表達(dá)無明顯差異（圖4a）；在成骨培養(yǎng)3 d 后SHP2 敲低組ALP 活性高于對(duì)照組（

= 5.423，

=0.032）（圖4b）。在成骨誘導(dǎo)7 d 時(shí)，SHP2 敲低后相較對(duì)照組，只有COL-1 基因表達(dá)增高（

=4.402，

=0.022），其他基因均無明顯變化（圖4c），而成骨誘導(dǎo)7 d 后的ALP 活性檢測顯示，SHP2 敲低后ALP 活性提高（

= 6.947，

= 0.020）（圖4d）。在成骨誘導(dǎo)14 d 后，SHP2 敲低組的COL-1 表達(dá)增高（

=13.32，

＜0.001），但RUNX2，ALP 的表達(dá)無明顯變化（圖4e、4f）。ALP 染色結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)3 d 相比，誘導(dǎo)7 d 的對(duì)照組及SHP2 敲低組染色均加深，說明隨著時(shí)間增加ALP 在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步積累。此外，在成骨培養(yǎng)3 d 后SHP2 敲低組ALP 染色深于對(duì)照組，但成骨誘導(dǎo)7 d 后兩組ALP 的著色深度無明顯差異（圖4g、4h）。經(jīng)ARS 染色實(shí)驗(yàn)證明SHP2 敲低組的著色及鈣結(jié)節(jié)的形成量與對(duì)照組無明顯差異（圖4i）。

在培養(yǎng)1 d 后細(xì)胞增殖暫無明顯改變，而3、5、7 d 后，SHP2 敲低組細(xì)胞活力低于對(duì)照組（

＜0.05, 圖3i）。提示SHP2 對(duì)hPDLSCs 的增殖有一定的潛在作用。炎癥條件下，SHP2 敲低對(duì)hPDLSCs的增殖活力并無明顯影響（

＞0.05）。

1.2.9 蛋白提取以及Western blot 實(shí)驗(yàn) 提取總蛋白并按BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。根據(jù)BCA 所測得蛋白濃度，上樣不同體積的蛋白。蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，并置入封閉液內(nèi)，室溫下?lián)u床封閉10 min。隨后4 ℃過夜孵育一抗。TBST 搖床洗滌3 次，10 min/次。按照一抗的源性選擇不同的兔源或鼠源二抗，室溫孵育1 h，通過化學(xué)成像發(fā)光儀曝光。用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Shapiro-Wilk 法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本比較采用

檢驗(yàn)。

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SHP2 shRNA 慢病毒載體的測序結(jié)果

經(jīng)過比對(duì)，重組克隆中插入的片段序列與選用的oligo 序列完全一致（圖1），表明SHP2 shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒原液滴度測定結(jié)果

hPDLSCs 成骨誘導(dǎo)3、7 d 后，去除孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS 洗滌細(xì)胞樣品3 次，每次5 min。使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。每毫克蛋白樣品每分鐘生產(chǎn)的對(duì)硝基苯酚毫摩爾數(shù)作為ALP 活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 建立體外炎癥模型

使用10 ng/mL TNF-α、IL-1β 刺激hPDLSCs 24 h后，通過RT-qPCR 檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。如圖3a 所示，TNF-α和IL-1β 刺激hPDLSCs 的炎癥組IL-6（

=14.84，

＜0.001）、IL-1β（

= 130，

＜0.001）、IL-8（

= 26.751，

＜0.001）和TNF-α（

= 6.775，

=0.003）基因表達(dá)水平均明顯提高。誘導(dǎo)7 d 后，RT-qPCR 顯示炎癥刺激組成骨相關(guān)基因COL-1（

= 68.42，

＜0.001）、RUNX2（

= 5.359，

= 0.006）的表達(dá)降低（圖3b）。成骨誘導(dǎo)7 d 后，炎癥組hPDLSCs 的ALP 染色淺于對(duì)照組，ALP 活性也更低（

= 22.65，

= 0.002）（圖3c、3d）。成骨誘導(dǎo)21 d 后，ARS 染色同樣顯示相似結(jié)果，即炎癥狀態(tài)下hPDLSCs 的鈣結(jié)節(jié)礦化形成遠(yuǎn)少于對(duì)照組（

= 23.42，

＜0.001）（圖3e）。上述結(jié)果均證明炎癥微環(huán)境會(huì)損傷hPDLSCs 成骨分化潛力。

2.4 SHP2 敲低效率的檢測

SHP2 敲低組和空載病毒組細(xì)胞在熒光顯微鏡下均顯示出明顯的綠色熒光（圖3f），提示病毒轉(zhuǎn)染成功。通過Western blot 及RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，SHP2 敲低組的SHP2 蛋白及基因的表達(dá)顯著降低（

= 9.739，

＜0.001；

= 8.474，

＜0.001），并且與空載病毒組相比，SHP2 表達(dá)量降低達(dá)70%以上（圖3g、3h）。

2.5 敲低SHP2 對(duì)hPDLSCs 增殖活力的影響

1.2.8 RT-qPCR 使用Vazyme RNA extraction kit提取總RNA，用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以cDNA 為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增。引物序列見表1。采用2

相對(duì)定量法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 正常環(huán)境下敲低SHP2 對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響

女性盆底支持系統(tǒng)是由盆底肌肉以及韌帶、筋膜共同構(gòu)成，對(duì)于維持女性盆底器官正常功能以及解剖位置存在重要的意義[1]。在女性盆底肌肉群的承重結(jié)構(gòu)當(dāng)中，恥骨直腸肌是重要部分，恥骨直腸肌出現(xiàn)損傷會(huì)導(dǎo)致女性出現(xiàn)盆底器官脫垂[2]。而在女性恥骨直腸肌損傷的誘發(fā)因素當(dāng)中，經(jīng)陰道分娩被視為主要原因之一，且在相關(guān)研究的數(shù)據(jù)現(xiàn)實(shí)中，表示經(jīng)陰道分娩的初產(chǎn)婦，出現(xiàn)肛提肌損傷的幾率在10%～35%之間，且損傷部位多位于恥骨直腸肌骨盆內(nèi)側(cè)壁附著部位[3]。我院選擇112例經(jīng)陰道分娩女性，讓其分別接受經(jīng)陰道二維腔內(nèi)超聲與陰道三維超聲檢查，對(duì)其恥骨直腸肌損傷情況進(jìn)行觀察，現(xiàn)作如下報(bào)告。

2.7 炎癥環(huán)境下敲低SHP2 對(duì)hPDLSCs 成骨分化的影響

成骨誘導(dǎo)3 d 時(shí)，相較于對(duì)照組，SHP2 敲低組的ALP（

= 6.823，

= 0.006）、COL-1（

= 8.249，

=0.004）、RUNX2（

= 4.589，

= 0.019）基因表達(dá)增高，OCN 作為晚期成骨指標(biāo)在3 d 時(shí)并未表現(xiàn)出明顯差異（圖5a）；SHP2 敲低后，hPDLSCs 的ALP 活性升高（

= 5.064，

= 0.037）（圖5b）。成骨誘導(dǎo)7 d后，與對(duì)照組相比，SHP2 敲低后ALP（

= 6.987，

＜0.001）、COL-1（

= 8.992，

＜0.001）、RUNX（

=3.751，

= 0.033）、OCN（

= 4.737，

= 0.018）的表達(dá)增高（圖5c）。成骨誘導(dǎo)7 d 的ALP 活性升高，與3 d 的結(jié)果相同（

= 4.760，

= 0.041）（圖5d）。在成骨誘導(dǎo)14 d 后，與對(duì)照組相比，SHP2 敲低組的COL-1（

= 8.767，

＜0.001）、ALP（

= 3.418，

=0.027）、RUNX2（

=8.224，

=0.004）的蛋白表達(dá)均增高，這與RT-qPCR 結(jié)果保持一致（圖5e、5f）。從ALP 染色結(jié)果上可見，成骨誘導(dǎo)3 d 和7 d 的SHP2敲低組著色均深于對(duì)照組（圖5g、5h）。SHP2 敲低組經(jīng)ARS 染色后，著色深度及鈣結(jié)節(jié)的形成量高于對(duì)照組（

=87.88，

＜0.001）（圖5i）。

愛國主義教育基地資源融入“綱要”課程教學(xué)，需要高校教師結(jié)合新的教學(xué)內(nèi)容，加大教學(xué)改革力度，以豐富多樣的教學(xué)方法深化學(xué)生對(duì)愛國主義教育基地的認(rèn)識(shí)和對(duì)中國近現(xiàn)代史的理解。

2.8 炎癥環(huán)境下敲低SHP2 通過抑制MAPK/NF-κB通路促進(jìn)hPDLSCs 成骨分化

與非炎癥組相比，炎癥組p-p65 的水平增高（

=36.34，

＜0.001），IκBα水平降低（

=12.79，

＜0.001），說明炎癥因子（TNF-α 和IL-1β）刺激30 min時(shí)已能夠激活NF-κB 通路；而炎癥環(huán)境下，敲低SHP2 可下調(diào)p-p65（

= 12.17，

＜0.001），并且提高IκBα的表達(dá)水平（

=8.979，

＜0.001）（圖6a）。如圖6b所示，與非炎癥組相比，炎癥組p-p38和p-JNK 的表達(dá)增高（

= 67.30，

＜0.001；

= 9.712，

＜0.001）；而炎癥環(huán)境下，敲低SHP2基因可抑制p-p38和p-JNK的表達(dá)（

=25.99，

＜0.001；

=12.79，

=0.002）。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染 以5×10

個(gè)/mL 的密度將hPDLSCs 接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%之間時(shí)加入慢病毒感染（MOI=20）。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。加入嘌呤霉素培養(yǎng)篩選，經(jīng)增殖傳代后，通過RT-qPCR 、Western blot驗(yàn)證敲低效率，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SHP2 低表達(dá)慢病毒（shSHP2）的靶序列為5′-ACACTGGTGATTACTATGA-3′。敲低SHP2 的hPDLSCs 組用shSHP2 表示，空載病毒組用shSHP2-NC 表示。

3 討 論

牙周炎是一種常見的破壞牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，在牙周炎期間，促炎細(xì)胞因子在牙周組織中大量分泌

，抑制PDLSCs 的成骨能力，進(jìn)一步造成牙周硬組織再生的困難。由于臨床上大多數(shù)牙周組織的愈合階段都發(fā)生在牙周炎癥微環(huán)境下，因此研究炎癥細(xì)胞因子對(duì)牙周病和干細(xì)胞介導(dǎo)的愈合過程的影響，對(duì)理解牙周再生機(jī)制及臨床上進(jìn)一步指導(dǎo)和優(yōu)化牙周再生方法至關(guān)重要。

國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)巷道底鼓進(jìn)行了諸多研究。曼·奧頓哥特等[9]通過相似模擬試驗(yàn)對(duì)巷道底鼓的全過程進(jìn)行了研究，結(jié)果表明巷道圍巖的變形與破壞首先在垂直應(yīng)力作用下兩幫巖層被壓裂，其次是水平應(yīng)力的作用巷道頂?shù)装逑蛳锏纼?nèi)移近，其中直接底板圍巖先破壞?？导t普等 [10-11]認(rèn)為底鼓的原因主要在于失穩(wěn)的底板巖層向巷道內(nèi)壓曲，偏應(yīng)力作用下的擴(kuò)容，巖石自身的遇水膨脹。文獻(xiàn)[5-8]將底鼓分為擠壓流動(dòng)性底鼓、撓曲褶皺性底鼓、遇水膨脹性底鼓、剪切錯(cuò)動(dòng)性底鼓等4種類型。文獻(xiàn)[12-18]也先后在巷道底鼓機(jī)理、治理方法、施工機(jī)具等方面進(jìn)行了研究，對(duì)巷道底鼓控制技術(shù)的發(fā)展起到了積極作用。

在刑事訴訟中，偵查人員進(jìn)行訊問時(shí)錄音錄像制度是司法改革的重要成果，發(fā)揮了規(guī)范偵查人員訊問行為、提升司法人員辦案水平、遏制相關(guān)人員刑訊逼供等作用。根據(jù)《監(jiān)察法》的規(guī)定，調(diào)查人員在訊問、搜查、查封、扣押等取證工作中，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行全程錄音錄像，留存?zhèn)洳椤Ｔ撘?guī)定不但對(duì)于監(jiān)察機(jī)關(guān)進(jìn)行調(diào)查取證中嚴(yán)格執(zhí)行法律和紀(jì)律有重要意義，而且保障了調(diào)查人員和被調(diào)查人員的合法權(quán)利?！侗O(jiān)察法》中關(guān)于調(diào)查取證時(shí)錄音錄像的規(guī)定比《刑事訴訟法》中要求更嚴(yán)苛，發(fā)揮的作用亦更大。

然而，牙周炎修復(fù)過程中的骨再生與正常狀況下的不一樣，牙周炎局部具有特殊的炎癥環(huán)境影響了hPDLSCs 再生牙周組織的能力，在炎癥狀態(tài)下hPDLSCs 成骨能力減弱，顯然不利于牙周硬組織的修復(fù)。研究表明，來源牙周炎患者的hPDLSCs 成骨能力受損，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞基因表達(dá)降低以及鈣化結(jié)節(jié)沉積物和ALP 活性減少

。本實(shí)驗(yàn)也證明相比正常環(huán)境，在TNF-α 和IL-1β 誘導(dǎo)炎癥環(huán)境下，hPDLSCs 成骨能力明顯下降。因此，如何提高h(yuǎn)PDLSCs 在牙周炎環(huán)境中的成骨分化能力，使其受損的成骨能力得以恢復(fù)，是干細(xì)胞治療獲得滿意治療效果的重要因素。于是筆者研究了SHP2 敲低在炎癥條件下對(duì)hPDLSCs 增殖及成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)SHP2 敲低在炎癥條件下增加了成骨標(biāo)志物（ALP、COL-1 和RUNX2）的表達(dá)，證實(shí)了SHP2 敲低在炎癥環(huán)境下可以促進(jìn)早期成骨。而在成骨誘導(dǎo)21 d 后，通過ARS 評(píng)估鈣沉積水平，以及在14 d 時(shí)通過Western Blot 評(píng)估成骨相關(guān)蛋白水平，證明了SHP2 敲低對(duì)晚期成骨指標(biāo)也有促進(jìn)作用。相較于正常環(huán)境，SHP2 敲低在炎癥環(huán)境下對(duì)hPDLSCs 成骨分化的促進(jìn)作用更為顯著，這意味著SHP2 對(duì)于炎癥下hPDLSCs 的成骨分化起著重要作用。

NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥發(fā)作中起重要作用

。在炎癥狀況下，NF-κB 通路下游產(chǎn)生炎癥因子（如TNF-α）可抑制骨形成

。在牙周炎疾病背景下，炎癥環(huán)境也被證實(shí)可通過NF-κB 通路抑制hPDLSCs 的成骨修復(fù)效果。據(jù)現(xiàn)有研究表明，SHP2 與NF-κB 信號(hào)通路關(guān)系密切

。因此，筆者認(rèn)為NF-κB 信號(hào)通路可能參與炎癥條件下SHP2 介導(dǎo)的hPDLSCs 成骨分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激能夠激活NF-κB 通路，而SHP2 敲低能夠抑制炎癥狀態(tài)下激活的NF-κB 通路。MAPK 通路位于NF-κB 上游，有3 條主要的分支路線即ERK、JNK、p38

。多項(xiàng)研究證實(shí)了在炎癥環(huán)境下，MAPK 通路中的JNK、p38 由炎癥反應(yīng)激活，而通過各種生物分子或藥物抑制JNK/p38 激活可有效下調(diào)促炎細(xì)胞因子、抑制炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多種炎癥疾病的治療

。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)SHP2 可以調(diào)控MAPK 通路中的p38、JNK 磷酸化。

對(duì)于后期二銨的價(jià)格走勢，鄭冰表示，二銨后市的價(jià)格還是要看成本是否會(huì)出現(xiàn)大的波動(dòng)。目前來看，經(jīng)銷商普遍都比較擔(dān)心高價(jià)買入后，到了后期又出現(xiàn)大幅度跌落現(xiàn)象。后期二銨價(jià)格或?qū)⑷杂幸欢ǖ纳仙臻g，但是目前價(jià)格已經(jīng)漲到一個(gè)相對(duì)尷尬的高點(diǎn)，未來價(jià)格的不確定性還很多，如果說漲價(jià)帶來了機(jī)遇，相對(duì)應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也還是很大。但相比較而言，如果前期有提前備肥的經(jīng)銷商，可操作的利潤空間還是相對(duì)可觀的。

基于本實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)敲低SHP2 基因后，炎癥條件下MAPK-NF-κB 通路部分受到抑制，hPDLSCs 的成骨分化似乎得到恢復(fù)。已有研究證明，p38、JNK 及NF-κB 通路在炎癥狀態(tài)下激活，這些通路被抑制后能夠減輕炎癥反應(yīng)。此外，較低的炎癥水平可促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化，因此筆者推斷高水平炎癥環(huán)境下，敲低SHP2 后，p38、JNK 及NF-κB 通路被抑制，減輕了炎癥反應(yīng)，從而恢復(fù)干細(xì)胞的成骨分化能力。有趣的是，與SHP2 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞中NF-κB 通路的影響相反，在正常條件下，SHP2 敲低導(dǎo)致hPDLSCs 中NF-κB 通路激活。未來的研究需要進(jìn)一步探索這種差異的潛在機(jī)制。

綜上，本研究證明了在炎癥條件下，敲低SHP2可能通過MAPK/NF-κB 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)炎癥環(huán)境中hPDLSCs 的成骨分化。SHP2 可能是治療炎癥相關(guān)骨骼疾?。ㄈ缪乐苎祝┑臐撛诎袠?biāo)，并為臨床上牙周再生的干細(xì)胞治療提供新的思路。

某供電公司在對(duì)一座500 kV變電站500 kV HGIS的5061斷路器I母側(cè)電流互感器A相二次絕緣進(jìn)行檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)該電流互感器對(duì)地、各互感器線圈之間絕緣為0(交接試驗(yàn)規(guī)程要求二次絕緣不低于1000 MΩ) [5]。打開外殼后發(fā)現(xiàn)內(nèi)部有積水，電流互感器線圈受潮、互感器艙室內(nèi)部發(fā)霉嚴(yán)重，如圖1所示。

Zhang Y, Jin YQ and Ji J wrote the article and designed the study. Zhao Q, Lv HD, Wang TC and Dou ZJ collected, processed and analyzed the data. All authors read and approved the final manuscript.

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