李建忠，郝興華，吳海平，武志兵，張麗芳

1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室；2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)退行性疾病實(shí)驗(yàn)室；3.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院臨床心理門(mén)診，山西 長(zhǎng)治 046000；4.長(zhǎng)治市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046099

安鈉咖（Caffeine and Sodium Benzoate）是臨床治療麻醉藥物所致呼吸、循環(huán)衰竭等疾病時(shí)用于興奮中樞神經(jīng)的藥物，屬于我國(guó)規(guī)定管制的精神類(lèi)藥品。安鈉咖具有成癮性，俗稱(chēng)“白面”、“白粉”。安鈉咖長(zhǎng)期濫用不僅會(huì)損害吸食者的心、肺、肝和腦等器官或系統(tǒng)[1～3]，影響個(gè)體身心健康，而且會(huì)影響家庭和睦、社會(huì)安穩(wěn)。長(zhǎng)期吸食安鈉咖的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)精神癥狀和和腦損害[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)20 d 腹腔注射大劑量安鈉咖會(huì)造成大鼠學(xué)習(xí)能力下降[5]。關(guān)于大劑量吸食安鈉咖降低學(xué)習(xí)記憶能力機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用灌胃給藥制備安鈉咖吸食大鼠模型，觀察安鈉咖對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬突觸可塑性的影響，探討安鈉咖濫用影響認(rèn)知功能的機(jī)制，為社會(huì)宣傳抵制吸食安鈉咖提供更有力的理論和生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 35 日齡雄性SD 大鼠購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2019-0010】。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 安鈉咖由長(zhǎng)治市公安局禁毒辦提供。兔抗突觸素（synaptophysin，SYN）抗體（編號(hào)：ab32127）和兔抗突觸后致密蛋白95（postsynaptic density 95，PSD95）抗體（編號(hào)：ab18258）購(gòu)自abcam 公司，石蠟切片神經(jīng)元高爾基法（GOLGICOX）染色試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。Morris 水迷宮（瑞沃德，中國(guó)）；SMART 3.0 行為分析軟件（Panlab，西班牙）；石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)）；超薄切片機(jī)（Leica，德國(guó)）；電泳儀（BIO-RAD，美國(guó)）；凝膠成像儀（Azure，美國(guó)）；透射電子顯微鏡（FEI，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 33 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C）、安鈉咖小劑量組（A-LD）和安鈉咖大劑量組（A-HD）3 組，每組11 只，飼養(yǎng)于室溫（22 ± 1）℃，12 h 晝夜節(jié)律（8：00～20：00）的動(dòng)物房，自由進(jìn)食和飲水。每日上午8 時(shí)左右灌胃給藥1 次（C 組：生理鹽水1 mL；A-LD 組：安鈉咖溶液60 mg/kg；A-HD 組：安鈉咖溶液120 mg/kg），連續(xù)60 d。

1.2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn)：連續(xù)5 d 將大鼠依次從4 個(gè)象限的中點(diǎn)面壁入水，視頻跟蹤系統(tǒng)記錄120 s 內(nèi)找到隱蔽平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期：s），無(wú)論大鼠能否找到隱蔽平臺(tái)允許其在平臺(tái)停留15 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6 d，撤掉平臺(tái)，將大鼠從第2 象限中點(diǎn)面壁入水，視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間及120 s 內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.2.3 組織取材 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取6 只大鼠常規(guī)經(jīng)麻醉、沖洗、固定后取腦，后固定24 h 后取上丘與視交叉之間組織，并沿正中矢狀位一分為二，左側(cè)用于免疫組織化學(xué)染色觀測(cè)海馬區(qū)SYN 和PSD95的表達(dá)，右側(cè)用于Golgi 染色觀測(cè)海馬區(qū)第2、3 級(jí)頂樹(shù)突樹(shù)突棘的變化；其余5 只麻醉后斷頭取腦，分離兩側(cè)海馬，左側(cè)用于Western blot 檢測(cè)SYN 和PSD95的表達(dá)，右側(cè)用于透射電子顯微技術(shù)觀測(cè)超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 每個(gè)組織取6 張海馬不同部位的切片，按照免疫組織化學(xué)染色步驟完成抗SYN（1：250）和抗PSD95（1：1000）免疫組織化學(xué)染色。海馬CA1 區(qū)在400 倍鏡下攝片，并用IPP 軟件測(cè)量SYN 和PSD95 的平均光密度。

1.2.5 Western blot 海馬經(jīng)蛋白提取和濃度測(cè)定后計(jì)算上樣量。蛋白加熱變性后經(jīng)SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)膜，5%BSA 封閉2 h，加入一抗（兔抗SYN 抗體1：50000、兔抗PSD95 抗體1：500、β-actin 1：10000）4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗孵育2 h，ECL 顯影和凝膠成像系統(tǒng)曝光，最后用IPP 軟件測(cè)量各蛋白條帶的光密度值。

1.2.6 Glogi 染色 組織塊按照石蠟切片神經(jīng)元高爾基法（GOLGI-COX）染色試劑盒說(shuō)明書(shū)染色。每個(gè)組織塊取3 張海馬不同部位切片在1000 倍鏡下選擇海馬CA1 區(qū)完全浸漬的神經(jīng)元測(cè)量第2、3 級(jí)頂樹(shù)突長(zhǎng)度（μm），由兩位研究人員獨(dú)立計(jì)數(shù)樹(shù)突棘的數(shù)目并求均數(shù)，然后計(jì)算樹(shù)突棘密度（數(shù)目/μm）。

1.2.7 透射電子顯微技術(shù) 組織塊經(jīng)2.5%戊二醛溶液4 ℃過(guò)夜固定后，參考Paxinos 腦立體定位圖譜于體視顯微鏡下切取海馬CA1 區(qū)。1%鋨酸4 ℃后固定2 h，梯度乙醇脫水，丙酮置換，丙酮、包埋劑不同比例浸漬，包埋劑包埋，制備超薄切片（70 nm），醋酸雙氧鈾和醋酸鉛染色各10 min。在Tecnai G2 Spirit 透射電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)，并從中隨機(jī)拍攝3 張照片清晰的切片（放大13000 倍）。在每張照片上隨機(jī)繪制1 個(gè)方形的區(qū)域，定義為1 個(gè)計(jì)數(shù)框架。根據(jù)突觸確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別突觸，并按照體視學(xué)“禁線法”計(jì)數(shù)突觸。使用體視學(xué)方法和圖像分析系統(tǒng)計(jì)算突觸數(shù)密度（Nv，number/m3）和面密度（Sv，m2/m3）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用表示。逃避潛伏期比較用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析；其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，兩兩間行LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠逃避潛伏期（，s）Tab.1 Comparison of escape latency of rats in three groups (Mean±SD,s)

表1 大鼠逃避潛伏期（，s）Tab.1 Comparison of escape latency of rats in three groups (Mean±SD,s)

*P＞0.05，#P＜0.01，與C 組比較Compared with C group,*P＞0.05,#P＜0.01

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠逃避潛伏期隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加逐漸縮短，但就同一訓(xùn)練日而言，與C 組比較，A-LD 組逃避潛伏期延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而A-HD 組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與C 組比較，A-LD 組在目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)都減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而A-HD 組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)（）Tab.2 Comparison of the time spent in target quadrant and the number of platform crossings in three groups of rats（Mean±SD）

表2 大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)（）Tab.2 Comparison of the time spent in target quadrant and the number of platform crossings in three groups of rats（Mean±SD）

*P＞0.05，#P＜0.01，與C 組比較Compared with C group,* P＞0.05,#P＜0.01

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色顯示SYN 免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，分布于神經(jīng)氈區(qū)，其中C 組染色深，A-HD 組染色明顯變淺，3 組平均光密度值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示：ALD 組低于C 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而AHD 組明顯低于C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；PSD95 免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色，分布于神經(jīng)元胞漿和突起，C 組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多，A-HD 組最少，3 組平均光密度值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示：A-LD 組與C 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而A-HD 組明顯低于C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1、表3。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠海馬CA1 區(qū)SYN 和PSD95 表達(dá)（n=6）A1、A2：C 組B1、B2：A-LD 組C1、C2：A-HD 組A1、B1、C1：檢測(cè)SYN 表達(dá)A2、B2、C2：檢測(cè)PSD95 表達(dá)Fig.1 The expression of SYN and PSD95 in hippocampal CA1 region of rats in each group（n=6,immunohistochemical staining）A1,A2：C group；B1,B2：A-LD group；C1,C2：A-HD group; A1,B1、C1：SYN expression；A2,B2,C2：PSD95 expression

表3 大鼠SYN、PSD95 平均光密度（）Tab.3 Comparison of the mean optical density of SYN and PSD95 of rats in three groups（Mean±SD）

表3 大鼠SYN、PSD95 平均光密度（）Tab.3 Comparison of the mean optical density of SYN and PSD95 of rats in three groups（Mean±SD）

*P＞0.05，#P＜0.01，與C 組比較Compared with C group,*P＞0.05,#P＜0.01

2.3 Western blot 結(jié)果

通過(guò)Western blot 檢測(cè)海馬區(qū)SYN 和PSD95 的表達(dá)，與C 組比較，A-LD 組大鼠海馬SYN 和PSD95 表達(dá)均減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而A-HD組大鼠海馬SYN 和PSD95 表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2、表4。

圖2 Western blot 檢測(cè)大鼠海馬SYN 和PSD95蛋白條帶Fig.2 SYN and PSD95 protein bands in hippocampus of rats in each group detected by Western blot

表4 大鼠SYN、PSD95 累積光密度（）Tab.4 Comparison of integrated optical density of SYN and PSD95 of rats in three groups（Mean±SD）

表4 大鼠SYN、PSD95 累積光密度（）Tab.4 Comparison of integrated optical density of SYN and PSD95 of rats in three groups（Mean±SD）

*P＞0.05，#P＜0.01，與C 組比較Compared with C group,* P＞0.05,#P＜0.01

2.4 Golgi 染色結(jié)果

通過(guò)Golgi 染色檢測(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元第2、3 級(jí)頂樹(shù)突樹(shù)突棘情況，C 組大鼠樹(shù)突棘密集，規(guī)整，AHD 組大鼠樹(shù)突棘稀疏，排列不規(guī)整。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與C 組大鼠比較，A-LD 組樹(shù)突棘密度減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而A-HD 組大鼠樹(shù)突棘密度明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3、表5。

圖3 Golgi 染色檢測(cè)大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元第2、3 級(jí)頂樹(shù)突A：C 組B：A-LD 組C：A-HD 組Fig.3 The secondary and tertiary apical dendrites in the hippocampal CA1 region neurons of rats in each group detected by Golgi stainingA：C group；B：A-LD group；C：A-HD group

2.5 透射電子顯微鏡結(jié)果

透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1 區(qū)超微結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4。通過(guò)體視學(xué)方法及圖像分析系統(tǒng)計(jì)算Nv 和Sv，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，A-LD 組大鼠海馬CA1 區(qū)Nv和Sv 低于C 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但AHD 組大鼠海馬CA1 區(qū)Nv 和Sv 明顯低于C 組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表5。

表5 大鼠樹(shù)突棘密度、Nv、Sv（）Tab.5 Comparison of the dendritic spine density,Nv,Sv of rats in three groups（Mean±SD）

表5 大鼠樹(shù)突棘密度、Nv、Sv（）Tab.5 Comparison of the dendritic spine density,Nv,Sv of rats in three groups（Mean±SD）

*P＞0.05，#P＜0.01，與C 組比較Compared with C group,*P＞0.05,#P＜0.01

圖4 透射電子顯微技術(shù)顯示大鼠海馬CA1 區(qū)超微結(jié)構(gòu) A：C 組B：A-LD 組C：A-HD 組Fig.4 Ultrastructure of hippocampal CA1 region of rats in each group detected by transmission electron microscopy A：C group；B：A-LD group；C：A-HD group

3 討論

咖啡因是一種甲基黃嘌呤物質(zhì)，存在于咖啡、茶、巧克力、軟飲料和某些藥物中，是世界上消費(fèi)量最大的精神活性物質(zhì)之一，機(jī)體吸收后廣泛分布于腦和身體其他部位。因此，咖啡因?qū)ι锕δ芎腿梭w健康的急慢性影響是基礎(chǔ)和臨床研究的重要課題。安鈉咖是臨床常用的一種中樞興奮藥，其發(fā)揮藥效作用的主要成分為咖啡因，但咖啡因難溶于水，而苯甲酸鈉易溶于水，故按1：1 比例配制以起到助溶作用，便于人體吸收[6]。在我國(guó)，安鈉咖屬于嚴(yán)格管制的精神類(lèi)藥品，原因在于其兼有另外一重身份：毒品，俗稱(chēng)“白粉”或“白面”，長(zhǎng)期濫用會(huì)對(duì)人體諸多器官、系統(tǒng)造成傷害，嚴(yán)重影響人體的健康。

目前，關(guān)于咖啡因?qū)W(xué)習(xí)、記憶功能的影響尚存在爭(zhēng)議。一些研究表明咖啡因?qū)Π柎暮Ｄ　⑴两鹕?、亨廷頓病等多種神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用，可以通過(guò)抗炎、抗氧化和抗凋亡等機(jī)制改善認(rèn)知缺損[7,8]。然而許多研究發(fā)現(xiàn)咖啡因?qū)е聦W(xué)習(xí)、記憶受損[9～15]。出生后第1 周接受咖啡因治療（1～9 mg/kg）的大鼠成年后空間操作性學(xué)習(xí)任務(wù)受損[9]。生后早期（PN2～6）接受咖啡因治療（PN2：20 mg/kg，PN3～6：15 mg/kg）的SD 大鼠成年后（PN35～37）在穿梭被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)中24 h 后的記憶保持力顯著降低[10]。母鼠在妊娠期（第4 d 開(kāi)始）服用含咖啡因的自來(lái)水（75 mg/L），子代大鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的24 h 記憶保持和八臂迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間學(xué)習(xí)記憶能力受損[11]。妊娠SD大鼠于第4～21 d 皮下注射咖啡因（20 mg/kg，2 次/日），其雄性子代飼養(yǎng)至4 月齡行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示學(xué)習(xí)記憶能力下降[12]。Urushihata 等[13]為評(píng)估咖啡因?qū)}趨化性學(xué)習(xí)的影響，將秀麗隱桿線蟲(chóng)置于不同濃度（0.01%、0.1%、0.3%、1.0%）的咖啡因與NaCl 混合液中，發(fā)現(xiàn)預(yù)先暴露于0.3%咖啡因的線蟲(chóng)表現(xiàn)出對(duì)鹽趨化性學(xué)習(xí)的抑制。Almosawi 等[14]將雄性BLC57 小鼠分為對(duì)照組、中劑量組和大劑量組，中、高劑量組小鼠分別按照20 mg/kg 和200 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)服用咖啡因，7 d 后通過(guò)Morris 水迷宮檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果表明中等劑量咖啡因增強(qiáng)記憶，而高劑量導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶受損。Sallaberry 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，成年雌性Wistar 大鼠在交配前15 d 開(kāi)始應(yīng)用咖啡因（低劑量：0.1 g/L；中劑量：0.3 g/L），其后代于21 d斷奶后飲用與母代相同劑量的咖啡因，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)顯示，低劑量咖啡因?qū)Υ菩院蟠洃洓](méi)有影響，然而中劑量咖啡因?qū)е麓菩院蟠L(zhǎng)期記憶受損。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Morris 水迷宮檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，小劑量安鈉咖灌胃對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響沒(méi)有差異，但大劑量安鈉咖灌胃不僅造成學(xué)習(xí)能力受損，而且記憶能力降低，表現(xiàn)為定位航行實(shí)驗(yàn)中大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)所在位置次數(shù)明顯減少，這與路海霞等[5]的研究結(jié)果大劑量安鈉咖對(duì)記憶能力沒(méi)有產(chǎn)生影響不同，造成這種差異的原因可能是由于安鈉咖的時(shí)間效應(yīng)，路海霞用20 d 制備安鈉咖吸食模型，本實(shí)驗(yàn)制備安鈉咖吸食模型為期60 d。

海馬是人類(lèi)的陳述性或顯性記憶以及動(dòng)物的空間/情境學(xué)習(xí)的關(guān)鍵腦區(qū)[16]，突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。動(dòng)物和人體的一些實(shí)驗(yàn)研究咖啡因?qū)ν挥|可塑性的影響，大鼠海馬腦片的初步數(shù)據(jù)表明，攝入咖啡因后長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）降低[17]；3 周內(nèi)服用咖啡因可減少動(dòng)物海馬體LTP 的誘導(dǎo)[18]；Hanajima 等[19]研究咖啡因?qū)θ祟?lèi)初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層可塑性的影響，發(fā)現(xiàn)咖啡因攝入降低了四脈沖經(jīng)顱刺激在顯著應(yīng)答者中誘導(dǎo)的LTP。樹(shù)突棘是神經(jīng)元樹(shù)突上的棘狀突起，是突觸形成的最主要部位，其形態(tài)和數(shù)量的變化都可以影響到突觸可塑性[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Golgi 染色檢測(cè)海馬CA1 區(qū)的樹(shù)突棘的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，A-LD 組大鼠樹(shù)突棘密度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但A-HD 組大鼠樹(shù)突棘密度明顯減少，表明大劑量吸食安鈉咖減少了突觸的數(shù)量，降低了海馬突觸可塑性。為證實(shí)吸食安鈉咖對(duì)突觸數(shù)量的影響，還通過(guò)透射電子顯微鏡和體視學(xué)方法檢測(cè)海馬CA1 區(qū)Nv 和Sv，與樹(shù)突棘密度結(jié)果一致，小劑量安鈉咖并沒(méi)有造成Nv 和Sv 的太大變化，但大劑量安鈉咖明顯減少Nv 和Sv。SYN 是位于突觸囊泡膜上的一種糖蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)軸、樹(shù)突的分化與生長(zhǎng)進(jìn)而影響突觸的結(jié)構(gòu)，其表達(dá)可以反映突觸的分布與密度；PSD95 是位于突觸后膜上的骨架蛋白，參與突觸連接和形成，維持突觸可塑性[21]。作為突觸可塑性的兩種標(biāo)志物，筆者通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)和Western blot 檢測(cè)海馬區(qū)二者的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，A-LD 組大鼠海馬兩種蛋白的表達(dá)都沒(méi)有差異，而AHD 組大鼠海馬兩種蛋白的表達(dá)都明顯降低。綜上所述，大劑量安鈉咖降低大鼠海馬突觸可塑性，結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析認(rèn)為大劑量安鈉咖通過(guò)降低海馬突觸可塑性進(jìn)而損傷學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)于大劑量安鈉咖降低海馬區(qū)突觸可塑性的機(jī)制尚未完全明確，可能與拮抗腺苷A2A受體有關(guān)。咖啡因是一種非選擇性腺苷A1和A2A受體拮抗劑，它對(duì)A2A受體親和力高于A1受體[22]，在海馬，選擇性A1受體拮抗劑促進(jìn)LTP[23]，而選擇性腺苷A2A受體拮抗劑減 弱LTP[24～26]。Sekino 等[27]和Kessey 等[28]發(fā)現(xiàn) 將特 異性腺苷受體拮抗劑直接應(yīng)用于海馬神經(jīng)元可防止破傷風(fēng)誘導(dǎo)的LTP。腺苷A2A受體與促進(jìn)睡眠密切相關(guān)，睡眠會(huì)加強(qiáng)大腦的神經(jīng)聯(lián)系即突觸，突觸的增加加強(qiáng)了大腦存儲(chǔ)記憶的能力[9]，而睡眠剝奪或缺乏睡眠作為生理應(yīng)激源會(huì)損害突觸可塑性，使神經(jīng)聯(lián)系達(dá)不到應(yīng)有的強(qiáng)度，進(jìn)而導(dǎo)致記憶存儲(chǔ)率較低?？Х纫驍z入會(huì)擾亂正常的睡眠-覺(jué)醒周期，誘導(dǎo)覺(jué)醒，因此大劑量安鈉咖可能通過(guò)A2A受體拮抗作用降低海馬突觸可塑性，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。