江磊 賈子普 羅芳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050)

手術(shù)的機(jī)械損傷可直接刺激外周的傷害性感受器，手術(shù)創(chuàng)傷也可引起術(shù)區(qū)炎癥反應(yīng)，間接刺激傷害性感受器，傷害性刺激逐級(jí)傳遞致大腦皮層感覺中樞，從而使大腦感知到疼痛〔1，2〕。術(shù)后疼痛又稱傷害性疼痛，是手術(shù)即刻發(fā)生的急性疼痛，主要表現(xiàn)是自發(fā)性疼痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏，是臨床最常見的急性疼痛類型〔3，4〕。術(shù)后疼痛影響患者循環(huán)、呼吸、消化及內(nèi)分泌等各系統(tǒng)功能，導(dǎo)致術(shù)后一系列并發(fā)癥，影響術(shù)后恢復(fù)。

氟比洛芬酯是一種具有靶向作用的新型非甾體類鎮(zhèn)痛脂質(zhì)微球〔5〕。氟比洛芬酯的載體是脂質(zhì)微球，可以使藥物更好地傳遞到疼痛部位發(fā)揮作用，具有良好的抗炎和鎮(zhèn)痛療效，具有用量小、不良反應(yīng)少、鎮(zhèn)痛效果好的優(yōu)點(diǎn)〔6〕。研究表明氟比洛芬酯可以有效抑制術(shù)后疼痛引起的應(yīng)激反應(yīng)，減少術(shù)后并發(fā)癥，促進(jìn)患者恢復(fù)〔7～9〕。已有研究報(bào)道氟比洛芬酯靜脈注射用于腹部、骨折、腫瘤手術(shù)患者術(shù)后鎮(zhèn)痛〔10～12〕。預(yù)先在切口局部浸潤氟比洛芬酯的術(shù)后鎮(zhèn)痛作用及其可能的機(jī)制目前仍未見報(bào)道。本研究利用大鼠切口痛模型，通過預(yù)先局部浸潤不同濃度氟比洛芬酯對(duì)術(shù)后鎮(zhèn)痛的影響，篩選出最適宜的濃度。利用適宜濃度氟比洛芬酯研究其對(duì)炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-6表達(dá)水平的影響，明確切口預(yù)先局部浸潤氟比洛芬酯的術(shù)后鎮(zhèn)痛作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，8周齡，由維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室籠養(yǎng)，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度保持在40%～60%，光照周期8∶00～20∶00。大鼠入室后分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1 w。本研究已獲得北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器和試劑 電子馮弗雷纖維絲測(cè)痛儀(Electronic von Frey anesthesiometer，IITC Inc)；麻醉機(jī)(Drager Fabius，德國Drager公司)；自制玻璃麻醉誘導(dǎo)箱；Gen5酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；CF16RX恒溫離心機(jī)(日本HITA-CHI公司)；光熱甩尾測(cè)痛儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：BW-YLS-12A)。氟比洛芬酯注射液(凱紛)購自北京泰德制藥有限公司提供。七氟烷、生理鹽水購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司；大鼠TNF-α、IL-1β、及IL-6試劑盒均購自美國R&D公司；Von Frey購自美國Stoelting公司；熱輻射刺激儀購自意大利Ugo公司；多聚甲醛固定液(G1101-500ML，Servicebio)；無水乙醇(100092683，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(10023418，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染液套裝(G1003，Servicebio)；中性樹膠(10004160，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3大鼠切口痛模型建立 參照Brennan等〔13〕的方法制備大鼠足底切口痛模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后置入麻醉箱中，麻醉箱一側(cè)接麻醉機(jī)，采用3%七氟烷麻醉誘導(dǎo)，待麻醉平穩(wěn)后將大鼠取出，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)鼻罩給予七氟烷繼續(xù)維持麻醉后切割大鼠左后足。從足跟近端0.5 cm處向趾部作一縱行切口，長度約1 cm，切開左后足的皮膚及筋膜，用眼科鑷輕輕挑起足底肌肉并作縱向切割，壓迫止血后用絲線縫合。手術(shù)后將大鼠置于避光、安靜、溫暖的環(huán)境下蘇醒，蘇醒后左后足無運(yùn)動(dòng)障礙，手術(shù)結(jié)束30 min后左后足不著地且有咬、舔現(xiàn)象為造模成功。

1.4最佳給藥濃度的篩選

1.4.1動(dòng)物分組 造模成功大鼠24只分為對(duì)照組(生理鹽水)、低濃度組(氟比洛芬酯5 mg/ml)、中濃度組(氟比洛芬酯7.5 mg/ml)及高濃度組(氟比洛芬酯10 mg/ml)，對(duì)照組給予0.5 ml生理鹽水，藥物組給予0.5 ml不同濃度氟比洛芬酯行預(yù)先切口局部浸潤。

1.4.2機(jī)械縮足閾值(PWT)測(cè)量 選用8根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增的(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14)馮弗雷纖毛機(jī)械刺激針(VFH)垂直刺激大鼠左后足底，從2.04開始，以探針輕微彎曲并持續(xù)2～3 s為準(zhǔn)，每次刺激間隔30 s，如大鼠出現(xiàn)快速撤足為陽性反應(yīng)。若反應(yīng)陰性，選用刺激強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增的相鄰VFH繼續(xù)刺激；若撤足反應(yīng)為陽性，則選用相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。以出現(xiàn)第1次陽性反應(yīng)前的陰性反應(yīng)作為起點(diǎn)，選擇包括該點(diǎn)在內(nèi)的6次連續(xù)刺激，50%PWT=10(Xf +κδ)/104 (Xf：序列中最后一根VFH的對(duì)數(shù)值；κ：根據(jù)測(cè)量所得序列查表后得到的值；δ=0.224)。

1.4.3累計(jì)疼痛評(píng)分(CPS) 將大鼠置于透明有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)30 min，待大鼠停止探覓行為且恢復(fù)安靜后，開始進(jìn)行CPS測(cè)量。測(cè)量方法為觀察其術(shù)側(cè)后肢著地和負(fù)重的情況，術(shù)側(cè)后肢著地且被壓迫致發(fā)白表示負(fù)重；術(shù)側(cè)后肢因?yàn)樘弁炊N起不著地計(jì)2分；術(shù)側(cè)后肢著地但不負(fù)重計(jì)1分；術(shù)側(cè)后肢著地并負(fù)重計(jì)0 分。每5 min觀察1次大鼠的行為變化，每次觀察1 min，在觀察的1 min內(nèi)大鼠最常采用的站立姿勢(shì)作為疼痛評(píng)分記錄，共觀察1 h(即12次)，將12次疼痛評(píng)分的總和計(jì)為該時(shí)點(diǎn)的CPS。

1.4.4篩選最佳的氟比洛芬酯濃度 于造模前(T0)、造模后2 h(T2)、6 h(T6)、12 h(T12)、24 h(T24)及48 h(T48)行大鼠切口痛行為學(xué)和切口紅腫、滲血、不愈合等安全性指標(biāo)觀察，篩選出最佳藥物濃度。

1.5最佳給藥濃度下氟比洛芬酯對(duì)切口痛大鼠的干預(yù)。

1.5.1動(dòng)物分組 大鼠36只隨機(jī)等分為對(duì)照組(生理鹽水組)和藥物組(最佳濃度氟比洛芬酯組)，分別預(yù)先切口局部浸潤生理鹽水或篩選出最佳濃度的氟比洛芬酯各0.5 ml后建立切口痛模型。對(duì)照組給予0.5 ml生理鹽水，藥物組給予0.5 ml最佳給藥濃度的氟比洛芬酯行預(yù)先切口局部浸潤。

1.5.2PWT和CPS測(cè)定 于T0、T2、T6、T12、T24及T48時(shí)分別按照1.4.2和1.4.3的方法進(jìn)行PWT和CPS測(cè)定，比較對(duì)照組和藥物組的疼痛指數(shù)。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 于T0、T2、T6、T12、T24及T48時(shí)，3%水合氯醛腹腔注射，將大鼠麻醉后，迅速用乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝采血管采集心房血液2 ml，將取得的血液放入離心機(jī)中以3 000 r/min離心15 min，取上清液即血漿放入EP管中，參照說明書檢測(cè)血漿中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1氟比洛芬酯最佳給藥濃度的篩選

2.1.1各組PWT比較 T0時(shí)各組PWT值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后，各組各時(shí)間點(diǎn)PWT均低于T0，尤以T2下降明顯，隨后各組PWT呈上升趨勢(shì)，直至T48仍低于T0。低、中、高濃度組PWT值于T12、T24、及T48時(shí)明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.1.2各組CPS比較 T0時(shí)各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。模型建立后各組CPS迅速上升，尤以T2上升明顯，隨后各組CPS呈下降趨勢(shì)，直至T48仍高于T0。T12、T24及T48時(shí)低、中、高濃度組CPS明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

2.1.3副作用 低、中、高濃度組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)未見傷口腫脹、滲血、感染、不愈合等副作用。

2.1.4最佳濃度 按照最低有效的原則，本研究中5 mg/ml氟比洛芬酯為最佳的濃度。

2.2對(duì)切口痛大鼠的干預(yù)作用及對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響

2.2.1兩組PWT和CPS比較 造模后，兩組PWT值明顯下降，尤其以T2下降明顯，隨后逐漸上升，但直至T48仍低于T0。與對(duì)照組比較，藥物組T12、T24及T48時(shí)PWT值明顯升高(P<0.05)。建模后，兩組的CPS值迅速上升，尤其以T2升高明顯，隨后逐漸下降，但直至T48仍高于T0。與對(duì)照組比較，藥物組T12、T24及T48時(shí)CPS明顯降低(P<0.05)，見表3。

2.2.2兩組IL-1β、IL-6、及TNF-α水平比較 與T0相比，對(duì)照組和藥物組術(shù)后T2、T6、T12、T24及T48時(shí)IL-1β、IL-6、及TNF-α的表達(dá)均有所增高；與對(duì)照組相比，T2和T6時(shí)藥物組IL-1β和IL-6水平明顯降低(P<0.05)，見表4。

表1 4組疼痛行為學(xué)PWT比較

表2 4組疼痛行為學(xué)CPS比較分，n=6)

表3 兩組PWT和CPS比較

表4 兩組IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較值)

3 討 論

Brennan等〔13〕首次建立大鼠切口痛模型，證明了術(shù)后術(shù)側(cè)后爪能表現(xiàn)出明顯的自發(fā)性疼痛行為、觸誘發(fā)痛、機(jī)械性痛覺過敏及熱痛覺過敏。該模型術(shù)后0.5 h出現(xiàn)明顯的痛覺過敏，2 h達(dá)到峰值，且可持續(xù)到術(shù)后4～7 d〔14〕。本研究與Brennan等〔13〕報(bào)道一致，表明造模成功。不同濃度藥物組預(yù)先切口局部浸潤不同濃度氟比洛芬酯后造模，各藥物組造模后疼痛程度也顯著增加，同樣證實(shí)造模成功。本研究結(jié)果證實(shí)，預(yù)先切口局部浸潤各濃度氟比洛芬酯均有明顯減輕大鼠機(jī)械性痛覺過敏、防治切口疼痛的作用。本研究結(jié)果還提示，局部浸潤氟比洛芬酯對(duì)于術(shù)后切口痛的早期鎮(zhèn)痛效果欠佳，12 h后局部浸潤氟比洛芬酯的術(shù)后鎮(zhèn)痛效果才顯著優(yōu)于生理鹽水；而且，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然術(shù)后48 h藥物組的疼痛程度優(yōu)于對(duì)照組，但各藥物組造模后48 h與基礎(chǔ)值比較，疼痛程度仍未恢復(fù)到造模前，說明術(shù)后疼痛仍未完全控制，因此，氟比洛芬酯盡管對(duì)于切口疼痛具有一定的防治作用，但療效有限，今后可考慮術(shù)后配合其他多模式鎮(zhèn)痛方法，如聯(lián)合應(yīng)用長效的局部麻醉藥，以改善術(shù)后疼痛的管理水平。

氟比洛芬酯鎮(zhèn)痛作用的主要機(jī)制是抑制環(huán)氧化酶(COX)生成，從而阻斷前列腺素(PGs)的生物合成，減少損傷部位的致痛物質(zhì)和炎癥介質(zhì)的生成和釋放。氟比洛芬酯脂質(zhì)微球的優(yōu)勢(shì)有3個(gè)方面，(1)靶向性：脂質(zhì)微球能使氟比洛芬酯在血供較為豐富的手術(shù)切口及炎癥部位聚集，繼而水解為氟比洛芬，從而增強(qiáng)藥效；(2)緩釋性：脂質(zhì)微球有助于控制氟比洛芬酯的釋放，使藥效持續(xù)時(shí)間更長；(3)轉(zhuǎn)運(yùn)性：脂質(zhì)微球使氟比洛芬酯易于跨越細(xì)胞膜，從而促進(jìn)其藥物的吸收，縮短起效時(shí)間〔15〕。目前，氟比洛芬酯靜脈給藥、作為一種靶向鎮(zhèn)痛作用的制劑通過上述機(jī)制發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先切口局部浸潤氟比洛芬酯達(dá)到了較好的術(shù)后鎮(zhèn)痛效果，證實(shí)了局部應(yīng)用氟比洛芬酯即使很小的劑量即有顯著的鎮(zhèn)痛作用，為臨床上合理用藥提供良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用局部浸潤氟比洛芬酯脂質(zhì)微球的給藥方法，氟比洛芬酯可直達(dá)患處，從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛作用，理論上可能較靜脈應(yīng)用氟比洛芬酯脂質(zhì)微球用量少、病灶局部藥物濃度高、效果更直接，有望成為一種安全有效的術(shù)后鎮(zhèn)痛手段。

組織損傷后局部釋放大量致痛物質(zhì)，同時(shí)術(shù)區(qū)出現(xiàn)無菌性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致急性疼痛及痛覺過敏〔16，17〕。手術(shù)創(chuàng)傷等傷害性刺激可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等釋放。IL-1β和IL-6是誘導(dǎo)全身炎癥如急性期反應(yīng)的主要促炎細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等合成，正常情況下人體血清中含量較低，而機(jī)體存在炎癥時(shí)血清中IL-1β及IL-6水平明顯升高〔18〕。IL-1β和IL-6主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞引起通透性增加，進(jìn)而引起大量炎癥細(xì)胞滲出，導(dǎo)致明顯的外周痛覺過敏。前期研究表明在大鼠切口痛模型中，IL-1β表達(dá)水平升高〔19〕。先前研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)創(chuàng)傷后患者出現(xiàn)血清IL-6水平升高，因此IL-6被認(rèn)為是反映應(yīng)激程度的敏感指標(biāo)〔20〕。IL-6對(duì)機(jī)體手術(shù)創(chuàng)傷刺激和感染起重要調(diào)節(jié)作用，在手術(shù)創(chuàng)傷局部大量產(chǎn)生并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是急性期炎癥細(xì)胞聚集的主要因素，被認(rèn)為與術(shù)后疼痛程度密切相關(guān)〔21，22〕。這些細(xì)胞因子可以通過直接或間接作用于傷害性感覺神經(jīng)元上的受體，激活神經(jīng)元內(nèi)的p38絲裂酶原活化蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C等多種復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低周圍神經(jīng)元的興奮閾值，產(chǎn)生外周敏化，使得低強(qiáng)度的閾下刺激也可導(dǎo)致疼痛。本研究結(jié)果提示氟比洛芬酯有可能通過降低IL-1β和IL-6起到術(shù)后鎮(zhèn)痛的作用。本研究存在以下局限性。首先，本研究僅觀察到術(shù)后48 h的疼痛變化，切口痛模型術(shù)后疼痛可持續(xù)到術(shù)后4～7 d，今后應(yīng)進(jìn)一步延長觀察的時(shí)間。目前，術(shù)后疼痛機(jī)制主要由中樞敏化和外周敏化所致，前期研究表明外周神經(jīng)及組織損傷后將導(dǎo)致前列腺素、緩激肽、IL-1β、IL-6及TNF-α等升高，尤其是炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等對(duì)傷害感受器致敏，導(dǎo)致明顯的外周痛覺過敏〔23〕。前期研究報(bào)道，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥介質(zhì)在不同的動(dòng)物模型中證明能夠提高痛覺過敏癥狀〔24〕。本研究僅探討了IL-1β、IL-6及TNF-α這3種炎癥細(xì)胞因子的變化，今后，有待開展深入的研究探討其他可能涉及的鎮(zhèn)痛防治作用機(jī)制。最后，還需要進(jìn)一步研究該技術(shù)的具體實(shí)施細(xì)則，如氟比洛芬酯理想的給藥時(shí)機(jī)、給藥方式等。

大鼠切口痛模型可獲得應(yīng)用于人類急性疼痛模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此，本研究結(jié)果有望為減輕患者術(shù)后疼痛、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)提供新技術(shù)，為臨床術(shù)后鎮(zhèn)痛提供合理用藥臨床依據(jù)。